Name: Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Aprenda a ablação mediada por nitroredutase/metronidazol e a plataforma MATLAB RpEGEN para estudar a regeneração do epitélio pigmentar da retina em zebrafish Danio rerio. Este método permite identificar vias moleculares que impulsionam a regeneração do EPR e avaliar compostos farmacológicos para descoberta de alvos terapêuticos.

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O trabalho aqui descrito foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (RO1-EY29410 a J.M.G, e nih CORE Grant P30-EY08098 para o Departamento de Oftalmologia); o Centro de Transplante e Terapia Imunológica da UPMC (para L.L.L. e J.M.G.); e a Cadeira E. Ronald Salvitti em Pesquisa oftalmológica (para J.M.G.). Apoio adicional foi recebido da Wiegand Fellowship em Oftalmologia (para L.L.L), da Eye & Ear Foundation de Pittsburgh, e de uma bolsa irrestrita da Research to Prevent Blindness, Nova York, NY. Os autores também desejam agradecer amanda Platt por assistência técnica e Dr. Hugh Hammer e a equipe aquática para um excelente apoio aos animais.

L.L.L. é o co-inventor da Patente dos EUA nº 9.458.428, que descreve um método acelerado para derivar o epitélio do pigmento da retina a partir de células-tronco pluripotentes humanas; não tem relação com o conteúdo aqui. J.M.G. e G.B.F. não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve a metodologia para ablto genético do RPE e mecanismos de estudo de degeneração e regeneração em zebrafish envelhecidos em larvas. Este protocolo também foi realizado com sucesso em zebrafishadulto 3, mas com caracterização menos extensa, e é por isso que as larvas são o foco aqui. Aspectos críticos desta parte do protocolo (etapas 1-4) incluem: 1) adicionar 1,5x PTU a embriões antes do início da melanogênese, 2) descorioar embriões tratados com PTU em 2-3 dpf, 3) triagem cu...

