Name: Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a criar micropadrões de proteína em hidrogéis macios usando PDMS e impressão por microcontato. Este método simplificado em uma etapa permite estudar forças de tração celular em agrupamentos de células com formas definidas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Paul Barbone, do Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Boston, por discussões úteis e assistência com a análise de dados. Este estudo foi apoiado pela bolsa NSF CMMI-1910401.

<ol><li>Pelham, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), 55172(2013).</li>
<li>Bhadriraju, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ROCK+by+RhoA+is+regulated+by+cell+adhesion%2C+shape%2C+and+cytoskeletal+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension.</a> Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).</li>
<li>Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+F-actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the F-actin cytoskeleton.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).</li>
<li>Ganz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+forces+exerted+through+N-cadherin+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Traction forces exerted through N-cadherin contacts.</a> Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).</li>
<li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cardiomyocyte+mechanosensing+by+crosstalk+between+integrins+and+hyaluronic+acid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors.</a> Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).</li>
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<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS One. 7 (2), 32572(2012).</li>
<li>Lavoie, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+actin-myosin-actin+connectivity+in+airway+smooth+muscle+as+a+treatment+for+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+traction+stresses+in+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying traction stresses in adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).</li>
<li>Halliday, N. L., Tomasek, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+extracellular+matrix+influence+fibronectin+fibril+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro.</a> Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).</li>
<li>Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+rubber+substrata%3A+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li>
<li>Aratyn-Schaus, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+complaint+matrices+for+quantifying+cellular+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173(2010).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+silicone+elastomeric+post+arrays+for+measuring+traction+forces+of+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).</li>
<li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li>
<li>Polio, S. R., Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li>
<li>Polio, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+control+of+multiple+cell+adhesion+molecules+for+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy.</a> Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Maloney, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+finite+thickness+and+stiffness+on+cellular+adhesion-induced+deformation+of+compliant+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review.+E%2C+Statistical%2C+Nonlinear%2C+and+Soft+Matter+Physics%22%5BJournal%5D)">Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata.</a> Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923(2008).</li>
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<li>Ruiz, S. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing%3A+A+tool+to+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing: A tool to pattern.</a> Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).</li>
<li>Rottmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity%2C+osteogenic+differentiation+and+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science-Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension.</a> Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).</li>
<li>Desai, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+spatial+segregation+of+integrin+subtypes+by+patterned+multicomponent+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces.</a> Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).</li>
<li>Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+double+casting+method+enabled+by+plasma+treatment+and+alcohol+passivation%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).</li>
<li>Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Um método aprimorado de padronização indireta de hidrogéis PAA é descrito neste artigo. Essa abordagem baseia-se em métodos que já foram utilizados anteriormente 20,35,36,37,38,39,40,41,42. A principal mudança é que os sel...

