Name: Microdisseção a laser para aplicações de tecido único agnóstico de espécies (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda microdisseção a laser com CEL-Seq2 para análise transcriptômica de tecidos individuais em Caenorhabditis elegans. Este método permite estudar expressão gênica em espécies sem ferramentas genéticas específicas.

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Este trabalho foi financiado por subvenções do NIH (R01GM141395) e NSF (1656736) para bolsa DF e NIH (F32GM136170) para a AW. A Figura 1 foi criada com a ajuda de BioRender.com.

<ol><li>Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+%26%2334%3Bthe+worm%26%2334%3B+to+%26%2334%3Bthe+worms%26%2334%3B+and+back+again%3A+the+evolutionary+developmental+biology+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">From &#34;the worm&#34; to &#34;the worms&#34; and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes.</a> Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).</li>
<li>Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+model+systems+in+evolution+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nematode model systems in evolution and development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).</li>
<li>WormBase. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormbase.org/#012-3-6">https://wormbase.org/#012-3-6</a> (2022).</li>
<li>WormAtlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormatlas.org">https://wormatlas.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://wormbook.org">http://wormbook.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook in Genetics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook">https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook</a> (2022).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Kaletsky, R., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+C.+elegans+adult+cells+and+tissues+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 365 (6459), 1971(2019).</li>
<li>Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+bulk%3A+a+review+of+single+cell+transcriptomics+methodologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).</li>
<li>Von Stetina, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+microarray+profiling+experiments+reveal+a+comprehensive+picture+of+gene+expression+in+the+C.+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system.</a> Genome Biology. 8 (7), 135(2007).</li>
<li>Baugh, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+PAL-1+specifies+a+lineage-specific+regulatory+network+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo.</a> Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).</li>
<li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3%27-end-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS One. 6 (4), 19505(2011).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Yanai, I., Hashimshony, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2-single-cell+RNA+sequencing+by+multiplexed+linear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification.</a> Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+grow+or+not+to+grow%3A+nutritional+control+of+development+during+Caenorhabditis+elegans+L1+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest.</a> Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+responses+throughout+the+Caenorhabditis+elegans+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle.</a> Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+defined+sub-stages+of+C.+elegans+vulval+development+in+the+fourth+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage.</a> BMC Developmental Biology. 15, 26(2015).</li>
<li>Lytal, N., Ran, D., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+methods+on+single-cell+RNA-seq+data%3A+an+empirical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey.</a> Frontiers in Genetics. 11, 41(2020).</li>
<li>Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((powsimR%3A+power+analysis+for+bulk+and+single+cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).</li>
<li>Bolkova, J., Lanctot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+expression+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+using+single+molecule+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH.</a> Methods. 98, 42-49 (2016).</li>
<li>Ji, N., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+of+C.+elegans+worms+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.</a> WormBook. , 1-16 (2012).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 7 (12), 2357(2017).</li>
<li>Baird, S. E., Chamberlin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+briggsae+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis briggsae methods.</a> WormBook. , 1-9 (2006).</li>
<li>Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+tipulae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Oscheius tipulae.</a> WormBook. , 1-8 (2006).</li>
<li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+transgenesis+efficiency+and+CRISPR-associated+tools+through+codon+optimization+and+native+intron+addition+in+Pristionchus+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes.</a> Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).</li>
<li>Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+dissociation+protocol+for+FACS-based+isolation+of+rare+cell+types+from+Caenorhabditis+elegans+L1+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae.</a> MethodsX. 7, 100922(2020).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
<li>Steiner, F. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+affinity+purification+of+nuclei+for+chromatin+profiling+in+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).</li>
<li>Ebbing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).</li>
<li>Rödelsperger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+nematodes+identifies+sperm+cells+as+a+source+of+genomic+novelty+and+rapid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution.</a> Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
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Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Passos críticos do método Se executado corretamente, o método descrito aqui obterá perfis robustos de RNA com um número relativamente pequeno de amostras dissecadas a laser (70 pontas de cauda neste exemplo). No entanto, para amostras de animais em desenvolvimento, a sincronização apertada é fundamental para reduzir a variabilidade entre as amostras. Por essa razão, o protocolo recomenda o método hatch-off para sincronização de vermes. Aqui, o pesquisador pode determinar e controlar precisamente a dif...

