Name: Construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia CRISPR/Cas9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a construir mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando CRISPR/Cas9, incluindo microinjeção em embriões e criopreservação. Este protocolo sistemático acelera pesquisas em genética de insetos e manejo de pragas.

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Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 e pela China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).

1. Seleção do local alvo e projeto de sgRNA
<ol><li>Coletar o máximo possível de informações de sequência para o gene de interesse através de pesquisa bibliográfica e/ou busca do mRNA ou sequência de DNA codificante (CDS) do gene no banco de dados NCBI e gafanhotos24.</li>
	<li>Comparar a sequência do gene interessado com sua sequência de DNA genômico para distinguir as regiões do éxon e do íntron.</li>
	<li>Selecione uma região candidata para o design do site de destino com base no objetivo da pesquisa. Projete pares de primers para amplificar o fragmento da região candidata e verificar sua sequência selvagem por meio da análise de sequenciamento do produto de PCR. NOTA: Existem diferentes estratégias para a seleção da região-alvo candidata. Por exemplo, na maioria das pesquisas de função gene/proteína, use o fragmento de éxon próximo ao seu códon inicial como a região candidata para garantir que toda a função proteína/RNA seja perdida após a edição do genoma (ou seja, nocaute do gene). Enquanto para a análise de função de um domínio específico, selecione a região candidata no início (ou ambas as extremidades) do domínio.</li>
	<li>Use recursos on-line como o E-CRISP Design25 para procurar potenciais sites-alvo na região de destino candidata.<ol><li>Selecione "Drosophila melanogaster BDGP6" (ou qualquer outro inseto) na lista suspensa de genomas de referência e escolha "Input is FASTA sequence" seguido de colar a sequência da região alvo na caixa de texto (no formato FASTA).</li>
		<li>Inicie o aplicativo pressionando "Start sgRNA search" com "medium" e "single design" para obter os possíveis sites de destino. Selecione 1-3 alvos potenciais a partir dos resultados com base em suas pontuações previstas e projete os sgRNAs correspondentes de acordo. NOTA: Existem muitas outras plataformas on-line para o design CRISPR, como CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, e assim por diante (consulte a Tabela de Materiais). Alguns deles têm a função de verificar a especificidade das espécies cujos dados de sequência genômica estão em seus bancos de dados. No entanto, a sequência genômica dos gafanhotos não foi encontrada em nenhum site online. É melhor usar mais de uma ferramenta on-line para o projeto CRISPR em gafanhotos. De forma abrangente, considere os resultados de diferentes sites e selecione o sgRNA a partir dos resultados com base no princípio da maior especificidade, maior eficiência e menor taxa de incompatibilidade (Figura 1A,B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Síntese e verificação do sgRNA in vitro
<ol><li>Sintetizar o sgRNA utilizando kits de síntese de sgRNA de acordo com o manual do fabricante (Tabela de Materiais). Esse procedimento geralmente inclui três etapas: amplificação do molde de DNA, transcrição in vitro e purificação do sgRNA21. Diluir o sgRNA sintetizado com água livre de nucleases para uma concentração de armazenamento de 300 ng/μL para uso posterior.</li>
	<li>Amplificar e purificar o fragmento do gene alvo para servir como substrato do ensaio de clivagem in vitro do sistema CRISPR/Cas9. Execute estas etapas seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Diluir a proteína Cas9 adquirida a 300 ng/μL com água livre de nucleases. Incubar 1 μL de sgRNA (300 ng/μL) e 1 μL de proteína Cas9 (300 ng/μL) com 200 ng de fragmento alvo purificado no tampão de clivagem a 37 °C durante 1 h (10 μL de volume total; ver Tabela 1). Estimar a eficiência da clivagem de Cas9 induzida por sgRNA por eletroforese em gel de agarose (Figura 1C). Selecione os sgRNAs com alta atividade para a seguinte microinjeção. NOTA: Os resultados da eletroforese em gel de agarose podem ser convertidos em imagens em tons de cinza com software de processamento de imagens e a eficiência de clivagem é estimada de acordo com a escala de cinza das bandas de tamanhos especulados.</li>
</ol>3. Microinjeção e cultura dos ovos
<ol><li>Prepare as agulhas de injeção puxando os capilares de vidro com um extrator de micropipeta (Tabela de Materiais). Defina os parâmetros da seguinte forma: Calor para 588, Puxar para 90, Velocidade para 60 e Tempo para 40. Triture a ponta da agulha de injeção com um micro moedor (Tabela de Materiais). OBS: As pontas ideais da agulha são abertas e pontiagudas (Figura 2A). É altamente recomendável preparar agulhas adicionais para os experimentos, porque as agulhas às vezes são bloqueadas ou quebradas acidentalmente durante as injeções.</li>