A maioria dos fenótipos celulares exercem forças de tração em seu ambiente. Essas forças de tração são geradas pelo citoesqueleto contractil de uma célula, que é uma rede de actina e miosina, e outros biopolímeros filamentosos e proteínas de crosslinking 1,2,3,4. As forças geradas dentro da célula podem ser transmitidas para o ambiente extracelular ou células adjacentes, principalmente através de proteínas transmembranas, como integrins e cadherinas, respectivamente 5,6. Como uma célula se espalha ou contrai - e as magnitudes das forças de tração associadas a esses movimentos - é o resultado de uma conversa íntima com seu ambiente, que depende em grande parte do tipo e quantidade de proteína presente na matriz extracelular (ECM)7,8 e da rigidez do ECM. De fato, a microscopia de força de tração tornou-se uma ferramenta inestimável para entender a resposta celular a estímulos locais, como rigidez de substrato, tensões mecânicas impostas e cepas, ou contato com outras células. Essas informações são diretamente relevantes para a compreensão de doenças como câncer e asma 9,10,11,12.
Um sistema que pode ser usado para medir a deformação induzida pela força de um substrato de propriedades materiais conhecidas é necessário para calcular forças de tração. Essas mudanças devem ser acompanhadas ao longo do tempo, exigindo técnicas de imagem e processamento de imagens. Um dos primeiros métodos utilizados para determinar as forças de tração celular foi a observação e análise da contração de hidrogéis de colágeno semeados com células, embora este método fosse apenas semiquantitativo13. Outro método mais refinado foi medir as forças de tração exercidas por células únicas, determinando as forças resultantes da deformação de uma fina folha de silicone14. Posteriormente, foram desenvolvidas técnicas de medição mais quantitativas, e esses métodos também permitiram o uso de hidrogéis macios, como poliacrilamida (PAA)12,15,16. Ao utilizar esses materiais macios, as forças de tração poderiam ser determinadas a partir do deslocamento induzido pela força de contas deslocadas aleatoriamente embutidas no hidrogel e nas propriedades mecânicas do gel16,17. Outro avanço veio com o desenvolvimento de matrizes de micropostos feitas de polidimimetilsiloxano macio (PDMS) para que sua deflexão pudesse ser medida e convertida em força usando a teoria do feixe18.
Finalmente, métodos para micropatterning hidrogéis macios foram desenvolvidos à medida que essas abordagens permitem o controle das áreas de contato para adesão celular. Medindo a deformação do micropattern dentro da área de contato de uma célula, as forças de tração poderiam facilmente ser calculadas porque uma imagem de referência livre de força não é necessária19. Este método tem sido amplamente adotado, pois permite a padronização indireta de uma matriz regular de pontos de adesão de proteína fluorescente do tamanho de mícrons e discretos em géis PAA para a medição das forças de tração celular20. Para calcular essas forças, um algoritmo de processamento de imagem, que pode rastrear os movimentos de cada ponto micropatterado sem exigir a entrada do usuário, foi desenvolvido21.
Embora este método seja simples para criar grades inteiras de padrões de pontos, é mais complicado quando padrões de manchas isoladas (ou ilhas) de pontos são desejados. Ilhas micropatteradas são úteis quando o controle da forma, e até certo ponto do tamanho, de aglomerados de células é necessário. Para criar essas ilhas, o método acima mencionado de impressão de microcontatos requer dois passos distintos: i) usar um selo PDMS para criar um padrão de alta fidelidade de pontos em um deslizamento de cobertura, e então ii) usando um segundo selo PDMS diferente para remover a maioria desses pontos, deixando para trás ilhas isoladas de pontos21. A dificuldade em criar ilhas com este método original é agravada pelo fato de que fazer padrões de grade consistentes na primeira etapa do processo é desafiador por si só. Os selos de microimpressão são compostos por uma matriz de micropostos circulares, do qual o diâmetro corresponde ao tamanho do ponto desejado. Esses selos são então revestidos com uma camada uniforme de proteína e, em seguida, estampados com uma quantidade precisa de pressão sobre tampas tratadas para criar o padrão desejado. Por um lado, aplicar muita pressão ao carimbo pode resultar em transferência de proteínas irregulares e má fidelidade de padrões devido à fivela de pilares ou flacidez entre pilares, levando ao contato com o vidro. Por outro lado, aplicar pouca pressão resulta em pouca ou nenhuma transferência de proteínas e má fidelidade padrão. Por essas razões, um processo de transferência que pode ser usado para criar consistentemente micropatters de alta qualidade de ilhas isoladas de pontos em apenas um passo é desejado.