Nematoides - particularmente os nematoides rabditidos relacionados ao sistema modelo Caenorhabditis elegans - são um grupo maravilhoso de animais para biologia evolutiva do desenvolvimento (EDB) por muitas razões 1,2. As vantagens incluem seu pequeno número de células, linhagens celulares definidas e consistentes, transparência e facilidade de cultura e criação. Há também muitos recursos disponíveis, incluindo genomas de alta qualidade para múltiplas espécies, e para C. elegans, extensas ferramentas genéticas moleculares e conhecimento sobre desenvolvimento, genética, anatomia e fisiologia 3,4,5,6.
Como em muitos outros organismos, a capacidade de caracterizar a dinâmica do transcriptome em tecidos únicos ou células únicas revolucionou a análise do desenvolvimento em C. elegans 7,8,9,10. Ser capaz de comparar transcritos unicelulares entre nematoides transformaria igualmente o EDB usando esses organismos. Por exemplo, tais comparações forneceriam uma visão de como as redes reguladoras genéticas evoluíram para caracteres (traços) que foram conservados, para caracteres que divergiram, ou para caracteres que evoluíram independentemente.

No entanto, isolar tecidos ou células particulares de nematoides é um dos grandes desafios. Para muitos organismos, as células únicas podem ser dissociadas a partir de tecidos e colhidas de forma imparcial ou podem ser rotuladas com expressão específica do tecido de uma proteína fluorescente e classificadas por triagem celular ativada por fluorescência (FACS)11. Em C. elegans, o isolamento de células de alta produtividade (HTP) tem sido limitado principalmente a embriões porque a cutícula externa dura (e esqueleto hidrostático) tem dificultado o isolamento celular de larvas e adultos. Para contornar esse desafio, alguns métodos têm utilizado ferramentas genéticas em vermes c. elegans inteiros, como mRNA-tagging12 específico de tecido, e comparações de expressão diferencial entre tipo selvagem e mutantes que afetam uma célula tipo13. Métodos mais recentes superaram o desafio dissolvendo a cutícula para isolar núcleos14 ou células inteiras 8,9,15. O isolamento celular e a cultura celular têm as óbvias desvantagens, no entanto, de que as células são removidas de seu contexto natural de desenvolvimento ou anatômico — por exemplo, longe da sinalização celular e contato com a matriz extracelular — que devem impactar o perfil de expressão genética15. Além disso, as ferramentas genéticas e marcadores específicos do tecido são específicos das espécies (ou seja, elas só podem ser usadas em C. elegans).
A LMD fornece um método alternativo para isolar tecidos sem interromper o contexto natural das células. Significativamente para o EDB, a LMD também permite que transcritos de tecidos homólogos de diferentes espécies sejam comparados sem a necessidade de kits de ferramentas genéticas específicos para espécies se o genoma ou sequências de transcriptome inteiros dessas espécies estiverem disponíveis. A LMD envolve direcionar tecidos por observação microscópica direta e usar um micróbio laser — integrado à óptica do microscópio — para cortar e colher (capturar) o tecido de interesse16. As limitações do LMD são que não é propícia a abordagens muito HTP (embora os perfis de transcrição para pontas traseiras, como descrito neste protocolo, fossem robustos com ~70 amostras), certas amostras podem ser difíceis de dissecar, e os cortes são limitados à precisão do laser e ao que pode ser visualizado no microscópio.
O objetivo do presente protocolo é descrever como a LMD, seguida pelo RNA-Seq de tecido único, pode ser usada para obter dados de transcriptome específicos de estágio e tecido de nematoides. Especificamente, ele demonstra LMD para isolar pontas traseiras de larvas de quarto estágio (L4) de C. elegans. No entanto, este método pode ser adaptado a outros tecidos e, claro, espécies diferentes.
Em C. elegans, há 4 células que fazem a ponta da cauda em ambos os machos e hermafroditas. Durante a fase L4 em machos — mas não em hermafroditas — as células da ponta traseira mudam de forma e migram anteriormente e interiormente. Esse processo também ocorre em algumas, mas não em todas as outras espécies de nematode rabditid. Portanto, a ponta da cauda é um bom modelo para a evolução da morfogênese dimórfica sexual. Por causa de sua posição, a ponta traseira também é fácil de isolar por LMD.
