Name: Detectando wolbachia strain wAlbb em linhas celulares Aedes albopictus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda quatro métodos complementares para detectar Wolbachia intracelular em linhagens de células Aedes albopictus. Este protocolo aprimora a precisão da detecção de infecções e auxilia pesquisadores a estudar interações hospedeiro-bactéria.

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Agradecemos ao Dr. Xin-Ru Wang, da Universidade de Minnesota, por sugestões e orientações perspicazes. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 81760374).

1. Materiais e reagentes
<ol><li>Use soluções e mídias sem pirógenos para cultura celular (veja a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Use água ultrauso para preparar todas as soluções.</li>
	<li>Tenha cuidado ao selecionar o soro bovino fetal (FBS) para a cultura celular, seguindo um processo de verificação de lotes. NOTA: Como os lotes da FBS estão sujeitos a alterações regulares, é impossível declarar os números relevantes do catálogo e dos lotes neste protocolo.</li>
	<li>Selecione as cepas de células Aa23 derivadas de ovos A. albopictus , correspondentes ao Aa23-T livre de Wolbachia.</li>
</ol>2. Cultura celular
<ol><li>Prepare frascos de cultura celularde 25 cm 2 com 4 mL do meio de Schneider com 10% de FBS.</li>
	<li>Incubar os frascos a 28 °C sob uma atmosfera de CO2 de 5% para 5 a 7 dias 7,24.</li>
	<li>Observe células Aa23 e Aa23-T não manchadas nos frascos usando microscopia leve a 100x de ampliação (Figura 1).</li>
</ol>3. Extração de DNA
<ol><li>Cultura as células por 5-7 dias até 70-80% confluência por frasco (passo 2). Colher as células com tubulação manual de 1 mL de meio de cultura resuspended por centrifugação por 5 min a 100 × g em um microcentrifuge.</li>
	<li>Remova o supernatante por aspiração e armazene a pelota de célula resultante a -20 °C.</li>
	<li>Resuspenja as pelotas em 0,40 mL de salina tamponada com fosfato (PBS), coloque 50 μL da solução em um tubo de microcentrifuuga, adicione 5 μL de proteinase K (20 mg/mL) e incubar a 55 °C por 1 h. Por fim, aqueça estes tubos a 99 °C por 15 minutos para obter o DNA bruto e armazená-lo a -20 °C.</li>
</ol>4. Detecção de ácido nucleico wolbachia
<ol><li>Análise do PCR<ol>
<li>Execute PCR em um volume total de reação de 20 μL, contendo 8 μL de ddH2O, 10 μL de polimerase Taq (ver a Tabela de Materiais), 1 μL de modelo de DNA (a partir da etapa 3), 0,5 μL de primers dianteiros e invertidos (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') e wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, respectivamente.</li>
		<li>Use as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94 °C, ressarem a 55 °C e extensão a 72 °C; em seguida, uma prorrogação final a 72 °C por 7 min.</li>
		<li>Detecte o DNA em um gel de 1% de agarose (1% w/v agarose em PBS) usando um imager de gel.</li>
	</ol></li>
	<li>análise qPCR<ol>
<li>Analise a cópia do genoma de Wolbachia para três réplicas biológicas (n = 6) do DNA extraído (etapa 3) usando primers wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') e QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normalizados com primers de proteína ribossômica S6 (RPS6) para frente e para trás (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' e 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', respectivamente)3.</li>