Aqui, um método é descrito para o micropatterning indireto de ilhas de proteína fluorescente do tamanho de mícrons pontos de adesão em um gel PAA que é mais consistente e versátil do que os métodos previamente desenvolvidos. Considerando que os métodos de micropatterning indiretos mais antigos dependem da transferência de padrões proteicos de um selo PDMS para um substrato intermediário, o método introduzido aqui usa selos PDMS em vez disso como um vaso para remoção de proteínas, não adição. Isso é feito primeiro alterando fundamentalmente a estrutura dos selos PDMS utilizados. Em vez de fazer selos compostos de um padrão de pilares circulares espaçados uniformemente, os selos são compostos por um padrão de buracos circulares espaçados uniformemente neste método.
Com esta nova estrutura, a superfície desses selos PDMS pode então ser tratada com glutaraldeído como descrito anteriormente 20,29,30, tornando o selo capaz de se unir covalentemente com proteína. Quando usados em uma mancha de vidro revestida uniformemente com proteína fluorescente, esses selos PDMS tratados com glutaraldeído são usados para remover a maior parte da proteína na superfície do deslizamento de cobertura, deixando para trás apenas o padrão desejado de pontos pré-determinados pela localização de orifícios do tamanho de mícrons no selo. Essa mudança aumenta a taxa de sucesso para gerar padrões compostos por uma grade quase contínua de pontos e para a criação de ilhas isoladas de pontos em apenas um passo.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil)trimetoxissilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#281778</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>4 x 4 pol 0,060 Quartzo LR Chrome Photomask</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>N/A</td><td>Máscara personalizada</td></tr><tr><td>6 placas de poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>#07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>#A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Acrilamida, 40%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A4058</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>#A20000</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Aminonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>#BP179-25</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>#PR-V3141</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Greenfield Global</td><td>#111000200C1GL</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de Vidro, 25 mm redondas</td><td>Fisher Scientifc</td><td>#12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de Vidro, 30 mm redondas</td><td>Warner</td><td>#64-1499</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA-R2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>#C10600-10B</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma</td><td>Valley Biomedical</td><td>#HP1051P</td><td>Usado para isolar fibronectina</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, 1.0 N</td><td>Millipore Sigma</td><td>#1.09057</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Wayne Rasband</td><td>#1.53n</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de pratos de lamínula intercambiáveis</td><td>Bioptechs</td><td>#190310-35</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>#06-666-11C</td><td></td></tr><tr><td>Máscara Alinger</td><td>Karl Suss</td><td>#MA6</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 2021</td><td>Mathworks</td><td>#R2021a</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Basic Molecular Devices</td><td>#v7.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>Éster N-hidroxisuccinimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#130672-5G</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Mancha de Células Vivas</td><td>Thermo Fisher</td><td>#R37605</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido Olympus IX2-ZDC</td><td>Olympus</td><td>#IX81</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de Dessalinização PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>#52-1308-00</td><td></td></tr><tr><td>Capuz Spinner Fotorresistente</td><td>Headway Research</td><td>#PWM32</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de Plasma</td><td>Harrick</td><td>#PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Etcher</td><td>TePla</td><td>#M4L</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Luz Prior Lumen 200Pro</td><td>Prior Scientific</td><td></td>#L200 <td></td></tr><tr><td>Wafers de Silício, Wafer Universitário de 100 mm#</td><td></td><td>809</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2005</td><td>Kayaku Materiais Avançados Inc.</td><td></td><td></td>#NC9463827</tr><tr><td>Desenvolvedor SU-8</td><td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td><td></td><td></td>#NC9901158</tr><tr><td>Sylgard 184 Elastômero de Silicone</td><td>Essex Brownell</td><td>#DC-184-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>#BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#448931</td><td></td></tr><tr><td>UAPON-40XW340 Objetivo</td><td>Olympus</td><td>#N2709300</td><td></td></tr><tr><td>Exposição</td> <td>à inundação UVNewport</td><td>#69910</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de Transporte de Wafer, 110 x 11 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>#19395-40</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de padrões para microscopia de tração de micropattern