	<li>Misturar 1 μL da proteína Cas9 (300 ng/μL) com 1 μL do sgRNA verificado (300 ng/μL) para obter as RNPs injetáveis. Adicione 8 μL de água estéril sem RNase para fazer o volume final da mistura para 10 μL. Misture bem a solução e mantenha-a no gelo. NOTA: As concentrações finais da proteína Cas9 e sgRNAs podem ser otimizadas de acordo com os resultados da edição. Evite o congelamento e descongelamento repetitivos da solução preparada de RNP e recomenda-se o uso imediato.</li>
	<li>Criar os gafanhotos adultos machos e fêmeas juntos a 30 °C com fotoperíodo de 16 (claro):8 (escuro) e fornecer-lhes mudas de trigo fresco suficientes como alimento. Observe esses gafanhotos diariamente e coloque um vaso de oviposição (um vaso de plástico ou copo cheio de areia estéril molhada) na gaiola de criação para oviposição assim que os gafanhotos acasalarem. NOTA: Normalmente, 100 pares de gafanhotos adultos criados em uma gaiola de criação (40 cm x 40 cm x 40 cm) são suficientes para gerar ovos para nocautear um único gene. Cultive pares de gafanhotos adicionais se mais ovos forem necessários.</li>
	<li>Recolha as vagens de ovos recém-colocadas do pote de oviposição e aguarde cerca de 30 minutos para o bronzeamento dos ovos. Isole suavemente os ovos das vagens de ovos em água usando uma escova fina e lave-os com água estéril três vezes. Mantenha os ovos em uma placa de Petri e adicione água estéril para mantê-los úmidos. NOTA: O curtimento dos ovos recém-postos pode melhorar significativamente a eficiência mutante21.</li>
	<li>Encha uma agulha de injeção com a solução RNP preparada e carregue-a no micromanipulador (Tabela de Materiais).<ol><li>Defina os parâmetros de microinjeção da seguinte forma: 300 hPa da pressão de injeção (pi), 0,5 s do tempo de injeção (ti) e 25 hPa da pressão de compensação (pc).</li>
		<li>Pressione o pedal para avaliar o volume da solução injetada. Ajuste a pressão de injeção e o tempo de injeção para garantir que o volume de injeção seja de cerca de 50-100 nL. NOTA: Exaure o ar residual na agulha para tornar a solução de injeção contínua e controlável tanto quanto possível. A conexão da agulha e do micromanipulador precisa ser apertada.</li>
	</ol></li>
	<li>Dispor os ovos estéreis regularmente sobre a almofada injetora (Figura 2B,C) e colocá-la sobre a mesa objeto do microscópio (Figura 3A). Ajustar a ampliação do microscópio até que os ovos sejam observados. Ajuste a agulha de microinjeção sob o microscópio até que a ponta de injeção possa ser vista e posicione-a perto do ovo a ser injetado.</li>
	<li>Inicie a injeção a uma altura adequada e num ângulo de 30-45 graus. Insira a ponta no ovo cuidadosamente perto das micrópilas do ovo (Figura 3B) e pressione o pedal para realizar a injeção. Retraia a agulha rapidamente e mova a almofada de injeção para injeção do próximo ovo. NOTA: Deve observar-se uma ligeira expansão do ovo durante a microinjeção. Uma pequena quantidade de extravasamento citoplasmático no orifício é aceitável. Substitua a agulha de injeção por uma nova ou ajuste o ângulo de injeção se a saída de líquido for excessiva.</li>
	<li>Transfira os ovos injetados para uma placa de cultura (uma placa de Petri com um pedaço de papel de filtro úmido) e coloque-os em uma incubadora a 30 °C. NOTA: Levará cerca de 13-14 dias até que as ninfas eclodam desses ovos injetados (com a condição de que a mutação do gene alvo não afete o desenvolvimento dos embriões) (Figura 3C). Injetar pelo menos 100 ovos para garantir uma quantidade suficiente de eclosão e eclosão para eliminar um gene específico.</li>
</ol>4. Estimativa da taxa de mutação e triagem de mutantes
<ol><li>Verifique o desenvolvimento dos ovos injetados todos os dias após a injeção. Transfira os ovos injetados para uma nova placa de cultura a cada 24 h nos primeiros 5 dias.</li>
	<li>No6º dia (ou mais tarde) após a injeção, colher e transferir aleatoriamente 10 ovos para um tubo e triturar adequadamente os ovos com duas esferas de aço a 60 Hz por 6 min usando um moedor (ver Tabela de Materiais). Ressuspender os detritos com 1 mL de PBS. Transferir 5 μL da mistura para 45 μL de NaOH 50 mM e lisar a 95 °C durante 5 min. Adicionar 5 μL de Tris-HCl 1 M (pH=8,0) no sistema de lise para terminar a reação de lise alcalina. NOTA: Os ovos podem ser selecionados para lise alcalina em qualquer dia após a última transferência e vários ovos podem ser usados como uma amostra, dependendo de sua situação de desenvolvimento (por exemplo, cinco embriões de 6 dias podem ser usados como uma amostra, e dois embriões de 10 dias podem ser usados como uma amostra). Às vezes, não é viável obter o DNA genômico dos ovos usando o método de lise alcalina. Kits comerciais de extração de DNA genômico podem ser usados como um método alternativo para isolar o DNA genômico dos ovos.</li>