A metodologia aqui descrita detalha um protocolo para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) utilizando zebrafish larval. O RPE se estende sobre a parte de trás do olho e reside entre as camadas estratificadas da retina neural e a camada de vasculatura que constitui o coroide. Suporte trófico, absorção de luz fototóxica e manutenção de proteínas do ciclo visual são apenas algumas das funções críticas que o RPE desempenha que são essenciais para sustentar a saúde e a integridade desses tecidos adjacentes1. Os danos ao RPE mamífero são reparáveis quando as lesões são pequenas2; no entanto, os danos sofridos por lesões maiores ou doenças degenerativas progressivas são irreversíveis. Em humanos, as doenças degenerativas de RPE (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e doença de Stargardt levam à perda permanente da visão e, com poucas opções de tratamento disponíveis, diminuíram a qualidade de vida do paciente. A capacidade limitada de rpe mamífero para auto-reparação criou uma lacuna de conhecimento no campo dos processos regenerativos RPE. Dada a robusta capacidade regenerativa do zebrafish em muitos tipos diferentes de tecidos, este protocolo foi desenvolvido para estabelecer um sistema de vertebrados in vivo para facilitar estudos sobre a regeneração intrinseca do RPE e descobrir mecanismos que conduzem essa resposta. Usando o paradigma de ablação aqui descrito, a via de sinalização canônica Wnt3, a via mTOR4 e as respostas relacionadas à imunidade5 foram identificadas como mediadoras críticas da regeneração de RPE, provavelmente com funções sobrepostas.
Neste paradigma de ablação genética, o gene Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafish expressam o gene nitroreductase derivado da bactéria (NTR/nfsB)6 fundido ao eGFP sob controle do elemento melhorador RPE, rpe65a7. A ablação é alcançada adicionando o pró-drogas, metronidazol (MTZ), ao sistema de água que abriga zebrafish. A ativação intracelular de MTZ por nitroreductase resulta em cruzamento de DNA e apoptose em células expressasNTR/nfsB 8,9. Esta tecnologia tem sido amplamente utilizada em zebrafish para ablate células da retina 10,11,12,13 e outros tecidos 8. Juntos, esses elementos permitem a expressão direcionada (rpe65a) de uma metodologia de ablação celular indutível (NTR/MTZ)8,9 e um marcador fluorescente (eGFP) para visualização.
Outros modelos in vivo interessantes também existem que podem ser usados para estudar o potencial regenerativo do RPE14. Estes são amplos e incluem a transdiferenteição RPE-para-retina pós-retinoctomia em anfíbios, nos quais as células RPE perdidas para o recrescimento da retina são substituídas15,16; Restauração RPE pós-lesão no mouse MRL/MpJ "super curativo"17; e estimulação exógena da proliferação de RPE em um modelo de rato de RPE espontânea e degeneração da retina18, entre outros. Modelos in vitro, como células-tronco RPE humanas adultas (RPESCs)19 também foram desenvolvidos. Esses modelos são ferramentas valiosas que trabalham para desvendar os processos celulares relacionados à regeneração de RPE (por exemplo, proliferação, diferenciação, etc.); no entanto, o zebrafish é único em sua capacidade de reparo de RPE intrínseco pós-ablação.
Enquanto a metodologia aqui é escrita para focar na compreensão dos mecanismos que impulsionam a regeneração do RPE, a linha Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) e este protocolo de ablação genética poderiam ser utilizados para estudar outros processos celulares, como apoptose RPE, degeneração RPE e o efeito da lesão de RPE em tecidos de retina e vascular adjacentes. O protocolo de ablação também pode ser modificado para incluir manipulação farmacológica, que é uma estratégia preliminar conveniente para rastrear caminhos de sinalização de interesse. Por exemplo, bloquear a via canônica Wnt usando o Inibidor do Wnt Response-1 (IWR-1)20, mostrou-se prejudicado a regeneração de RPE3. Isso foi repetido aqui para orientar os usuários através de um experimento de manipulação farmacológica e servir como prova de conceito para validar um script MATLAB (RpEGEN) criado para quantificar a regeneração de RPE com base na recuperação da pigmentação. Como a linha transgênica e o protocolo de ablação, os scripts RpEGEN são adaptáveis e podem ser usados para quantificar outros marcadores/processos celulares dentro do RPE.

<table><tbody><tr><td><forte>Material/Equipamento de Laboratório</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-(4-Amidinofenil)-6-indoloridina dicloridrato (DAPI)</td>Placas de 6 poços <td>Millipore Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga Cônicos de Polipropileno</td><td></td> Fisher Scientific 07-200-83 <td></td> Fisher Scientific 05-539-13 <td>O número do catálogo é para tubos de 50 mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caneta de riscagem com ponta de diamante</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-254-51</td><td>Fabricado pela Electron Microscopy Sciences, itens semelhantes a este número de peça são adequados</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO) &ge; 99,7 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td>Verifique os requisitos de descarte de resíduos químicos institucionais</td></tr><tr><td>Incubadora de embriões (grande)</td><td>Fisher Scientific</td><td>3720A</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de embriões (mini/mesa)</td><td>Labnet</td><td>I5110A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td>Ou similar, com laser/filtro de excitação de 488 nm</td></tr><tr><td>Pipeta Glass Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-4</td><td>Fabricado pela Corning, não estéril</td></tr><tr><td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td><td>Millipore Sigma</td><td>5.04462</td><td>Fabricado pela Calbiochem; 25 mM em DMSO; verifique os requisitos institucionais de descarte de resíduos químicos</td></tr><tr><td>Azul de metileno (pó)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP117-100</td><td>Também disponível como uma solução</td></tr> <tr><td>aqeuous pré-fabricadaMetronidazol (MTZ)</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3761</td><td>Verifique os requisitos de descarte de resíduos químicos</td></tr><tr><td>N-feniltioureia (PTU)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7629</td><td>Verifique os requisitos de descarte de resíduos químicos Requisitos de descarte de resíduos químicos Requisitos de descarte de resíduos químicos</td></tr><tr><td>paraformaldeído (16% p/v) livre de metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>Resíduos químicos, descarte adequado necessário</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>10 cm de diâmetro</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado salino (pacotes de pó)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>Usado para fazer 10 X estoque PBS</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>PRON-RO</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação</td><td>Benchmark</td><td>H2010</td><td>Usado para incubar MTZ por 1 hora a 37 graus Celsius</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Ou similar, com luz transmitida pinça de iluminação</td></tr><tr><td>Student Dumont #5 Fine</td><td>Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Pinça de ponta fina para decorionação manual</td></tr><tr><td>Rotador/agitador de mesa</td><td>Scilogex</td><td>SK-D1807-E</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z135003</td><td>3,2 mL de desenho de lâmpada, não estéril</td></tr><tr><td>Tricaine metanossulfonato (MS-222)</td><td>Pentair</td><td>TRS1, TRS2, TRS5</td><td>Também disponível na Fisher Scientific (NC0342409)</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Software Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI (Fiji é Just ImageJ)</td><td>FIJI (Fiji é Just ImageJ)</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td> <td>Versão: 2.0.0-rc-69/1.52p; Construção: 269a0ad53f; Plugin necessário: Bio-Formatos</td></tr><tr><td>Exemplos de GRAMM e instruções</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>Toolboxes necessários para executar o RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td></tr><tr><td>Suporte ao MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/support.html</td><td></td></tr></tbody></table>