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Microscopia de tração de micropattern permite o controle da forma de células únicas e aglomerados celulares. Além disso, a capacidade de padronizar na escala de comprimento de micrômetro permite o uso dessas zonas de contato padronizadas para a medição de forças de tração, uma vez que cada ponto micropatterado permite a formação de uma única adesão focal que, em seguida, deforma o hidrogel macio e subjacente. Esta abordagem tem sido usada para uma ampla gama de tipos de células, incluindo células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, plaquetas e células epiteliais. 
Esta revisão descreve a evolução de técnicas que permitem a impressão de proteínas de matriz extracelular em hidrugas de poliacrilamida em uma matriz regular de pontos de tamanho e espaçamento pré-especificados. Como padrões de escala de micrômetros são difíceis de imprimir diretamente em substratos macios, os padrões são primeiro gerados em tampas de vidro rígidas que são então usados para transferir o padrão para o hidrogel durante a gelação. Primeiro, descreve-se a abordagem original de impressão de microcontatos para gerar matrizes de pequenos pontos no deslizamento de tampas. Um segundo passo que remove a maior parte do padrão para deixar ilhas de pequenos pontos é necessário para controlar as formas de células e aglomerados celulares em tais matrizes de pontos padronizados. 
Em seguida, uma evolução dessa abordagem que permite a geração de ilhas de pontos usando um único passo de padronização subtrativa é descrita. Essa abordagem é muito simplificada para o usuário, mas tem a desvantagem de uma vida útil reduzida para o molde mestre necessário para fazer os padrões. Finalmente, são descritas as abordagens computacionais desenvolvidas para a análise de imagens de pontos deslocados e campos de tração gerados por células subsequentes, e são fornecidas versões atualizadas desses pacotes de análise.