		<li>Gere uma curva padrão para wAlbB e RPS6.<ol>
<li>Extrair DNA do PMD-18T (vetor especial para clonagem eficiente de produtos PCR (clonagem de TA)) plasmídeo recombinante contendo fragmentos genéticos wsp e rps6 (Arquivo Suplementar) e medir a concentração de DNA plasmídeo (ver a Tabela de Materiais).</li>
			<li>Converta a concentração de DNA plasmídeo para copiar a concentração numépide usando Eq (1). Número da cópia plasmid = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg"> (1)</li>
			<li>Diluir o número da cópia plasmida de 101 a 108 com água ultrapura e definir 3 réplicas para cada gradiente de concentração.</li>
			<li>Realize a amplificação qPCR usando TB Green e um sistema PCR em tempo real (veja a Tabela de Materiais) e regissue os resultados de cada reação. Use o valor ct para desenvolver uma curva padrão. Analise o DNA em um volume total de reação de 20 μL, compreendendo 7 μL de ddH2O, 10,4 μL de TB Verde (ver a Tabela de Materiais), 1 μL de modelo de DNA (fornecido pelo Passo 3) e 0,8 μL de primers dianteiros e invertidos (10 μM). Use as seguintes condições de reação: denaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 40 ciclos de desinaturação a 95 °C para 10 s, e ressarem a 60 °C para 35 s.</li>
			<li>Calcule os números de cópia genética WSP e RPS6 nas células de acordo com a curva padrão estabelecida e a densidade relativa de Wolbachia pelo número de cópia do wsp/RPS6. Analise os dados usando um teste de amostras independentes.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de manchas ocidentais da proteína Wolbachia<ol>
<li>Extração de proteínas<ol>
<li>Colete 2 × 10células Aa23 e Aa23-T da placa de seis poços (a partir do passo 2) em um tubo de microcentrífuga, lave-as três vezes com PBS e centrífugas a 100 × g por 5 min a 4 °C.</li>
			<li>Prepare 1 mL de lise com tampão de lise RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% desoxicosolato de sódio, 0,1% sulfato de dodecil de sódio [SDS], pirofosfato de sódio de 2 mM, 25 mM β-glicerofosfato, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/mL leupeptin) e PMSF (concentração final 1 mM).</li>
			<li>Adicione 200 μL de tampão de lise à pelota celular e mantenha por 30 minutos no gelo. Centrifugar os lises a 12.000 × g por 10 min a 4 °C e remover o sobrenante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ensaio a concentração de wsp do supernante usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) (ver a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.</li>
		<li>Carregar quantidades iguais de proteína em um gel de 15% SDS-PAGE [10% água destilada; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% de amônio persulfato), 0,04% TEMED].</li>
		<li>Transfira a proteína para membranas nitrocelulosese, bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado por 2 h26,27 à temperatura ambiente e depois lave as membranas três vezes com TBST (1 mL de Tween 20 em 1 L de TBS) (ver a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Incubar as membranas durante a noite a 4 °C com 100 μL de anticorpo policlonal anti-wsp (preparado internamente, ver Arquivo Suplementar)), preparado pela diluição do anticorpo primário com 5% de leite desnatado (1:12.000).</li>
		<li>Lave o anticorpo primário três vezes com TBST.</li>