	<li>Tome 1 μL do produto da lise como molde de PCR para amplificar o fragmento do gene alvo (Tabela 2 e Tabela 3) e envie os produtos de PCR para sequenciamento. Comparar os resultados do sequenciamento com a sequência selvagem para avaliar preliminarmente se o sistema CRISPR/Cas9 clivou o gene alvo in vivo (Figura 4A). Permitir o resto dos ovos para o desenvolvimento subsequente na condição de que indels são detectados na fase embrionária. NOTA: Desta forma, a taxa de mutação pode ser preliminarmente estimada na fase embrionária. Se nenhum indels for encontrado nesta etapa, prepare alguns novos sgRNAs para o gene alvo e repita o protocolo de nocaute da etapa 2.1.</li>
	<li>Transferir as ninfas eclodidas para uma gaiola de criação e cultivá-las conforme descrito na etapa 3.3. Quando as ninfas evoluírem para o estágio de quinto ínstar, separe-as com copos plásticos de cultura (1 ninfa/xícara). NOTA: Geralmente leva cerca de 25-35 dias para que as ninfas se desenvolvam até seu quinto ínstar e o fenótipo mais óbvio é que os brotos alares se estendem até o quarto ou quinto segmentos abdominais. Além disso, recomenda-se registrar os fenótipos de ninfas mortas para predizer a relação entre o gene alvo e os fenótipos em pesquisas futuras.</li>
	<li>Cortar cerca de 2 mm de comprimento das antenas com uma tesoura dissecante e lisá-la utilizando o método de lise alcalina (passo 4.2). Analisar a sequência de fragmentos gênicos alvo dessas ninfas conforme descrito acima (passo 4.3) para identificar os mutantes G0 (Figura 4B). NOTA: O corte das antenas para lise pode ser um pouco mais longo e moer ou picar as antenas é útil para lise, embora as antenas possam ser digeridas diretamente. Indivíduos com múltiplos picos próximos ao local alvo no resultado do sequenciamento são identificados como mutantes positivos e permitem o desenvolvimento e acasalamento subsequentes.</li>
</ol>5. Estabelecimento e passagem de linhagens mutantes
<ol><li>Realizar cruzamento utilizando os mutantes G0 e gafanhotos selvagens (Figura 4B). Recolher os oocistos e incubá-los separadamente a 30 °C. Use 3-6 ovos desenvolvidos em cada oocisto para detectar mutações conforme descrito nas etapas 4.2 e 4.3. Mantenha oocistos mutação-positivos para o desenvolvimento subsequente e abandone os oocistos mutação-negativos. NOTA: A estimativa da taxa de mutação na fase embrionária pode acelerar muito a triagem de mutantesG1 . Geralmente, 3-6 ovos desenvolvidos podem ser misturados como uma amostra para genotipagem mediada por PCR, como descrito acima.</li>
	<li>Recuar as ninfas G1 conforme descrito no passo 4.4. Cortar cerca de 2 mm de comprimento das antenas para realizar a genotipagem baseada em PCR, conforme descrito na etapa 4.5 para detectar heterozigotos G1 . Realizar a clonagem de AT de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) para identificar suas mutações. Realizar o cruzamento utilizando heterozigotos G1 com as mesmas mutações para obtenção de ninfas G2 . NOTA: O sequenciamento de Sanger dos produtos de PCR só pode fornecer informações para descobrir os heterozigotos, mas não informações suficientes para identificar as mutações exatas. Assim, a clonagem de TA usando os produtos da PCR é necessária para identificar claramente as mutações e pode promover o estabelecimento de linhagens mutantes estáveis.</li>
	<li>Recue as ninfas G2 até o quinto ínstar. Use a genotipagem baseada em PCR descrita na etapa 5.2 para identificar os homozigotos e/ou heterozigotos que são adequados para pesquisas futuras e passagem estável (Figura 4B). OBS: Preste atenção para evitar a mistura de homozigotos e heterozigotos. Recomenda-se a realização de genotipagem baseada em PCR em cada geração para confirmar a homozigosidade e/ou heterozigosidade de cada população. O número de gafanhotos utilizados para esta verificação depende do tamanho da população. Além disso, a população de gafanhotos pode ser expandida pela estratégia in-cross.</li>
</ol>6. Criopreservação e ressuscitação de ovos
<ol><li>Lavar os ovos a serem criopreservados com água estéril e incubá-los em uma placa de cultura conforme descrito acima (passo 3.8) por 5-6 dias. Junte esses ovos no prato de cultura e cubra-os com fragmentos de papel de filtro. Embrulhe todo o prato de cultura com um filme de parafina.</li>
	<li>Mantenha o prato a 25 °C por 2 dias seguidos por mais 2 dias a uma temperatura relativamente mais baixa (13-16 °C). Em seguida, transfira o prato para uma geladeira a 6 °C. Adicione água a cada 2 semanas para proporcionar um ambiente úmido para os ovos (Figura 5A). NOTA: Especula-se que os embriões estejam na fase katatrepsis após serem desenvolvidos por 5-6 dias a 30 °C26. O resfriamento do gradiente é útil para a criopreservação dos ovos (Tabela 5).</li>
	<li>Para ressuscitar os ovos criopreservados, retire a placa de Petri da geladeira e mantenha-a a 25 °C por 2 dias. Colocar esses ovos em incubadora a 30 °C até que as ninfas eclodam (Figura 5B). NOTA: É necessário colocar os ovos criopreservados a 25 °C antes de transferi-los para uma incubadora a 30 °C. Os embriões podem ser criopreservados por pelo menos cinco meses, embora a taxa de eclosão e a taxa de eclosão possam diminuir devido à criopreservação (Tabela 5).</li>
</ol>