ablação mediada por nitroreductase/metronidazole e uma plataforma matlab (rpegen) para estudar a regeneração do pigmento retinal de zebrafish epithelium

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

O epitélio pigmento da retina (RPE) reside na parte de trás do olho e desempenha funções essenciais para manter a saúde e integridade dos tecidos adjacentes da retina e vascular. Atualmente, a capacidade reparativa limitada do RPE mamífero, que se restringe a pequenas lesões, tem dificultado o progresso na compreensão dos processos regenerativos in vivo RPE. Aqui, uma metodologia detalhada é fornecida para facilitar o estudo do reparo in vivo RPE utilizando o zebrafish, um modelo de vertebrado capaz de regeneração robusta do tecido. Este protocolo descreve um paradigma de lesão mediada por nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que resulta em ablação dos dois terços centrais do RPE após tratamento de 24 horas com MTZ, com posterior recuperação tecidual. O foco é colocado em ablações de RPE em zebrafish larval e métodos para testar os efeitos de compostos farmacológicos na regeneração de RPE também são descritos. Também é discutida a geração e validação do RpEGEN, um script MATLAB criado para automatizar a quantificação da regeneração de RPE com base na pigmentação. Além dos mecanismos ativos de reparação de RPE, este protocolo pode ser expandido para estudos de degeneração de RPE e respostas de lesões, bem como os efeitos dos danos de RPE em tecidos adjacentes da retina e vascular, entre outros processos celulares e moleculares. Este sistema de zebrafish mantém uma promessa significativa na identificação de genes, redes e processos que impulsionam a regeneração do RPE e mecanismos relacionados à doença de RPE, com o objetivo de longo prazo de aplicar esse conhecimento a sistemas de mamíferos e, em última instância, ao desenvolvimento terapêutico.

A inibição da via de sinalização canônica do Wnt é conhecida por prejudicar significativamente a regeneração do RPE de zebrafish usando o paradigma de ablação genética (rpe65a:nfsB-eGFP) e a metodologia de manipulação farmacológica (IWR-1) descrita no protocolo3. Este experimento foi repetido aqui para validar um método automatizado para quantificar a regeneração de RPE de zebrafish com base na pigmentação. Os resultados resumidos abaixo abrangeram todas as etapas do protocolo, desde o di...