		<li>Incubar as membranas em 100 μL de peroxidase de rabanete (HRP) anticorpo secundário conjugado em um agitador por 1 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave as membranas três vezes com TBST, e misture 20 μL de solução A (HRP Substrate Luminol Reagent) e 20 μL de solução B (HRP Substrate Peroxide Reagent) no kit de detecção de quimiominascência em uma razão de 1:1. Mergulhe toda a membrana na solução de luminescência ao mesmo tempo, e observe os sinais usando um sistema de imagem multifuncional.</li>
	</ol></li>
	<li>Localização de imunofluorescência da proteína Wolbachia<ol>
<li>Incubar 5 ×10 células Aa23 e Aa23-T a 28 °C em uma placa de Petri confocal laser com uma espessura de 0,17 mm na parte inferior, sob uma atmosfera de 5% de CO2 por 3 a 4 dias 7,24. Espere até que a célula esteja 60%-70% de confluência e lave as células três vezes com PBS.</li>
		<li>Fixar as células por 20 min a 4 °C em 1 mL de paraformaldeído de 4% (w/v) em PBS.</li>
		<li>Lave as células fixas usando PBST (0,2% v/v Triton X-100 em PBS) por 5 min e lave as células novamente duas vezes com PBS.</li>
		<li>Incubar os slides por 1 h a 37 °C em 1 mL de 3% (w/v) albumina de soro bovino na PBS.</li>
		<li>Incubar os slides durante a noite em 100 μL de anticorpo policlonal anti-wsp de rato (preparado internamente) e soro de rato (1:1.000 diluição em PBS) em uma caixa molhada (pode manter a umidade e evitar que a umidade evapore) a 4 °C.</li>
		<li>Remova os slides da caixa molhada e devolva-os à temperatura ambiente; lave-os três vezes com PBS e remova o PBS. NOTA: A partir do passo 4.4.7 em diante, todas as operações devem ser protegidas à luz.</li>
		<li>Incubar os slides com 100 μL de um anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 conjugado (1:2.000 diluição em PBS) a 37 °C por 30 min.</li>
		<li>Incubar os slides de amostra com 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI diluído em PBS a 10 μg/mL, liga fortemente ao DNA) a 37 °C por 5 min e depois lavá-los três vezes com PBS.</li>
		<li>Observe a imunostaining sob um microscópio confocal.<ol>
<li>Ligue a energia e o laser.</li>
			<li>Ligue as lâmpadas normais e de mercúrio do microscópio.</li>
			<li>Inicie o sistema e execute o software de operação. Coloque uma gota de óleo de cedro nos slides da amostra, coloque os slides da amostra no estágio do microscópio e mova o palco para a posição apropriada.</li>
			<li>Clique no botão de observação da lâmpada de mercúrio no software, abra o obturador da lâmpada de mercúrio e observe a amostra sob um microscópio invertido para se concentrar.</li>
			<li>Use o painel de controle manual para selecionar fluorescência verde e azul para tirar fotos de fluorescência sob ampliação de 100x.</li>
			<li>Desligue o botão de observação da lâmpada de mercúrio e comece a adquirir imagens.</li>
			<li>Para garantir uma boa qualidade de imagem, prescan pelo tamanho da varredura (512 pixels x 512 pixels). Ajuste o tamanho da varredura para obter imagens claras (1.024 pixels x 1.024 pixels).</li>
			<li>Realize a redução de ruído se o ruído de fundo for muito alto.</li>
			<li>Pare de digitalizar e salve as imagens.</li>
			<li>Desligue a lâmpada de mercúrio e os lasers.</li>
			<li>Limpe o objetivo com 75% de álcool e abaixe o objetivo para a posição mais baixa.</li>
			<li>Desligue o obturador e a energia do microscópio.</li>
			<li>Depois que o instrumento esfriar, cubra-o com a tampa de pó.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