Para obter perfis de transcriptome a partir de pontas traseiras, o presente protocolo utiliza o CEL-Seq2, um método RNA-seq desenvolvido para células únicas17,18. Este método tem várias vantagens para tecidos derivados de LMD. O CEL-Seq2 é altamente sensível e eficiente, usando identificadores moleculares únicos (UMIs) para permitir quantificação direta de leituras de mRNA, transcrição in vitro para garantir amplificação linear e codificação de barras que permite multiplexação de amostras de tecido individuais. A única limitação do CEL-Seq2 é que as leituras recuperadas são tendenciosas para o final dos mRNAs de 3' e, portanto, a maioria dos isoformes, portanto, não pode ser distinguida.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 0,5 &micro; Lâminas de vidro de membrana M PEN sem RNase</td><td>Leica</td><td>11600288</td><td>para LMD</td></tr><tr><td>500 &micro; L Tubos de PCR (sem nuclease)</td> <td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>para cortar as pontas da cauda em</td></tr><tr><td>microscópio composto com objetiva de 40x e DIC</td><td>qualquer</td><td></td><td>para verificar a idade dos vermes</td></tr><tr><td>Umidificador de mesa</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio de dissecação com base de luz transmitida</td><td>qualquer</td><td></td><td>para todos os trabalhos de sem-fim</td></tr><tr><td>pasteur de vidro pipetas</td><td>qualquer</td><td></td><td>alça de picareta de minhoca</td></tr><tr><td>lâminas de vidro e lamínulas</td><td>para</td><td></td><td>verificar a idade dos vermes</td></tr><tr><td>Sistema de microdissecação LMD6</td><td>Leica</td><td>múltiplo</td><td>para cortar pontas da cauda</td></tr><tr><td>Tubos LoBind 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td></td><td></td><td>Receita em WormBook</td></tr><tr><td>Metanol 99,8%</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>para corrigir vermes</td></tr><tr><td>NGM meio de crescimento</td><td>US Tampões e sais biológicos</td><td>N1000</td><td>precisam ser adicionados: Receita no</td></tr><tr><td>WormBook P10 pipeta de volume variável</td>, <td>por exemplo, pipeta Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 de volume variável</td><td>, por exemplo, pipeta Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 de volume variável</td><td>, por exemplo, pontas de pipeta Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &micro; L</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta 1-10 &micro; L filtrado</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fio de platina irídio</td><td>Tritech</td><td>PT-9010</td><td>para fazer picareta de minhoca</td></tr><tr><td>estéril e sem nuclease 1 mL centrfuge tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr> qualquer <tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Adicione uma quantidade muito pequena ao tampão M9 para evitar que os vermes grudem nas pontas da pipeta</td></tr><tr><td>ventiladas placas de Petri de plástico de 6 mm</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Para CEL-Seq2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4200 Sistema TapeStation com reagentes para detecção de RNA e DNA de alta sensibilidade</td><td>Sistema de eletroforese automatizado</td><td>Aligent</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos AMPure XP Grânulos</td> de <td>limpeza de DNA</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td></tr><tr><td>Tampão de ligação de grânulos&nbsp; 20% PEG8000, 2,5 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2 primers (ver Tabela S1)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>Termociclador com tampa programável e bloco para 200 &micro; l tubos.</td></tr><tr><td>DNA Polimerase I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 10 mM</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA ligase</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT para limpeza de produtos de PCR</td> Solução de <td>exonuclease</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit de transcrição</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>Para a etapa 4.6.1</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR de alta fidelidade Master Mix com tampão HF</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>Etapa 4.9.7</td></tr><tr><td>hexâmero aleatório RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>um primer com 6 nucleotídeos que são RNA aleatório</td></tr><tr><td>Tampão de fragmentação</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA Fragmentação stop buffer</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA PCR Index Primers (RPI1&ndash; RPI48)</td><td>Illumina, NEB ou IDT</td><td></td><td>RPIX na etapa 4.9.7 do protocolo, sequências disponíveis nas esferas Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>ou qualquer outro produto similar</td></tr><tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinante Inibidor de ribonuclease</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Segundo tampão de fita</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>transcriptase reversa</td></tr></tbody></table>