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<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).</li>
<li>Du, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Laccase+2+severely+impairs+cuticle+tanning+and+pathogen+resistance+during+the+pupal+metamorphosis+of+Anopheles+sinensis+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae).</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 171(2017).</li>
<li>Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tanning+of+grasshopper+eggs+by+an+exocrine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion.</a> Science. 152 (3718), 95-97 (1966).</li>
<li>Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularization+in+locust+embryos+occurs+before+blastoderm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation.</a> Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Os gafanhotos estão entre as pragas mais devastadoras para a agricultura desde a civilização dos seres humanos23. A tecnologia de edição do genoma baseada em CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para fornecer um melhor conhecimento dos mecanismos biológicos em gafanhotos, bem como uma estratégia promissora de controle de pragas. Assim, é de grande benefício desenvolver um método eficiente e fácil de usar de construção de mutantes homozigotos de gafanhotos mediada por CRISPR/Cas9. Embora alguns gr...

Tecnologias de edição de genes poderiam ser usadas para introduzir inserções ou deleções em um locus específico do genoma para modificar artificialmente o gene alvo na finalidade1. Nos últimos anos, a tecnologia CRISPR/Cas9 desenvolveu-se rapidamente e tem um escopo crescente de aplicações em vários campos das ciências da vida 2,3,4,5,6. O sistema CRISPR/Cas9 foi descoberto em 19877, e amplamente encontrado em bactérias e arqueias. Pesquisas posteriores indicaram que se tratava de um sistema imune adaptativo procariótico que depende da nuclease Cas9 guiada por RNA para lutar contra fagos8. O sistema CRISPR/Cas9 modificado artificialmente consiste principalmente de dois componentes, um RNA guia único (sgRNA) e a proteína Cas9. O sgRNA é composto por um RNA CRISPR (crRNA) complementar à sequência alvo e um crRNA auxiliar transativador (tracrRNA), que é relativamente conservado. Quando o sistema CRISPR/Cas9 é ativado, o sgRNA forma uma ribonucleoproteína (RNP) com a proteína Cas9 e guia Cas9 para seu local alvo através do pareamento de bases das interações RNA-DNA. Em seguida, o DNA de fita dupla pode ser clivado pela proteína Cas9 e, como resultado, a quebra de fita dupla (DSB) emerge perto do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) do sítio alvo 9,10,11,12. Para mitigar os danos causados pelos DSBs, as células ativariam respostas abrangentes de danos ao DNA para detectar eficientemente os danos genômicos e iniciar o procedimento de reparo. Existem dois mecanismos distintos de reparo na célula: a junção final não homóloga (NHEJ) e o reparo dirigido por homologia (HDR). NHEJ é a via de reparo mais comum que pode reparar quebras de fita dupla de DNA rapidamente e previne a apoptose celular. No entanto, é propenso a erros por deixar pequenos fragmentos de inserções e deleções (indels) perto dos DSBs, o que geralmente resulta em uma mudança de quadro de leitura aberta e, portanto, pode levar ao nocaute genético. Em contraste, o reparo homólogo é um evento bastante raro. Com a condição de que haja um modelo de reparo com sequências homólogas ao contexto do DSB, as células ocasionalmente reparariam a quebra genômica de acordo com o modelo próximo. O resultado do HDR é que o DSB é precisamente reparado. Especialmente, se houvesse uma sequência adicional entre as sequências homólogas no template, elas seriam integradas ao genoma através do HDR e, dessa forma, as inserções gênicas específicas poderiam ser realizadas13.
Com a otimização e o desenvolvimento das estruturas de sgRNA e variantes da proteína Cas9, o sistema de edição genética baseado em CRISPR/Cas9 também tem sido aplicado com sucesso em pesquisas de insetos, incluindo, mas não se limitando a, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella e Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Até onde sabemos, embora RNPs constituídas pela proteína Cas9 e sgRNA transcrito in vitro tenham sido utilizados para edição do genoma de gafanhotos20,21,22, ainda não existe um protocolo sistemático e detalhado para a construção mediada por ribonucleases CRISPR/Cas9 de mutantes homozigotos do gafanhoto migratório.
O gafanhoto migratório é uma importante praga agrícola de distribuição global e ameaça substancial à produção de alimentos, sendo especialmente prejudicial às gramíneas, como trigo, milho, arroz e milheto23. A análise da função gênica baseada em tecnologias de edição do genoma pode fornecer novos alvos e novas estratégias para o controle de gafanhotos migratórios. Este estudo propõe um método detalhado para nocautear genes de gafanhotos migratórios através do sistema CRISPR/Cas9, incluindo a seleção de sítios alvo e planejamento de sgRNAs, síntese e verificação in vitro dos sgRNAs, microinjeção e cultura de ovos, estimativa da taxa de mutação na fase embrionária, detecção de mutantes, bem como passagem e preservação dos mutantes. Este protocolo pode ser usado como uma referência basal para a manipulação da grande maioria dos genes de gafanhotos e pode fornecer referências valiosas para a edição do genoma de outros insetos.