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

O zebrafish é único em sua capacidade intrínseca de regenerar muitos tipos diferentes de tecidos, incluindo o RPE. Este protocolo pode ser usado para identificar vias moleculares que impulsionam a regeneração de RPE e mecanismos relacionados à doença de RPE. A versatilidade é uma vantagem primária dessa metodologia.Além de estudar a regeneração do RPE, este protocolo pode ser utilizado para examinar os processos degenerativos rpe e os efeitos dos danos de RPE em tecidos adjacentes no olho. Os mamíferos, incluindo os humanos, são incapazes de reparar grandes lesões de RPE resultantes de trauma ou doença degenerativa. O uso do zebrafish como ferramenta para descobrir fatores pró-regenerativos da RPE é um passo significativo para promover a regeneração de RPE dos mamíferos.Para preparar uma solução fresca de MTZ de 10 milimose, cinco dias após a fertilização, adicione pó MTZ à água do sistema sem PTU e misture completamente por um tremor vigoroso por uma hora a 37 graus Celsius. Esfrie a solução MTZ de 10 milimólares por uma hora à temperatura ambiente em um rotador de mesa ou agitador. Para testar larvas de zebrafish do transgene rpe65a:nsfB-eGFP, separe larvas positivas transgênicas

nitroreductasemetronidazole-mediated-ablation-matlab-platform-rpegen

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Biologia

Neste vídeo, técnicas de imagem multicolor de lapso de tempo confocal e ablação de células alvo são fornecidos. Lapso de tempo de imagem é usado para monitorar o comportamento de vários tipos de células de...

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação a laser alvo de células renais dos néfrons nos...

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Este vídeo demonstra um procedimento para induzir degeneração da retina em peixes-zebra adultos usando lesão a laser. O laser tem como alvo as células fotorreceptoras da retina, desencadeando a morte celular e um processo degenerativo. Esse dano ativa as células da glia de Müller (MG), levando à sua desdiferenciação em progenitores de células-tronco que auxiliam na regeneração da retina.

Modelagem da degeneração e regeneração da retina em peixe-zebra usando uma lesão focal a laser

Vários protocolos de danos provocados pela luz têm sido descritas para fotorreceptores danos e, consequentemente, induzir uma resposta de regeneração da retina adulta em peixes-zebra. Este protocolo descreve um método melhorado, que pode ser utilizada em animais e pigmentados que danifica a grande maioria dos fotorreceptores cone e da haste ao longo de toda a retina.

A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto

Aqui demonstramos quantificação de mento de retina e de regeneração e seu impacto na função visual usando N-metil-N -nitrosourea no peixe-zebra adulto. Perda da acuidade visual e um decréscimo no número de fotorreceptores foram seguidos por proliferação na camada nuclear interna. Regeneração morfológica e funcional completa ocorreu 30 dias após o tratamento inicial.

Metilnitrosouréia (MNU) induzida Retinal degeneração e regeneração no peixe zebra: características histológicas e funcionais

Para ajudar a avaliar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração hepática impulsionada pela via biliar do peixe-zebra, estabelecemos um modelo de lesão hepática no qual os hepatócitos que expressam nitroredutase são geneticamente ablacionados após o tratamento com metronidazol.  Neste protocolo, descrevemos como manipular, monitorar e analisar habilmente a ablação de hepatócitos e a regeneração hepática conduzida por vias biliares.

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.

Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

Desenvolvemos vários protocolos para induzir dano ou degeneração retiniana em girinos de Xenopus laevis . Esses modelos oferecem a possibilidade de estudar mecanismos de regeneração retiniana.

Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

Aprenda a ablação mediada por nitroredutase/metronidazol e a plataforma MATLAB RpEGEN para estudar a regeneração do epitélio pigmentar da retina em zebrafish Danio rerio. Este método permite identificar vias moleculares que impulsionam a regeneração do EPR e avaliar compostos farmacológicos para descoberta de alvos terapêuticos.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium (Vídeo) | JoVE Journal

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

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