microdisseção a laser para aplicações de tecido único agnóstico de espécies

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Metodologias unicelulares revolucionaram a análise dos transcritos de tipos celulares específicos. No entanto, eles geralmente requerem "kits de ferramentas" genéticos específicos das espécies, como promotores que conduzem a expressão específica do tecido de proteínas fluorescentes. Além disso, protocolos que interrompem tecidos para isolar células individuais removem células de seu ambiente nativo (por exemplo, sinalizando de vizinhos) e podem resultar em respostas ao estresse ou outras diferenças em relação aos estados de expressão genética nativa. No presente protocolo, a microdisseção a laser (LMD) é otimizada para isolar pontas individuais de cauda de nematoide para o estudo da expressão genética durante a morfogênese da ponta da cauda masculina.
O LMD permite o isolamento de uma porção do animal sem a necessidade de interrupção celular ou kits de ferramentas específicos para espécies e, portanto, é aplicável a qualquer espécie. Posteriormente, protocolos de preparação de bibliotecas RNA-seq de células únicas, como o CEL-Seq2, podem ser aplicados a tecidos únicos isolados de LMD e analisados usando dutos padrão, dado que um genoma ou transcriptome bem anotado está disponível para a espécie. Esses dados podem ser usados para estabelecer o quão conservados ou diferentes são os transcriptomes que estão por trás do desenvolvimento desse tecido em diferentes espécies.
As limitações incluem a capacidade de cortar o tecido de interesse e o tamanho da amostra. Uma análise de energia mostra que apenas 70 pontas traseiras por condição são necessárias para 80% de potência. Uma sincronização rigorosa do desenvolvimento é necessária para obter esse número de animais no mesmo estágio de desenvolvimento. Assim, também é descrito um método para sincronizar animais em intervalos de 1h.

Após microdisseção de captura a laser, pontas traseiras individuais de machos e hermafroditas em 4 pontos de tempo (L3 22 h após a escotilha; L4 24, 26 e 28 h após o hatch) foram preparados para sequenciamento de RNA utilizando o protocolo CEL-Seq2. Os primers CEL-Seq2 contêm códigos de barras exclusivos que permitem que leituras de sequenciamento de uma determinada amostra (neste caso uma ponta de cauda individual) sejam identificadas bioinformáticamente. Os dados de sequenciamento foram gerados com este método para um ...

Um protocolo é descrito que usa microdissecção a laser para isolar tecidos nematoides individuais para sequenciamento de RNA. O protocolo não exige kits de ferramentas genéticas específicos para espécies, permitindo que perfis de expressão genética sejam comparados entre diferentes espécies ao nível de amostras de tecido único.

