Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico
2 de maio de 2022
Este protocolo fornece um método de isolamento de DNA simples e econômico para a análise de alterações da microbiota intestinal murina durante o desenvolvimento de doenças autoimunes.
O método de isolamento de DNA proposto pode servir para estudar a dinâmica da microbiota intestinal em modelos de camundongos com doenças autoimunes. Um método mais versátil, econômico e eficiente é proposto para obter DNA de amostras fecais que são comparáveis aos kits comercialmente disponíveis. Para começar, tire cada rato individualmente de sua gaiola, colete uma pelota fecal diretamente do ânus e armazene-a a menos 80 graus Celsius até ser processada.
Processe as amostras com pinças, tubos e luvas estéreis e limpos. Adicione um pellet congelado a um tubo de tampa de rosca pré-pesado de dois mililitros e registre o peso fecal em gramas, que deve estar entre 0,02 a 0,05 gramas por pellet fecal. Adicione ao pellet uma fina camada de contas de vidro de 0,1 milímetro, 500 microlitros de tampão de lise e 200 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 20%.
Bead bateu o tubo por quatro minutos em um homogeneizador, seguido por três a cinco minutos de vórtice. Centrifugar os tubos por um curto período de tempo para eliminar as bolhas e espuma. Para extrair DNA das amostras de microbiota, transfira 350 microlitros de sobrenadante de amostra para um novo tubo de tampa de encaixe de 1,5 mililitros, sem detritos.
Adicione 500 microlitros de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, na proporção de 25:24:1, e o vórtice durante um minuto. Após a centrifugação, transfira 180 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de tampa de encaixe de 1,5 mililitro. Adicione 180 microlitros de clorofórmio, inverta e misture.
A partir disso, transfira 180 microlitros da fase aquosa para um novo tubo de encaixe. Em um armário de biossegurança, adicione 180 microlitros de isopropanol frio e 36 microlitros de acetato de amônio cinco molares. Inverta-o algumas vezes para misturar e coloque o tubo no gelo por 20 minutos.
Descarte o sobrenadante, seguido de lavar os pellets várias vezes com 500 microlitros de etanol a 70% frio. Descarte o sobrenadante e seque o tubo de cabeça para baixo em papel de seda por 20 minutos, até que o pellet fique claro. Suspenda o pellet em 50 microlitros de água de grau molecular e aqueça o líquido a 37 graus Celsius por 10 minutos para dissolver completamente grandes pellets de DNA.
Após o aquecimento, centrifugar esses tubos a 3, 400 vezes G por um minuto para recuperar as gotículas de condensação da tampa. Meça a concentração e obtenha a relação 260/280 usando um espectrofotômetro. Uma proporção para DNA de boa qualidade é geralmente entre 1,8 e dois.
Centrifugar as amostras preparadas a 600 vezes G durante um minuto à temperatura ambiente, antes de congelar a menos 80 graus Celsius durante 24 horas. Em seguida, envie 20 microlitros de amostras com concentrações que variam de um a 50 nanogramas por microlitro para o Argonne National Laboratory para sequenciamento. A estirpe de ratinho sem o recetor CX3CR1 tem uma composição de microbiota intestinal diferente em comparação com ratinhos do tipo selvagem MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, apresenta diferenças significativas em certos géneros, relevantes para bactérias potencialmente patogénicas, como as do filo Proteobacteria.
Tenha cuidado com a contaminação da amostra. Precisa ser estéril. Além disso, é importante pipetar com precisão ao transferir o sobrenadante em um novo tubo.
Este método é adequado para análises moleculares, como PCR, digestão de enzimas de restrição ou construção de bibliotecas genômicas. No lúpus, provamos uma forte relação entre a microbiota intestinal e a progressão do lúpus.
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Visão Geral
Este protocolo fornece um método simples e econômico de isolamento de DNA para a análise de alterações na microbiota intestinal murina durante o desenvolvimento de doenças autoimunes. O método foi desenvolvido para estudar a dinâmica da microbiota intestinal em modelos murinos de doenças autoimunes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microbiologia
- Autoimunidade
Antecedentes
- Compreender a microbiota intestinal é fundamental na pesquisa de doenças autoimunes.
