Imagem Biomolecular da Captação Celular de Nanopartículas utilizando Microscopia Óptica Multimodal Não Linear

Nosso protocolo apresenta uma microscopia óptica multimodal, não linear, e a aplica para realizar imagens quimicamente específicas de nanopartículas de ouro em células cancerígenas. A principal vantagem do nosso sistema de imagem é que ele pode ser usado para revisar o contraste biomolecular de estruturas celulares e nanopartículas de ouro de maneira multimodal. Para começar, ligue os plugues de todos os equipamentos, exceto a caixa de controle remoto.

Em seguida, ligue a parte de trás da caixa e pressione Iniciar operação depois que a luz remota ficar azul na caixa de controle. Depois, ligue o PC do microscópio de varredura a laser e execute o software do microscópio confocal. Em seguida, verifique o caminho da luz do microscópio usando o software do computador e controle o foco através da tela sensível ao toque ou dos botões de controle remoto ou do software do computador.

Selecione as configurações de imagem desejadas no software, incluindo Zoom, Tamanho da imagem em pixels e tempo de permanência de pixels, garantindo que o tempo de permanência de pixels seja maior do que o tempo de integração. Coloque uma gota de água destilada em cima da objetiva de imersão em água que concentre os feixes de laser na amostra e entre o condensador e a amostra para imagem. Em seguida, ajuste a altura do condensador para aproximadamente um milímetro acima da amostra para coletar a quantidade máxima de luz e mova o detector SRS colocado em uma montagem móvel para fora do caminho do feixe para se concentrar na amostra usando luz branca.

Usando as configurações do software, selecione o feixe da bomba e altere o comprimento de onda do laser para 802 nanômetros para vibrações CH e 898 nanômetros para o pico de amida I, contabilizando grandes mudanças no deslocamento Raman. Para obter pequenos ajustes no turno Raman, digitalize o estágio de atraso na unidade SFTRU, conforme descrito no manuscrito. Para o conjunto de dados hiperespectral, selecione a guia Trigger, clique em Start by ttl trigger on e, em seguida, selecione Trigger every frame.

Em seguida, na guia Série, defina a série temporal ativada e a série Z como desativada. Além disso, defina o número de quadros na série temporal para corresponder ao número de etapas no software ATM. A seguir, vá para a guia Executar no software ATM e defina as posições do estágio de atraso para CH em 90,25 e 92,25, enquanto para a região amida I em 89 e 91 em milímetros, correspondendo à posição de início e parada da varredura hiperespectral, garantindo que o número de passos corresponda ao número de quadros no software de computador.

Depois de verificar as configurações corretas, inicie a pilha hiperespectral no software do computador, primeiro indo para Adquirir e, em seguida, clicando em Iniciar varredura. Em seguida, no software ATM, clique em Iniciar, que inicia a coleta de uma série de imagens com aumentos incrementais na posição do estágio de atraso entre as posições de início e parada selecionadas. Em seguida, faça uma série temporal de imagens em diferentes posições de estágio de atraso para gerar uma varredura hiperespectral.

Usando a unidade analógica, envie e receba sinais ttl de e para o sistema SFTRU para sincronizar a aquisição de imagens e o movimento do estágio de atraso. Para alternar entre a imagem na região vibracional CH para a região vibracional amida I, altere o comprimento de onda da bomba no software laser de 802 nanômetros para 898 nanômetros. Além disso, altere a configuração de dispersão de Stokes no software ATM de 30 milímetros para 5 milímetros.

Ajuste o botão inferior no suporte do espelho para fazer um pequeno ajuste no espelho no caminho de dispersão do feixe da bomba dentro da caixa SFTRU, alterando o ângulo do espelho com uma quantidade incremental. Para validar a seletividade química das microesferas de poliestireno, o espalhamento Raman estimulado hiperespectral e os espectros Raman espontâneos foram registrados. Os espectros foram idênticos, exceto pela diferença observada na intensidade relativa.

A imagem de espalhamento Raman estimulado de células cancerosas 4T1 foi realizada em números de onda 2, 852, 2, 930 e 2.968, correspondendo à banda vibracional de estiramento de carbono-hidrogênio de biomoléculas lipídicas, proteínas e DNA. Imagens multimodais de células cancerígenas 4T1 dosadas com nanopartículas de ouro foram realizadas para investigar as distribuições de nanopartículas em células cancerígenas. As imagens de espalhamento Raman estimulado adquirido foram obtidas para os canais CH2 e CH3, sondas fluorescentes LysoTracker e canal de espalhamento Raman estimulado por off-resonance.

A coisa mais importante a lembrar é alterar a região vibracional, a referência da bomba, no software do laser e também a configuração de dispersão de Stokes durante o protocolo. Este sistema pode ser facilmente comutado da região de femtosegundo para picossegundos sem afetar o alinhamento óptico. Essa capacidade nos permite realizar espalhamento Raman coerente com multifótons e espectroscopia de sonda de bomba e suas aplicações.

Esta plataforma de imagem multimodal fornece novos insights sobre a nanomedicina e abre caminho para imagens moleculares de células, tecidos e nanopartículas de ouro.