Microdisseção a laser para aplicações de tecido único agnóstico de espécies

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Combinamos microdisseção de captura a laser com um protocolo de busca de RNA de célula única chamado CEL-Seq2 para gerar conjuntos de dados transcriômicos para pequenas amostras de tecido individual. Esta técnica nos permite estudar a expressão genética em tecidos ou espécies que não podem ser estudadas usando métodos tradicionais de classificação celular. Além disso, fornece mais especificidade do que uma abordagem RNA-seq em massa.Aqui demonstramos esta técnica para as quatro pontas de cauda celular de C.elegans quarto estágio machos e hermafroditas. Mas a beleza dessa abordagem é que ela pode até ser aplicada a espécies não modelo. Demonstrando o procedimento estarão a Sra. Raya Jallad, doutoranda do meu laboratório e dr. Antonio Herrera, atualmente cientista biomédico líder na escola Baylor em Chattanooga, Tennessee.Comece por uma tubulação suave de um a dois mililitros de tampão M9 contra a parede da placa sem esguichar. Gire a placa para desalojar os vermes. Remova e descarte todo o líquido e os vermes colocando a ponta da pipeta contra a parede da placa na borda do ágar para evitar furar.Este vídeo mostra a placa antes que as mães e a larva sejam removidas. Somente embriões devem ser deixados após a retirada das mães e da larva. A larva L1 começará a aparecer após a incubação por uma hora ou mais.Em seguida, coloque a placa a 25 graus Celsius. Após uma hora, retire a placa da incubadora. Solte cuidadosamente um mililitro de tampão M9 no ágar e gire a placa para desalojar os L1s, mas não os embriões.Centrifugar o tubo e pipeta os L1s diretamente no gramado bacteriano de uma placa semeada. Mantenha os vermes a 25 graus Celsius. Sob um microscópio de dissecção de 30 a 50 X, comece a escolher os machos e os hermafroditas das placas de sincronização em placas separadas não seladas.Os machos são distinguidos das hermafroditas pela forma salientes e cor mais clara das caudas masculinas em comparação com a forma pontiaguda e a cor mais escura das caudas hermafroditas. Lave os vermes da placa com um a dois mililitros de tampão M9 usando uma ponta de pipeta pré-lavada com tampão M9 contendo detergente de 0,01%. Transfira os worms para um tubo de centrífuga de um mililitro, gire por um minuto e adicione um mililitro de tampão M9.Mais uma vez, gire por um minuto. Adicione um mililitro de gelo frio 70% de metanol e misture bem. Repita a lavagem com um mililitro de metanol, misture bem.Gire-o por um minuto e adicione 500 microliters de 70% de metanol. Misture-o e armazene-o a quatro graus Celsius por uma hora para a noite. Pipeta 20 microliters dos vermes fixos no lado revestido de um naftato de polietileno ou deslizamento de vidro de membrana PEN.Espere o metanol evaporar. Remova o escudo plástico sobre o palco e clique no botão de descarga com a seta para cima para carregar as lâminas da membrana. Certifique-se de que o slide está completamente seco, vire para que a membrana esteja virada para baixo e insira o slide.Clique para continuar na janela do espécime de alteração. O suporte de slides se moverá. Em seguida, substitua o escudo plástico, na parte inferior da tela, escolha qual porta-slides contém o slide e clique no botão de descarga com a seta para baixo para carregar os tubos.Puxe a bandeja para fora e remova o bloco do tubo. Insira as tampas do tubo de quatro tubos PCR de 500 microliter no suporte e dobre o tubo sob. Volte o bloco para a bandeja e deslize a bandeja de volta para o estágio do microscópio.Na janela popup do dispositivo de coletor de alterações, selecione tubos PCR e clique bem. Clique no local vazio do tubo no canto inferior esquerdo da tela sob tampas do tubo do dispositivo coletor e no painel de controle do microscópio selecione TLBF para iluminação de campo brilhante transmitido. Usando a lente 2.5X, ajuste o foco até que os vermes e a estrutura superficial da membrana PEN sejam visíveis.Mude para a lente 20X e mova o palco para uma região sem vermes. Ajuste o foco de modo que as estruturas semelhantes à bolha na membrana tenham uma cor amarelada para focar o laser no plano focal correto e, em seguida, definir os parâmetros de laser. Para as pontas traseiras, comece com potência 45 abertura 30 na velocidade 20.No painel de controle a laser, selecione calibrar e siga as instruções. Em seguida, na parte inferior da tela em tampas de tubo do dispositivo coletor clique na posição A, no lado direito da tela selecione a forma única, seguido de desenho e corte. Em seguida, selecione ponto a ponto e desenhe uma linha.Clique em iniciar o corte para que o laser corte através da membrana. Encontre um verme e mude para se mover e cortar. Use o mouse para cortar a cauda.Para coletar a amostra, mude para a configuração de desenho e corte com a função ponto a ponto e desenhe a forma para completar o corte de uma seção de membrana. Selecione o próximo tubo na tampa do tubo do dispositivo coletor na parte inferior da tela e corte a próxima ponta da cauda. Uma vez que quatro caudas são cortadas, descarregue o rack do tubo clicando em descarregar com a seta para baixo.Encontre as seções de membrana sob um microscópio dissecando e continue com o processamento da amostra a jusante. Aqui sequenciamento rna com CEL-Seq2. Pipetas 1.2 microliters de uma mistura master de primer CEL-Seq2 diretamente em cima da amostra e feche o tubo.Rotule com o número do primer e coloque imediatamente a tampa do tubo diretamente em um pedaço de gelo seco para congelar a amostra, evitando assim a degradação do RNA. Repita até que todas as amostras tenham sido coletadas. Finalmente armazene os tubos a menos 70 graus Celsius.C.elegans L3 hermafroditas e machos de 21 a 23 horas após a escotilha podem ser distinguidos sob um microscópio de dissecção pela morfologia de suas caudas. A história da hermafrodita é estreita enquanto a dos machos está inchada e parece clara. O aparecimento da estrutura de lâminas de membrana PEN e da cauda de verme é mostrado nestas imagens.Aqui o foco está correto para as lentes 20X e 40X no microscópio. A cauda dissecada imparcialmente cortou a membrana PEN são visíveis aqui. Depois de fechar a abertura do corte, a peça de membrana cairá na tampa do tubo abaixo do slide.Uma tampa de tubo com uma seção de membrana PEN contendo uma ponta de cauda dissecada é mostrada aqui. A imagem gráfica representa o registro natural transformado em identificador molecular exclusivo ou contagem umi por ponta de cauda individual para diferentes pontos de tempo e sexos. O software powsimR é usado para determinar quantas amostras independentes são necessárias para detectar genes diferenciados expressos ou DE em vários níveis de expressão.A imagem gráfica aqui representa a verdadeira taxa positiva para detectar os genes DE entre duas condições para quatro simulações diferentes incorporando diferentes tamanhos de amostra por condição. A linha tracejada indica uma taxa positiva de 80%. A taxa de falsa descoberta e as mesmas quatro simulações são mostradas aqui.A linha tracejada indica uma taxa de descoberta 10% falsa. Os gráficos mostraram que um tamanho amostral de 70 pontas traseiras por condição é suficiente para detectar os genes DE, exceto para os genes com níveis de expressão muito baixos. Para uma sincronização adequada, certifique-se de que apenas embriões estejam presentes na placa.Para garantir contra a perda da amostra, pipeta a cartilha misturar diretamente na seção de membrana PEN na tampa e ser extremamente suave no fechamento da tampa. Por ser agnóstico de espécies, podemos usar este protocolo para explorar como as redes de regulação genética evoluíram para estruturas homólogas em diferentes espécies.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