<table><tbody><tr><td>10 vezes; NEBuffer r3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7030S</td><td>O buffer de &nbsp; in vitro Ensaios de clivagem Cas9</td></tr><tr><td>2xEs Taq MasterMix (Corante)</td><td>Cwbio</td><td>CW0690</td><td>Para amplificação de genes</td></tr><tr><td>2xPfu MasterMix (Corante)</td><td>Cwbio</td><td>CW0686</td><td>Para amplificação de genes</td></tr><tr><td>CHOPCHOP</td><td></td><td></td><td>Site online para design de sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.</td></tr><tr><td>Site CRISPOR</td><td></td><td></td><td>Online para design de sgRNAs, http://crispor.org.</td></tr><tr><td>Site CRISPRdirect</td><td></td><td></td><td>Online para projetar sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação para eletroforese</td><td>LIUYI BIOLOGY</td><td>DYY-6D</td><td>Separação de moléculas de ácidos nucleicos de diferentes tamanhos</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>30125177</td><td>Para coleta de amostras, etc.</td></tr><tr><td>Escovas finas</td><td>Annigoni</td><td>1235</td><td>Para limpar e isolar ovos. Comprado online.</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta flamejante/marrom</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td>Para fazer as agulhas de microinjeção</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Cwbio</td><td>CW2302</td><td>Recuperação e purificação de DNA</td></tr><tr><td>Sistema de análise de imagem em gel</td><td>OLYMPUS</td><td>Gel Doc XR</td><td>Observe os resultados da eletroforese</td></tr><tr><td>GeneTouch Plus</td><td>Bioer</td><td>B-48DA</td><td>Para amplificação gênica</td></tr><tr><td>Vidro eletrodo capilar</td><td>Gairdner</td><td>GD-102</td><td>Para fazer&nbsp; agulhas de injeção com&nbsp; A&nbsp; incubadora extratora de micropipeta</td></tr><tr><td></td><td>MEMMERT</td><td>INplus55</td><td>Para cultura de embriões de gafanhotos migratórios</td></tr><tr><td>Banho de metal</td><td>TIANGEN</td><td>AJ-800</td><td>Para aquecer a amostra</td></tr><tr><td>Micro autoinjetor</td><td>Eppendorf</td><td>5253000068</td><td>Microinjeção de embriões no início do desenvolvimento</td></tr><tr><td>Micro centrífuga</td><td>Allsheng</td><td>MTV-1</td><td>Usado para misturar reagentes</td></tr><tr><td>Micromoedor</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td>Para aterrar a ponta da agulha de injeção</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Para carregar soluções nas agulhas de injeção.</td></tr><tr><td>Sistema de micromanipulação</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td>Um sistema de manipulação altinativa para microinjeção</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>cnoptec</td><td>SZ780</td><td>Para microinjeção</td></tr><tr><td>Manipulador de acionamento motorizado</td><td>NARISHIGE</td><td>MM-94</td><td>Para controlar a posição da micropipeta durante a precedure de microinjeção</td></tr><tr><td>Moedor de tecidos multi-amostra</td><td>jingxin</td><td>Tissuelyser-64</td><td>Moa e homogeneize o pote</td></tr> de <tr><td>ovipisição</td> de ovos <td>ChangShengYuanYi</td><td>CS-11</td><td>Preenchido com areia estéril úmida para ovipositação de gafanhotos nele. Os oocistos são coletados deste recipiente. Comprado online.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>ParafilmM</td><td>PM996</td><td>Para embrulhar as placas de Petri.</td></tr><tr><td>Kit de Clonagem pEASY-T3</td><td>TransGen Biotech</td><td>CT301-01</td><td>Para clonagem de TA</td></tr><tr>placa<td>de Petri</td><td>NEST</td><td>752001</td><td>Para cultura e preservação dos ovos.</td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>Research plus</td><td>Para carregamento de amostras</td></tr><tr><td>copo</td><td></td><td></td> de cultura de plástico <td>Para criar gafanhotos separadamente e qualquer copo de plástico grande o suficiente (não inferior a 1000 mL de volume) servirá. Comprado online.</td></tr><tr><td>Kit de Síntese de gRNA de Precisão</td><td>Thermo</td><td>A29377</td><td>Para síntese de sgRNA</td></tr><tr><td>Primer Premier</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>Primer Premier 5.00</td><td>Para design de primer</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Ciência Perspicaz</td><td>SnapGene&reg; 4.2.4</td><td>Para análise&nbsp; de sequências Bolas</td></tr><tr><td>de aço</td><td>HuaXinGangQiu</td><td>HXGQ60</td><td>Para moagem de amostras. Comprado online.</td></tr><tr><td>Pontas</td><td>bioleaf</td><td>D781349</td><td>Para carregamento de amostras</td></tr><tr><td>Trans DNA Marker II</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM411-01</td><td>Usado para determinar o tamanho do gene</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo</td><td>A36496</td><td>Cas9 protein</td></tr><tr><td>UniversalGen DNA Kit</td><td>Cwbio</td><td>CWY004</td><td>Para extração de DNA genômico</td></tr><tr><td>VANNAS Tesoura</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>72932-01</td><td>Para cortar as antenas</td></tr><tr><td>Trigo</td><td></td><td></td><td>Para gerar mudas de trigo como alimento para gafanhotos. Comprado de agricultores locais.</td></tr><tr><td>ZiFiT</td><td></td><td></td><td>Site online para projetar sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.</td></tr></tbody></table>

construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia crispr/cas9

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

O gafanhoto migratório, Locusta migratoria, não é apenas um dos gafanhotos da peste mundial que causaram enormes perdas econômicas aos seres humanos, mas também um importante modelo de pesquisa para a metamorfose de insetos. O sistema CRISPR/Cas9 pode localizar com precisão em um locus de DNA específico e clivar dentro do local alvo, introduzindo eficientemente quebras de fita dupla para induzir knockout do gene alvo ou integrar novos fragmentos gênicos no locus específico. A edição do genoma mediada por CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para abordar questões encontradas na pesquisa de gafanhotos, bem como uma tecnologia promissora para o controle de gafanhotos. Este estudo fornece um protocolo sistemático para knockout gênico mediado por CRISPR/Cas9 com o complexo da proteína Cas9 e RNAs guia único (sgRNAs) em gafanhotos migratórios. A seleção dos sítios alvo e o planejamento do sgRNA são descritos em detalhes, seguidos pela síntese in vitro e verificação dos sgRNAs. Os procedimentos subsequentes incluem coleta de jangada de ovos e separação de ovos curtidos para alcançar microinjeção bem-sucedida com baixa taxa de mortalidade, cultura de ovos, estimativa preliminar da taxa de mutação, criação de gafanhotos, bem como detecção, preservação e passagem dos mutantes para garantir a estabilidade populacional dos gafanhotos editados. Este método pode ser usado como referência para aplicações de edição genética baseadas em CRISPR/Cas9 em gafanhotos migratórios, bem como em outros insetos.