A detecção da infecção por Wolbachia intracelular é essencial para o estudo das interações wolbachia-hospedeira e a confirmação da transfecção bem sucedida de células com novas cepas. Neste protocolo, quatro métodos foram utilizados para detectar com sucesso a infecção por Wolbachia intracelular nos níveis nucleicos de ácido e proteína. Estes quatro métodos experimentais corroboraram e melhoraram a precisão de detecção da infecção por Wolbachia das células. 
<p class="jove_content"...

O mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que é um vetor chave do vírus da dengue (DENV) na Ásia e em outras partes do mundo1, é um hospedeiro natural de dois tipos de bactérias intracelulares, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), que estão distribuídas por toda a linha germe e tecido somático 2,3. A linha celular Aa23 derivada de embriões A. albopictus consiste em pelo menos dois tipos de células morfológicas, ambos suportam a infecção4 e podem ser curados da infecção nativa da Wolbachia usando antibióticos (Aa23-T). Dado que o Aa23 mantém apenas wAlbB, é um modelo útil para o estudo das interações hospedeira-endossímbionte 4,5,6.
Wolbachia é transmitida maternamente e infecta cerca de 65% das espécies de insetos 8,9 e 28% das espécies demosquitos 10. Infecta uma variedade de tecidos e forma uma relação simbiótica íntima com o hospedeiro, geralmente induzindo incompatibilidade citoplasmática (IC)11 e substituição populacional manipulando o sistema reprodutivohospedeiro 12,13. Essas respostas hospedeiras têm sido observadas em populações naturais de simuladores de Drosophila14 e em A. aegypti em uma gaiola de laboratório e ensaio de campo15. Uma importante manipulação não reproducente provocada pela Wolbachia é induzida resistência hospedeira a uma variedade de patógenos, incluindo DENV, vírus Chikungunya (CHIKV) e vírus do Nilo Ocidental (WNV)16,17, que podem ser mediados por um sistema imunológico inato melhorado do simbionte18,19, competição entre Wolbachia e vírus para recursos essenciais de hospedagem20, e manipulação de vias de defesa viralhospedeira 21 .
Este protocolo foi desenvolvido para estudar esses mecanismos subjacentes das respostas antivirais induzidas pela Wolbachia. Utiliza quatro métodos de detecção da infecção por Wolbachia intracelular de células Aa23. Esses métodos fornecem uma forte base teórica para estudos de infecção por Wolbachia intracelular de outras espécies hospedeiras. O primeiro método, PCR-uma técnica poderosa que permite a amplificação enzimática de regiões específicas do DNA sem utilizar procedimentos convencionais de clonagem - foi usado para detectar DNA wolbachia e determinar a presença/ausência da infecção wolbachia 22. O segundo método mede a densidade de cópia de DNA de Wolbachia usando PCR quantitativo (qPCR) para detecção e medição confiável de produtos gerados durante cada ciclo pcr que é diretamente proporcional à quantidade de modelo antes do PCR23. O terceiro método detecta a presença de proteínas wolbachia intracelulares, utilizando uma das ferramentas mais poderosas para detectar proteínas específicas em misturas complexas, combinando o alto poder de separação da eletroforese, a especificidade dos anticorpos e a sensibilidade das reações enzimáticas cromogênicas. O método final é um ensaio de imunofluorescência (IFA) que combina imunologia, bioquímica e microscopia para detectar a proteína da superfície de Wolbachia (wsp) através de uma reação de anticorpos de antígeno para confirmar a absorção celular de Wolbachia e determinar sua localização celular.
Este artigo descreve os quatro métodos listados acima para verificar a existência de Wolbachia nas células, que podem ser usados para detectar se a exógena Wolbachia foi transfeinada com sucesso e a Wolbachia na célula foi limpa. Depois de determinar se wolbachia está presente nas células ou não, uma variedade de diferentes análises podem ser realizadas, incluindo genômica, proteômica ou metabolômica. Este protocolo demonstra a detecção de Wolbachia através de células Aa23, mas também pode ser usado em outras células.

<table><tbody><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scietific</td><td>Pipeta de FB0875713</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>inSituX platform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis Software</td><td>Granada</td> de ítrio e alumínio dopada com cério desenvolvida internamente <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MSE Supplies</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, YAG substratos de cristal único</td></tr><tr><td>Suporte de chip</td><td>Desenvolvido internamente</td> Software de controle Óleo <td></td><td></td></tr><tr><td>de imersão</td><td></td> desenvolvido <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>internamente</tr> Cargille Laboratories 16482 Tipo A baixa viscosidade 150 cSt <tr><td>plataforma inSituX</td> Fonte de luz IR <td>desenvolvida</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED com uma lente de vidro, 1085 nm, 5 mW, anel externo TO-18</td></tr><tr><td></td><td>Lasers de bomba desenvolvidos</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, &Oslash; 9 mm, Código Pin E, Diodo Laser</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anel de retenção</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 para &Oslash; Tubos e suportes de lente de 1"</td></tr><tr><td>Cristal de quartzo sem sementes</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm de diâmetro Corte em Z 0,05 mm de espessura polimento dupla face 8 mm em -X</td></tr><tr><td>Calço</td><td>Parada</td> de feixe de raios X desenvolvida <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>internamente Desenvolvido</td><td></td><td></td> internamente</tr></tbody></table>