O vídeo descreve a dissecção a laser do modelo de cocultura organotípica 3D com precisão em nível de mícron. Em modelos organotípicos 3D, constituintes estromais, como fibroblastos, são co-cultivados tridimensionalmente com células epiteliais cancerígenas. O modelo 3D serve como uma ferramenta experimental que permite que as interações entre invasão e estroma de câncer sejam estudadas em condições quase fisiológicas.

Microdissecção a laser: uma técnica para isolar células invasoras de câncer colorretal a partir de um modelo de cultura organotípica 3D

Este vídeo descreve a técnica para obter uma única célula de uma população de células heterogêneas usando microdissecção por captura a laser. A única célula isolada pode ser usada para estudos genômicos adicionais ou pesquisas sobre o câncer.

Amostragem de célula única usando microdissecção por captura a laser: uma técnica para colher células-alvo de uma população de células heterogêneas

SIVQ-LCM é uma abordagem inovadora que utiliza um algoritmo de computador, espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ), para conduzir o processo a laser microdissection captura (LCM). O fluxo de trabalho SIVQ-LCM melhora a velocidade e precisão da microdissecção, com aplicações tanto na pesquisa e na clínica.

Protocolo SIVQ-LCM para o Instrumento ArcturusXT

Microdissecção tem sido extensivamente utilizada para a análise de DNA, RNA e proteínas dentro do tecido. Microscopia captura a laser (LCM) é o método mais comumente utilizado, mas uma nova técnica de fresagem, mesodissection, é recentemente disponível. Demonstramos extração de RNA a partir de mesodissected formalina parafina fixo lâminas de tecido embebidos de Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

O isolamento de neurônios de dopamina individuais ou a área tegmental ventral com imunohistoquímica direta ou indireta é demonstrada usando captura a laser microdissection. São discutidos os parâmetros para o isolamento de tecido a partir de uma lâmina de vidro usando um laser de infravermelhos e a partir de lâminas de membrana usando a combinação de um laser infravermelho e ultravioleta.

Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

Aqui apresentamos um protocolo para microdissecção assistida por laser de tipos específicos de células vegetais para perfil transcricional. Embora o protocolo seja adequado para diferentes espécies e tipos de células, o foco está nas células altamente inacessíveis da linha germinativa feminina, importantes para a reprodução sexual e apomítica no gênero de crucíferas Boechera.

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de alto rendimento para segmentação de regiões de interesse confirmadas pela patologia de imagens de seção de tecidos manchados e finos para enriquecimento de populações celulares resolvidas por histologia usando microdisseção a laser. Esta estratégia inclui um novo algoritmo que permite a transferência de demarcações denotando populações celulares de interesse diretamente para microscópios a laser.

Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

A microdissecção por captura a laser de tecidos de fibrose submucosa oral permite a extração precisa de células de regiões histológicas de interesse para a análise de dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais.

Isolamento de Células com Informações Morfológicas e Espaciais de Amostras de Fibrose Submucosa Oral por Microdissecção por Captura a Laser

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Aprenda microdisseção a laser com CEL-Seq2 para análise transcriptômica de tecidos individuais em Caenorhabditis elegans. Este método permite estudar expressão gênica em espécies sem ferramentas genéticas específicas.

Microdisseção a laser para aplicações de tecido único agnóstico de espécies

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