Este protocolo contém as etapas detalhadas para geração de mutantes homozigotos dos gafanhotos migratórios com a RNP constituída pela proteína Cas9 e sgRNA sintetizado in vitro . A seguir estão alguns resultados representativos do knockout do gene alvo mediado por CRISPR/Cas9 em gafanhotos, incluindo seleção de alvo, síntese e verificação de sgRNA (Figura 1A), coleta e injeção de ovos, triagem e passagem de mutantes, criopreserva e ressuscitação dos ovos homozigotos.
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Este estudo fornece um procedimento sistematicamente otimizado de construção de mutantes homozigotos de gafanhotos baseado em ribonuclease CRISPR/Cas9, bem como um método detalhado para criopreservação e ressuscitação dos ovos de gafanhotos.

Construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

O gafanhoto migratório é um importante teste agrícola. Este método fornece um protocolo eficiente e de fácil produção para os métodos de pressão gênica do É um método sistemático e detalhado de uma construção CRISPR/CAS9 de mutantes homozigotos de gafanhotos, incluindo coleta de ovos, triagem de mutantes e manutenção de homozigotos. Para começar, prepare as agulhas de injeção puxando os capilares de vidro com um puxador de micropipeta.Defina os parâmetros conforme descrito no manuscrito de texto e, em seguida, triture a ponta da agulha de injeção com um micromoedor. Preparar a proteína ribonucleo para a injeção misturando um microlitro de proteína Cas9 com um microlitro do RNA guia único verificado. Em seguida, adicione oito microlitros de água estéril livre de RNA para fazer o volume final da mistura, 10 microlitros.Misture bem a solução e coloque-a no gelo. Em seguida, colete as vagens de ovos recém-colocadas da vagem de posição ova e aguarde o bronzeamento dos ovos. Após 30 minutos, use uma escova fina para isolar os ovos das vagens de ovos em água e lave os ovos três vezes com água estéril.Em seguida, coloque os ovos em uma placa de Petri e adicione água estéril para mantê-los úmidos. Encha a agulha de injeção com a solução preparada de proteína ribonucleo e carregue a injeção no micromanipulador. Defina os parâmetros de microinjeção como 300 Hectopascals de pressão de injeção, 0,5 segundos de tempo de injeção e 25 Hectopascals de pressão de compensação.Quando os parâmetros estiverem definidos, pressione o pedal para avaliar o volume da solução injetada. Ajuste a pressão de injeção e o tempo de injeção para garantir que o volume de injeção seja de cerca de 50 a 100 nanolitros. Depois de organizar os ovos estéreis regularmente na almofada de injeção, coloque a almofada na mesa de objetos do microscópio e ajuste a ampliação do microscópio até que os ovos sejam observados.Em seguida, ajuste a agulha de microinjeção sob o microscópio até que a ponta de injeção possa ser vista e posicione a ponta perto do ovo a ser injetado. Inicie a injeção a uma altura adequada e num ângulo de 30 a 45 graus. Insira a ponta no ovo perto das micro pilhas do ovo e pressione o pedal para realizar a injeção.Em seguida, retraia a agulha rapidamente e mova a almofada de injeção para injeção do próximo ovo. Transfira os ovos injetados para uma placa de cultura com um pedaço de papel de filtro úmido. Coloque-os em uma incubadora a 30 graus Celsius.Após a injeção, verifique o desenvolvimento dos ovos injetados todos os dias. Transfira os ovos injetados para uma nova placa de cultura a cada 24 horas nos primeiros cinco dias. No sexto dia após a injeção, colher e transferir aleatoriamente 10 ovos para um tubo e triturar adequadamente os ovos com duas esferas de aço a 60 hertz por seis minutos usando um moedor.Após a trituração, ressuspenda os detritos em um mililitro PBS. Em seguida, transfira cinco microlitros da mistura ressuspensa em 45 microlitros de hidróxido de sódio de 50 milimolares para lisar a 95 graus Celsius por cinco minutos. Para terminar a reação de lise alcalina, adicione cinco microlitros de uma solução molar de cloridrato de Tris no sistema de lise.Tome um microlitro do produto de lise como o molde de PCR para amplificar o fragmento do gene alvo. Após a PCR e o sequenciamento, comparar os resultados do sequenciamento com a sequência selvagem para avaliar se o sistema CRISPR/Cas9 clivou o gene alvo in vivo. Permitir o resto dos ovos para o desenvolvimento subsequente, pois indels são detectados na fase embrionária.Após o desenvolvimento, transferência e cultura, as ninfas eclodiram em uma gaiola de criação, conforme descrito no manuscrito. Quando as ninfas se desenvolverem até o estágio de quinto ínstar, separe-as com copos de cultura de plástico. Realizar cruzamentos usando os mutantes G0 e gafanhotos selvagens.Depois de coletar oassists, use três a seis ovos desenvolvidos em cada oassist para detectar mutações como descrito anteriormente. Mantenha oassists positivos para o desenvolvimento subsequente e abandone os oassists negativos de mutação. Para criopreservação, lave os ovos com água estéril e incube-os em uma placa de cultura como explicado anteriormente.Após cinco a seis dias, junte os ovos na placa de cultura e cubra-os com fragmentos de papel filtro. Em seguida, envolva todo o prato de cultura com um filme de parafina. Coloque o prato a 25 graus Celsius por dois dias, seguidos por mais dois dias a uma temperatura mais baixa de 13 a 16 graus Celsius.Em seguida, transfira o prato para uma geladeira de seis graus Celsius. Adicione água ao prato a cada duas semanas para proporcionar um ambiente úmido para os ovos. Finalmente, para ressuscitar os ovos criopreservados, coloque a placa de Petri a 25 graus Celsius por dois dias.Mais tarde, coloque os ovos em uma incubadora de 30 graus Celsius até que as ninfas eclodam. Neste estudo, o local alvo do sistema CRISPR/Cas9 foi localizado no primeiro éxon. No ensaio de clivagem de Cas9, a proteína ribonucleo CRISPR/Cas9 pôde digerir o fragmento de PCR contendo o sítio alvo com uma taxa de clivagem de cerca de 55%Os resultados do sequenciamento para a estimativa da taxa de mutação em estágio embrionário sugeriram edição eficiente do genoma no local alvo.A eficiência de edição resultou em uma taxa de eclosão de 52,73% de ninfas e 66,67% dos adultos G0 eram mutantes em mosaico. A estratégia de passagem das linhas mutantes é mostrada aqui. O excesso de ovos homozigotos foi criopreservados para melhorar a taxa de utilização dos homozigotos.Embora a taxa de eclosão dos ovos criopreservados tenha sido reduzida com a extensão do tempo de criopreservação, as ações corretivas, como a aplicação de fragmentos de papel de filtro e a recuperação desses ovos preservados com um gradiente de elevação de temperatura, foram úteis para a ressuscitação. O mais importante é tentar limitar os danos mecânicos causados pela microinjeção. Este procedimento pode ser utilizado como referência para a obtenção de outros insetos.Parte de alguns detalhes como métodos de coleta de ovos, injeção e a cultura devem ser modificados. Esta técnica também pode ser útil para estudar metamorfoses e a adaptação ambiental dos insetos e a construção de mutantes homozigotos de gafanhotos acelerou a pesquisa neste campo.