detectando wolbachia strain walbb em linhas celulares aedes albopictus

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Como um endossímbionte abrigado maternamente, Wolbachia infecta grandes proporções de populações de insetos. Estudos relataram recentemente a regulamentação bem sucedida da transmissão do vírus RNA usando mosquitos transfectados por Wolbachia. As principais estratégias para controlar vírus incluem a manipulação da reprodução do hospedeiro por incompatibilidade citoplasmática e a inibição de transcrições virais por meio de priming imunológico e competição por recursos derivados do hospedeiro. No entanto, os mecanismos subjacentes das respostas dos mosquitos transfectados wolbachia à infecção viral são mal compreendidos. Este artigo apresenta um protocolo para a identificação in vitro da infecção por Wolbachia nos níveis nucleicos de ácido e proteína em células Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 para melhorar a compreensão das interações entre Wolbachia e seus vetores de insetos. Através do uso combinado de reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR quantitativo, mancha ocidental e métodos analíticos imunológicos, um protocolo morfológico padrão foi descrito para a detecção de células infectadas por Wolbachia que é mais precisa do que o uso de um único método. Essa abordagem também pode ser aplicada à detecção da infecção por Wolbachia em outras taxas de insetos.

Antes da córdia ser detectada, as células Aa23 e Aa23-T foram observadas sob um microscópio leve para determinar quaisquer diferenças morfológicas entre as duas linhas celulares. As células Aa23 e Aa23-T têm pelo menos duas morfologias celulares, mas nenhuma diferença morfológica óbvia entre os dois tipos de células (Figura 1). Aqui, as células Aa23 foram usadas como um sistema modelo para detectar a infecção por Wolbachia usando quatro métodos. A amplifica...

Quatro métodos foram usados para detectar wolbachia intracelular, que se complementou e melhorou a precisão de detecção da infecção wolbachia da Aa23 e Aa23-T derivadas de Aa23 e Aa23-T curadas da infecção nativa wolbachia usando antibióticos.