- Os métodos atuais de isolamento de DNA podem ser caros e complexos.
- Este estudo propõe uma alternativa mais eficiente e economicamente viável.
- Amostras fecais são utilizadas para analisar alterações na microbiota.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para extração de DNA de amostras fecais.
- Facilitar o estudo da microbiota intestinal em modelos de doenças autoimunes.
- Comparar a eficiência do novo método com kits comercialmente disponíveis.
Métodos Utilizados
- Coleta individual de pelotas fecais de camundongos.
- Armazenamento das amostras a -80 graus Celsius.
- Uso de ferramentas estéreis para o processamento das amostras.
- Preparação das amostras com tampão de lise e esferas de vidro.
Resultados Principais
- O método proposto produz DNA de qualidade comparável à dos kits comerciais.
- É econômico e eficiente para a análise da microbiota.
- Facilita pesquisas futuras sobre os mecanismos das doenças autoimunes.
Conclusões
- Este método de isolamento de DNA é uma ferramenta valiosa para pesquisadores.
- Ele apoia a investigação da microbiota intestinal em contextos de doenças.
- Incentiva pesquisas mais acessíveis na área de autoimunidade.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise confiável da dinâmica da microbiota intestinal em modelos de doenças autoimunes é fundamental para compreender as contribuições ambientais e genéticas ao desenvolvimento da doença. Este protocolo econômico de isolamento de DNA permite a extração escalonável e reprodutível de DNA microbiano de amostras fecais murinas, apoiando estudos de microbioma de alto rendimento em pesquisas pré-clínicas. O método aumenta a confiança preditiva na associação entre alterações da microbiota e fenótipos autoimunes, orientando estratégias de descoberta precoce e tradução clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação das interações entre o microbiota e o sistema imunológico em modelos de camundongos relevantes para doenças.
- Apoia a validação funcional de vias candidatas influenciadas pela composição microbiana intestinal.
- Facilita a redução mecanicista de riscos ao associar alterações microbianas à progressão autoimune.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece amostras padronizadas e reprodutíveis de DNA para sequenciamento e ensaios moleculares subsequentes.
- Garante DNA quantitativo e de alta qualidade adequado para fluxos de trabalho de PCR e sequenciamento de nova geração.
- Permite o processamento escalonável de amostras para estudos comparativos de microbiomas em coortes experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha o perfil do microbiota pré-clínico com o progresso da doença e os esforços de descoberta de biomarcadores.
- Apoia a continuidade dos achados na fase de descoberta até a validação translacional em modelos autoimunes.
- Reduz a ambiguidade biológica ao associar fatores ambientais desencadeantes aos fenótipos da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de isolamento de DNA insere-se na transição entre a fase inicial de descoberta e a pré-clínica, permitindo análises robustas do microbioma em modelos murinos predispostos ao lúpus e apoiando a identificação de compostos promissores e estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre a modulação imunológica mediada pela microbiota em doenças autoimunes.
- Triagem: Fornece saídas de DNA reprodutíveis e quantitativas para o perfilhamento de microbiomas baseado em sequenciamento.
- Análises: Fornece insumos de alta qualidade para comparação estatística de alterações na comunidade microbiana entre genótipos ou tratamentos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas pré-clínicas sobre microbioma ao desenvolvimento potencial de biomarcadores em doenças autoimunes.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo escalável e economicamente eficiente, adaptável a diversos modelos murinos e delineamentos experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nas associações entre microbiota e doenças e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a extração de DNA, melhorando a reprodutibilidade e a escalabilidade entre estudos.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir ao esclarecer as contribuições do microbioma para mecanismos da doença.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de intervenções moduladoras do microbioma em pipelines de doenças autoimunes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência técnica em manipulação estéril de amostras e fluxos de trabalho de biologia molecular.
- Necessita de acesso a homogeneizadores, centrífugas e espectrofotômetros para controle de qualidade.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para minimizar contaminação e variabilidade.
- Adaptável a diversos modelos murinos, mas pode exigir otimização para diferentes tipos de amostras.
- Depende de pipetagem precisa e técnica estéril para garantir a integridade dos dados.