construction-homozygous-mutants-migratory-locust-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Genes essenciais para a sobrevivência colocam obstáculos técnicos para a criação de linhas de mutantes. Saltos contorna a letalidade combinando genoma edição com transplante de células de germes primordial para criar animais selvagem-tipo carregando mutações do germline. Saltos também permite a geração eficiente de homozigotos mutantes nulos na geração1 F. Aqui, o passo de transplante é demonstrado.

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

Aqui, descrevemos métodos para injeções pupais eficientes e adultas em Nasonia vitripennis como alternativas acessíveis à microinjeção de embriões, permitindo a análise funcional de genes de interesse usando RNA-silenciamento via interferência de RNA (RNAi) ou nocaute genético via edição de genoma CRISPR/Cas9.

Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Muitas características da eussocialidade dos insetos dependem da comunicação dentro da colônia e da divisão do trabalho. A manipulação genética de genes-chave reguladores em embriões de formigas via microinjeção e mutagênese mediada por CRISPR fornece insights sobre a natureza do comportamento altruísta em insetos eussociais.

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

Trata-se de protocolos de coleta e microinjeção de embriões pré-celulares de cigarrinhas de milho com a finalidade de modificar seu genoma via edição genômica baseada em CRISPR/Cas9 ou para a adição de elementos transponíveis marcados por meio de transformação germinativa.

Microinjeção de cigarrinha de milho, Peregrinus maidis, Embriões para edição do genoma CRISPR/Cas9

Este trabalho apresenta os protocolos passo-a-passo para a mutagênese CRISPR/Cas9 da mosca da fruta oriental Bactrocera dorsalis. Passos detalhados fornecidos por este protocolo padronizado servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para estudos de genes funcionais em B. dorsalis.

Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

Aprenda a construir mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando CRISPR/Cas9, incluindo microinjeção em embriões e criopreservação. Este protocolo sistemático acelera pesquisas em genética de insetos e manejo de pragas.

Construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia CRISPR/Cas9

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