Detectando wolbachia strain wAlbb em linhas celulares Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Este protocolo ajuda a verificar a existência de Wolbachia nas células, que é a base da compreensão da interação entre Wolbachia e seu hospedeiro. Neste protocolo, quatro métodos foram utilizados para detectar com sucesso a infecção por Wolbachia intracelular, o que corroborou e melhorou a precisão de detecção da infecção por Wolbachia das células. Demonstrando o procedimento estará Qiuqiu Xiao, pós-graduado do Laboratório Chave de Biologia e Características de Patógenos Modernos.Comece observando células Aa23 e Aa23-T não manchadas a 100x de ampliação usando microscopia leve. Cultura as células por cinco a sete dias para atingir 70 a 80% de confluência por frasco. Usando uma pipeta, transfira 1 mL do meio de cultura para um tubo de microcentrífuga.Centrífuga a 100 RCF por cinco minutos para colher as células. Remova o sobrenante e armazene a pelota celular resultante a menos 20 graus Celsius. Cultura as células por cinco a sete dias para atingir 90 a 100% de confluência por frasco.Resuspenja as pelotas em 0,40 mL de PBS e transfira 50 microliters desta solução para um tubo de microcentrífuga. Adicione cinco microliters de 20 mg/mL proteinase K e incubar a 55 graus Celsius por uma hora. Em seguida, incubar os tubos a 99 graus Celsius por 15 minutos para obter o DNA bruto e armazená-lo a menos 20 graus Celsius.Para realizar o PCR, prepare uma mistura de reação total de 20 microliters e defina as condições de PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Detecte o DNA em um gel de 1%agarose usando um imager de gel. Realize a amplificação quantitativa do PCR usando TB Green em um sistema PCR em tempo real e regise os resultados de cada reação.Analise o DNA em um volume total de reação de 20 microliters e defina as condições quantitativas de PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Calcule os números de cópia genética WSP e RPS6 nas células de acordo com a curva padrão estabelecida. Em seguida, calcule a densidade relativa de Wolbachia pelo número de cópia do wsp/RPS6.Analise os dados usando um teste de amostras independentes. Adicione 200 microliters de tampão de lise à pelota celular e incubar no gelo por 30 minutos. Centrifugar os lysates a 12.000 RCF por 10 minutos a quatro graus Celsius e aspirar o supernante.Analise a concentração de wsp do supernante utilizando um kit de ensaio de proteína BCA, seguindo as instruções do fabricante. Carregar quantidades iguais de proteína em um gel de 15% SDS-PAGE. Transfira a proteína para membranas nitrocelulose e bloqueie as membranas com leite 5% desnatado por duas horas à temperatura ambiente.Em seguida, lave as membranas três vezes com TBST. Incubar as membranas durante a noite a 4 graus Celsius com 100 microlitres de anticorpo policlonal anti-wsp preparado pela diluição do anticorpo primário com leite 5% desnatado. Lave o anticorpo primário três vezes com TBST.Adicione 100 microliters de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rabanete às membranas e incuba-o em um agitador por uma hora à temperatura ambiente. Lave as membranas três vezes com TBST e misture 20 microliters de solução A e 20 microliters de solução B no kit de detecção de quemiluminescência em uma proporção de um para um. Mergulhe toda a membrana na solução de luminescência simultaneamente e observe os sinais usando um sistema de imagem multifuncional.Em uma placa de Petri confocal laser, incubar células Aa23 e Aa23-T por três a quatro dias a 28 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono atmosférico. Quando a célula atingir 60 a 70% de confluência, lave as células três vezes com PBS. Fixar as células em um mL de 4% de paraformaldeído por 20 minutos a quatro graus Celsius.Lave as células fixas usando PBST por cinco minutos e reclave as células duas vezes com PBS. Incubar a placa de Petri em um mL de 3% de albumina de soro bovino por uma hora a 37 graus Celsius. Adicione 100 microliters de anticorpo policlonal anti-wsp do rato e soro do rato aos slides e incuba-o durante a noite em uma caixa molhada a quatro graus Celsius.Retire a placa de Petri da caixa molhada e devolva-as à temperatura ambiente. Lave-os três vezes com PBS e remova o PBS. Proteja os seguintes procedimentos da luz.Incubar a placa de Petri com 100 microliters de um anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 conjugado a 37 graus Celsius por 30 minutos. Incubar a placa de Petri com 50 microliters de DAPI diluídos em PBS a 10 microgramas/mL a 37 graus Celsius por cinco minutos e depois lavá-los três vezes com PBS. Observe a imunostaining sob um microscópio confocal.Antes de detectar as células Wolbachia, Aa23 e Aa23-T foram observadas sob um microscópio leve para determinar diferenças morfológicas entre as duas linhas celulares. As células Aa23 e AA23-T tinham pelo menos duas morfologias celulares, mas não foram observadas diferenças morfológicas aparentes entre os dois tipos de células. Utilizando os primers diagnósticos 81F/691R, a amplificação positiva do gene Wolbachia wsp foi detectada em células Aa23, mas não em células Aa23-T.A análise da densidade de Wolbachia nas linhas celulares mostrou uma razão wsp/rps6 de 2,4 em células Aa23, mas nenhuma Wolbachia em células Aa23-T. A análise ocidental de extratos de proteína mostrou um forte sinal wsp para Aa23, mas nenhum sinal foi detectado para Aa23-T. O ensaio indireto de imunofluorescência detectou a proteína wsp em células Aa23, enquanto apenas o DNA manchado de DAPI foi detectado em células Aa23-T.Certifique-se de que os frascos de cultura sejam incubados a 28 graus Celsius sob dióxido de carbono atmosférico de 5% por cinco a sete dias. Este procedimento pode ser seguido por microscopia eletrônica onde é preciso prestar especial atenção à preparação e seção da amostra. Os quatro métodos experimentais utilizados neste estudo confirmaram a precisão de detecção da infecção por Wolbachia nas células, o que também é aplicável a outros tipos de células e tecidos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Wolbachia em Drosophila infecção bacteriana

Este vídeo descreve um método para purificar Wolbachia pipientis a partir de uma linhagem de células Anopheles gambiae e cultura do endossimbionte na célula meio livre. Um ensaio para a viabilidade da bactéria é demonstrada.

