Análise quantitativa das propriedades viscoelásticas das hemácias utilizando pinças ópticas e microscopia desfocagem

Esta metodologia permite explorar o comportamento mecânico dos eritrócitos, caracterizando seus parâmetros viscoelásticos e características vítreas moles para diversas condições fisiológicas e patológicas. Nosso método baseado em célula única verifica referências de vídeo usando os valores de metal para o fator de forma que relaciona forças e deslocamentos, as tensões e raspagens na superfície do eritrócito. Comece despejando graxa de silicone sobre a superfície do anel de borracha de uma forma que cubra todo o perímetro.

Em seguida, coloque o anel de borracha na lamínula com o lado da graxa voltado para a lamínula. Aguarde cinco minutos para a fixação adequada e os suportes de amostra estarão prontos para receber a cultura celular. Em seguida, com a solução de células previamente preparada seguindo o protocolo escrito, semeie as células no porta-amostras.

Adicionar 0,2 microlitros de uma solução de esfera de poliestireno a 10% volume por volume à amostra. Coloque a segunda tampa acima do anel de borracha. Feche a configuração e conclua a preparação da amostra.

Finalmente, mova toda a amostra para o microscópio. Para começar com a experimentação, use o sistema OT, prenda a esfera com o laser OT e, em seguida, fixe-a à lamínula, perto da célula. Em seguida, prenda outra esfera e repita o mesmo procedimento de fixação pressionando a esfera contra a superfície celular, perto da superfície superior e perto da borda da célula.

Adicione uma função senoidal de amplitude e frequências variáveis. Em seguida, pressione o botão start, usando o estágio piezoelétrico para permitir o deslocamento piezoelétrico. Manter a esfera de hemácias na armadilha e submeter a amostra a um ciclo de movimentos utilizando a função senoidal previamente definida.

Para análise, abra o software ImageJ e importe todo o filme obtido durante os movimentos senoidais. Clique em ajustar e, em seguida, selecione o limite da opção. Ajuste o limite com as duas barras de rolagem e selecione a esfera de referência clicando no arquivo, seguido de retângulo.

Em seguida, na aba analisar, clique em definir medidas" e selecione a opção "centro de massa". Clique novamente na guia analisar e selecione analisar partículas. Uma nova janela contendo uma tabela com coordenadas xy para o centro da massa aparecerá.

Repita o procedimento para a outra esfera fixada à superfície do eritrócito. Abra o software de análise e importe os arquivos txt obtidos anteriormente. Gere um gráfico com os centros de massa no eixo y e o tempo no eixo x.

Plote os resultados em um gráfico usando o eixo x para constante de perda, denotado por K prime duplo, e o eixo y para constante de armazenamento, denotado por K prime. Primeiro, para aquisição de vídeo, mova o estágio piezoelétrico na direção xy, usando o software para procurar uma célula isolada presa à lamínula. Aprisionar e fixar uma esfera de poliestireno de diâmetro conhecido à superfície do eritrócito.

Em seguida, usando o estágio piezoelétrico, mova o talão preso à superfície do eritrócito para deformar a célula e, em seguida, prenda o talão ao lábio de cobertura. Agora, altere a posição do eixo z para localizar a imagem focada. Depois de corrigir a posição, use o software da câmera para criar um filme de toda a célula.

Em seguida, mova a posição do eixo z dois micrômetros para baixo ou para cima para obter uma imagem desfocada para a célula escolhida. Finalmente, sem alterar a posição do eixo z, procure uma região sem células para repetir o mesmo procedimento e crie um filme do plano de fundo da imagem. Para aquisição de imagens de contraste, primeiro encontre o valor de N zero, clique no ícone de seleção de polígono, depois clique na guia analisar e selecione a medida.

Em seguida, use a equação de contraste para determinar N imagem menos N zero, e execute isso selecionando matemática "sob processo, seguido de subtrair. Posteriormente, divida o resultado por N zero menos B. Por fim, encontre o contraste para as imagens focadas e desfocadas. Agora, use a transformada de Hartley para obter a espessura da hemácia.

No ImageJ, clique em processo, seguido pelas opções FFT e FFT e, em seguida, escolha FHT. Em seguida, realize a transformação inversa FHT selecionando o processo, seguido de FFT e FFT. Use a imagem resultante para obter o perfil de altura.

Depois de encontrar a imagem que contém o perfil de altura RBC, use o contraste desfocado de dois micrômetros para criar um conjunto de duas imagens no ImageJ. Para localizar o fator forma, use uma macro personalizada do ImageJ para analisar a pilha. A macro fornecerá uma tabela com a posição da borda, o perímetro, o inverso do perímetro e uma imagem da célula analisada.

Verifique se as bordas desta imagem são semelhantes às bordas da figura de referência. Caso contrário, repita o procedimento e use a soma do inverso do perímetro para localizar o fator de forma. Comece organizando os dados experimentais em uma tabela.

Crie uma nova tabela no software de análise clicando na guia arquivo. Determine 10 colunas diferentes para os parâmetros. Para traçar a curva G prime e G double prime no software de análise, utilize os dados da tabela anterior e clique no botão "plot".

Para obter os parâmetros Gamma e GM, clique na guia de ajuste de curva e selecione fit1" para abrir uma nova janela. Selecione o quadrado, clique no botão definir e digite a equação. Clique no botão "ok" em ambas as janelas, e o encaixe aparecerá.

Em seguida, crie duas outras parcelas, ou seja, G prime e G double prime em função do ômega. Coloque as barras de erro somente no eixo y, conforme demonstrado anteriormente. Repita o procedimento de ajuste da curva, selecione a opção G".

Clique em definição de curva" em ajuste geral e, em seguida, escreva a equação em questão. Finalmente, clique em ok, e um ajuste de curva aparecerá junto com os valores para Alpha e G zero. Novamente, execute outro procedimento de ajuste de curva.

Selecione a opção G, clique em definição de curva" em ajuste geral e escreva a equação em questão. Por fim, clique em ok, e um ajuste de curva aparecerá. A figura mostra a constante elástica de armazenamento em função da constante elástica de perda.

A dependência linear observada demonstra que a superfície das hemácias pode ser considerada um material vítreo macio. Aplicando os valores para o fator de forma celular geral e espessura da superfície do eritrócito, os valores para o expoente Alpha podem ser determinados. Esta técnica pode fornecer a base para novos métodos diagnósticos que correlacionam alterações nas propriedades viscoelásticas dos eritrócitos com modificações no fluxo sanguíneo de indivíduos com diferentes patologias.