Os hidrogéis PAA com o módulo young de E = 3,6 kPa e a razão de Poisson de ν = 0,445 foram feitos para uso por este método de micropatterning subtrativo. Os hidrogéis foram feitos para ter ~100 μm de espessura, o que permite que eles sejam imagens com a configuração de imagem usada aqui, ao mesmo tempo em que impedem que as células desenham o deslizamento rígido abaixo do gel, o que causaria problemas em estudos focados na rigidez celular dessensibilizando23,33<sup cla...

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Este protocolo permite a criação consistente de micro padrões proteicos de alta fidelidade de qualquer forma desejada, notadamente ilhas isoladas de padrão para estudo de aglomerados celulares. Esta técnica pode ser usada para fazer micro padrões isolados da ilha de qualquer forma e tamanho em apenas uma etapa, enquanto anteriormente fazer tais padrões exigia dois passos separados. Comece misturando PDMS na correta relação agente de cura com a razão base, conforme descrito nas instruções do fabricante.Incubar à temperatura ambiente e à pressão por 15 minutos, depois desarmar a mistura sob vácuo por 15 minutos. Despeje o PDMS no molde mestre e transfira-o para uma incubadora fixada a 37 graus Celsius para curar durante a noite. Remova o molde mestre da incubadora e deixe esfriar até a temperatura ambiente.Enquanto o molde mestre está esfriando, sonicate 25 milímetros cobre deslizamentos em etanol por 10 minutos. Use tantas tampas quanto o número de selos que estão sendo preparados. Enxágue completamente as tampas com água DI e seque-as usando uma pistola de ar filtrada.Trate as tampas com plasma por um minuto usando o limpador de plasma sob um vácuo alto. Solte lentamente o vácuo após o tratamento para evitar que as tampas se movam dentro da câmara. Cubra cada tampa com 100 microliters da solução de proteína fluorescente rotulada em uma sala desprovida de luz solar direta ou iluminação aérea.Cubra as amostras para proteção extra contra a luz e incuba-as por 20 minutos em temperatura ambiente. Enxágue bem cada mancha com água DI. Remova o excesso de água da superfície tocando suavemente as laterais de cada mancha de cobertura sobre uma toalha de papel ou um material absorvente semelhante.Deixe as tampas secarem completamente, deixando-as descobertas no escuro por pelo menos 30 minutos. Enquanto as tampas revestidas de proteína secam, remova o carimbo PDMS do molde mestre cortando-o com um bisturi ou qualquer lâmina afiada. Trate os selos PDMS com plasma por dois minutos sob um vácuo alto.Coloque os selos em um recipiente com uma tampa sob o capô da fumaça, em seguida, cubra cada carimbo com uma fina camada de 10%3-APTMS diluída em 100% etanol. Cubra o recipiente com os selos e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Enxágue minuciosamente cada carimbo em ambos os lados com água DI.Coloque os selos em um recipiente limpo e cubra-os com 2,5% de glutaraldeído preparado em água DI. Cubra os selos e incuba-os em temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágüe bem os selos com água DI.Remova o excesso de água da superfície como descrito anteriormente e permita que os selos sequem descobertos por 30 minutos. Se depois de 30 minutos as tampas revestidas de proteína ou os selos não estiverem completamente secos, use uma pistola de ar filtrada para secá-las completamente. Empurre o lado padrão dos selos para as tampas com pressão suficiente para que eles façam contato completo.Deixe-o intacto por 15 minutos. Em seguida, retire cuidadosamente os selos PDMS das tampas. Usando um microscópio fluorescente com o filtro apropriado, verifique a fidelidade das tampas padronizadas.Use as tampas padronizadas imediatamente ou armazene-as longe da luz direta até que use mais. Antes de preparar o precursor do hidrogel PAA, remova o éster de ácido acrílico NHS da geladeira para atingir a temperatura ambiente antes de ser aberto. Prepare um prato de deslizamento intercambiável, esterilizando-o com 70% de etanol, em seguida, incuba-o sob luz UV em um armário de biossegurança por pelo menos 30 minutos antes do uso.Sob o capô da fumaça, adicione 1,25 mililitros de 40% de acrilamida preparado em água DI a um tubo cônico de 15 mililitros. Ao mesmo tubo, adicione 175 microliters de solução de bis-acrilamida preparada em água DI. Em seguida, adicione 500 microliters de 10X PBS, seguido por 2.915 mililitros de água DI.Pipeta 969 microliters deste precursor em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro e armazenar o resto a quatro graus Celsius por até duas semanas. Meça de 50 a 100 miligramas de APS em um tubo de microcentrífuga fresco e dilua-o a 100 miligramas por mililitro em água DI. Abra o éster NHS no capô e meça cuidadosamente até três miligramas de NHS em um tubo de microcentrifusagem.Diluir o éster NHS para um miligrama por mililitro em 1X PBS. Sob a capa de fumaça, adicione dois microliters de TEMED ao tubo de microcentrifuuge contendo a alíquota de 969 microliter do precursor paa. Adicione 15 microlitres de um HCL molar para diminuir o pH da solução de hidrogel e evitar a hidrólise do éster NHS.Adicione 10 microliters da solução de éster NHS ao tubo. Execute as seguintes etapas em um gabinete de biossegurança. Coloque cuidadosamente o deslizamento de cobertura de 30 milímetros dentro da parte média do conjunto de pratos de deslizamento com o 3-APTMS e glutaraldeído tratado lado para cima e parafuso o anel de plástico em cima.Configure o deslizamento de cobertura padronizado com exposição mínima à luz para se preparar para o próximo passo. Pipeta cinco microliters de solução APS no tubo de alíquota precursora paa, em seguida, inverter e misturar. Imediatamente pipeta 35 microliters desta solução no deslizamento de cobertura de 30 milímetros.Coloque a mancha de cobertura padronizada na solução com o lado da proteína para baixo. Tenha cuidado para não criar bolhas de ar no hidrogel. Proteja o hidrogel da luz e deixe polimerizar por 90 minutos.Uma vez que o hidrogel tenha polimerizado, use uma lâmina de barbear ou bisturi para remover o deslizamento superior, certifique-se de que o deslizamento não caia para trás ou deslize para fora do gel uma vez removido para evitar arruinar o padrão na superfície do gel. Para passivar qualquer éster NHS restante no hidrogel, adicione dois mililitros de PBS estéreis ao gel e incubar a 37 graus Celsius por 45 minutos. Prepare imediatamente os géis para experimentos ou armazene-os durante a noite em PBS estéril a quatro graus Celsius até que use mais.Os hidrogéis foram indiretamente padronizados com fibronectina fluorescente para visualizar e medir as forças de tração celular dentro de clusters e criar padrões insulares de tamanho e forma predeterminados. A qualidade do padrão estava diretamente relacionada à fidelidade do molde mestre a partir do qual o selo PDMS foi lançado. Este método poderia fabricar padrões isolados e bem definidos de ilhas de forma predeterminada.Os pontos de adesão à fibronectina estavam presentes apenas na área desejada da ilha. Essas ilhas isoladas de pontos de adesão permitiram ainda melhor controle da forma do cluster. O revestimento de selos PDMS com dois pequenos 3-APTMS é fundamental porque limitará a eficácia do método de remoção, enquanto muito criará um resíduo de laranja na superfície do selo.Os padrões criados aqui podem ser usados para determinar forças de tração celular em células individuais e aglomerados, o que dá uma visão de sua capacidade de manter a homeostase mecânica.

pattern-generation-for-micropattern-traction-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Uma abordagem litografia micropunching é desenvolvido para gerar micro e submicron-padrões na parte superior, lateral e superfícies inferiores de polímero substratos. Ela supera os obstáculos da padronização polímeros condutores e gerar padrões de paredes laterais. Este método permite a fabricação rápida de várias características e é livre de química agressiva.

Micropunching Litografia de Geração de Micro e submicrométricas-padrões sobre substratos poliméricos

O vídeo descreve a preparação de um substrato micropadronizado para estudar a especificação do fenótipo celular. Um carimbo PDMS micropadronizado revestido de proteína é usado para transferir o micropadrão em uma lamínula revestida com PDMS. A lamínula é então tratada com um surfactante para impedir a adesão celular nas superfícies indesejadas. As células são então adicionadas para se estabelecer no padrão e incubadas para análise posterior.

Preparação de um substrato micropadronizado para estudar fenótipos de células de Schwann

Este manuscrito apresenta uma técnica de aplicar ou libertar forças em células aderentes ou tecidos usando alongamento unidirecional.

Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

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