Manutenção de Wolbachia em Cell-livre Médio

RNA-Seq as análises estão se tornando cada vez mais importantes para identificar os fundamentos moleculares de características adaptativas em organismos não modelo. Aqui, um protocolo para identificar genes diferencialmente expressos entre mosquitos Aedes albopictus diapausados e não diapausados é descrito, desde a criação de mosquitos até o sequenciamento de RNA e análises de bioinformática de dados de RNA-Seq.

Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito, Aedes albopictus

Os mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia estão sendo liberados em populações naturais para suprimir a transmissão de arbovírus. Descrevemos métodos para traseira Ae. aegypti com Wolbachia infecções no laboratório para experiências e lançamento de campo, tomando as precauções para minimizar a seleção e adaptação de laboratório.

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Este protocolo descreve como estabelecer infecção viral na vivo em Drosophila melanogaster , usando o método de nano-injeção e técnicas básicas para analisar a interação vírus-hospedeiro.

Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.

Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

Um protocolo para cultivar o parasita microsporíduo Edhazardia aedis. O parasita é passagem de uma geração de mosquitos Aedes aegypti para a próxima via transferência horizontal na fase larval seguida de transmissão vertical na fase adulta. Os sporoplasmos vivos sobrevivem a longo prazo em ovos infectados.

Propagação do Parasita Microsporidiano Edhazardia aedis em Mosquitos Aedes aegypti

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a competitividade do Aedes aegypti masculino utilizando corante fluorescente como marcador. Mosquitos fêmeas são expostos a machos marcados e não marcados para cópula. Após o acasalamento, seus espermatozoides são examinados sob um microscópio de fluorescência para determinar seu parceiro de acasalamento.

Usando o Corante Fluorescente, Rhodamine B, para estudar competitividade do acasalamento em mosquitos Aedes aegypti masculinos

A manipulação de RNA de interferência (RNAi) apresenta um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides com tamanho diminuto, como as vespas Trichogramma . Este estudo delineou um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica em vespas Trichogramma .

Interferência de RNA no parasitoide de ovos, Trichogramma dendrolimi Matsumura

As comunidades microbianas em mosquitos são uma grande promessa para as estratégias de biocontrole de vetores. A maioria dos simbiontes não é cultivável, exigindo análises metagenômicas. Descrevemos um método para dissecar mosquitos fêmeas e separar ovários, intestino médio e glândulas salivares, evitando a contaminação cruzada, facilitando estudos de microbioma no nível do órgão e melhorando a compreensão dos papéis dos microrganismos na biologia do mosquito.

Dissecção de ovários, intestino médio e glândulas salivares de mosquitos para análises de microbioma no nível do órgão

As linhagens celulares são úteis em estudos sobre organismos intracelulares que não podem ser cultivados fora de suas células hospedeiras. Embora as linhagens infectadas com Wolbachia tenham permitido muitas descobertas, a heterogeneidade dentro dessas linhagens pode levar a resultados experimentais variáveis. Apresentamos um protocolo para geração de clones unicelulares e culturas contínuas a partir de células JW18 infectadas com Wolbachia.

Geração de Culturas Monoclonais a partir de Wolbachia-infectada com Drosophila melanogaster JW18

Aprenda quatro métodos complementares para detectar Wolbachia intracelular em linhagens de células Aedes albopictus. Este protocolo aprimora a precisão da detecção de infecções e auxilia pesquisadores a estudar interações hospedeiro-bactéria.

Detectando wolbachia strain wAlbb em linhas celulares Aedes albopictus

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