Name: Quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(II) e Peptídeos na Presença e Ausência de Cromóforos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a quantificar a termodinâmica de ligação de Cu(II) a peptídeos usando espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria de titulação isotérmica. Este método combina técnicas ortogonais para fornecer insights abrangentes sobre interações metal-peptídeo em sistemas bioquímicos.

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SC agradece a Whitehead Summer Research Fellowship. O MJS agradece aos Fundos de Startup e ao Fundo de Desenvolvimento do Corpo docente da Universidade de São Francisco. O MCH reconhece financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH MIRA 5R35GM133684-02) e da Fundação Nacional de Ciência (NSF CAREER 2048265).

1. Espectroscopia de absorção eletrônica: titulação direta com competição de buffer
<ol><li>Preparação da amostra<ol>
<li>Prepare uma solução tamponada de 50 mM 2-[bis(2-hidroxitila)amino]-2-(hidroximetila)propano-1,3-diol (bisTris) em pH 7.4 usando água ultrapura (resistência >18 MΩ). Remova íons metálicos de traço incubando com uma resina de alta afinidade por pelo menos 2 h com filtragem subsequente.</li>
		<li>Dissolva ou dilua uma quantidade conhecida do peptídeo no buffer sem metal. NOTA: Ao monitorar bandas d-d com pequenos coeficientes de extinção21, devem ser utilizadas concentrações mais elevadas de peptídeos. Aqui, a concentração final de C-peptídeo na solução tamponada foi de 300 μM (o volume depende do tamanho do cuvette). O c-peptídeo foi sintetizado pela síntese de peptídeos em fase sólida e é detalhado em outros lugares da literatura14.</li>
		<li>Dissolva uma massa conhecida de CuCl2 em água ultrauso para fazer uma solução a 10-15 mM. NOTA: É importante dissolver inicialmente o sal metálico em água não aferida para evitar a precipitação. Outros sais(II) podem ser usados, mas deve-se tomar cuidado para garantir que o ânion esteja fracamente coordenando.</li>
	</ol></li>
	<li>Executando o experimento<ol>
<li>Ligue o espectrômetro de absorção eletrônica e deixe aquecer por ~15-20 minutos antes de usar. Inicie o software espectrômetro e configure os parâmetros como faixa de digitalização (200-900 nm), taxa de varredura (200 nm/s) e linha de base de feixe duplo corrigida (mais parâmetros estão listados no Arquivo Suplementar).</li>
		<li>Colete uma linha de base sem cuvetas ou amostras nos caminhos do feixe.</li>
		<li>Utilizando duas cuvetas combinadas no espectrofotômetro de feixe duplo, carregue um cuvette com 115 μL de água ultrapura e o outro cuvette com 115 μL da amostra de peptídeo. Certifique-se de que não há bolhas de ar nas cuvetas, pois estas interferirão com o sinal.</li>
		<li>Coloque a cuvette com água ultrapura no feixe de referência e a cuvette com peptídeo no feixe de amostra.</li>
		<li>Colete o espectro de absorção do peptídeo livre de metal (apo).</li>
		<li>Adicione uma quantidade subsetoquiométrica (0,5 equivalentes, 150 μM) da solução(II) na cuvette com a amostra de peptídeo. Certifique-se de que o volume de(II) adicionado seja inferior a 3 μL e regise o volume para análise posteriormente.</li>
		<li>Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar a solução, evitando a geração de bolhas de ar. Que a solução reaja e equilibre por 5 minutos e regise o espectro de absorção.</li>
		<li>Repita a adição de alíquotas de(II) como na etapa 1.2.6 na solução de peptídeo para os seguintes equivalentes: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 e 5.0 (ou um total de 300, 450, 600, 900 e 1.500 μM). Certifique-se de registrar o volume total de(II) adicionado e o volume total do cuvette. NOTA: Se houver mais resolução, reduza o espaçamento entre os equivalentes.</li>
		<li>Remova a colher de sopa de amostra e limpe completamente de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Adicione a solução tamponada sem peptídeo e registe o espectro de absorção. Repita a adição de alíquotas de(II) como nas etapas 1.2.5-1.2.8, registrando o espectro de absorção para cada equivalente(II).</li>
		<li>Exporte todos os espectros como arquivos csv para processamento. Limpe completamente as cuvetas de acordo com as instruções do fabricante e desça o espectrômetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Processamento dos dados<ol>
<li>Carregue todos os espectros em um programa de planilha.</li>
		<li>Subtraia o espectro somente tampão (0 μM(II) de todos os outros espectros para remover quaisquer recursos de absorção do próprio buffer.</li>
		<li>Normalize cada espectro para explicar a diluição resultante da adição da solução(II) (etapa 1.2.6). Consulte o Arquivo Suplementar, Eq (1)14 para um exemplo da normalização onde vinicial é o volume (115 μL) de peptídeo adicionado ao cuvette, v(II) é o volume da solução(II) adicionado na etapa 1.2.6, eespectro subtraído abs tampão são os dados obtidos na etapa 1.2.7.</li>
		<li>Gráfico de todos os espectros juntos para identificar regiões de mudança. NOTA: Bandas d-d típicas dos complexos cu(II) variam de 500 a 750 nm. Esta titulação espectrofotométrica pode ser desafiadora devido ao pequeno coeficiente de extinção das bandas D-D, que são transições proibidas por Laporte na geometria octadral21. Se a absorvância for muito fraca, uma abordagem alternativa é utilizar ligantes cromofóricos que resultam em bandas de transferência de carga ao vincular-se a(II) (ver seção 2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Espectroscopia de absorção eletrônica: competição de peptídeos com ligante cromofórico
<ol><li>Preparação da amostra<ol>
<li>Dissolver 1,10-phenanthrolina (fen) em água ultrauso para obter uma concentração final de ~1 mM.</li>
		<li>Além da preparação da amostra descrita na seção 1.1 para o peptídeo (etapa 1.1.2) e(II) (etapa 1.1.3), prepare uma solução de 10 μM(II) e 40 μM de fen em tampão ([(phen)3]2+). Certifique-se de que o volume preencha o cuvette.</li>
	</ol></li>
	<li>Executando o experimento<ol>
<li>Inicie o espectrofotômetro de absorção eletrônica como nas etapas 1.2.1 e 1.2.2, mas defina a faixa de digitalização para 200-400 nm.</li>
		<li>Em duas cuvetas combinadas, carregue uma cuvette com 115 μL de água ultrapura e a outra cuvette com 115 μL da solução [(phen)3]2+ . Coloque a cuvette com água no feixe de referência e a cuvette com solução [(phen)3]2+ no feixe de amostra.</li>
		<li>Colete o espectro de absorção do complexo metal-ligante.</li>
		<li>Adicione uma quantidade estequiométrica (≈1 equivalentes, ≈10 μM) de peptídeo à solução [(phen)3]2+ . Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar completamente, mas tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar. Registo o volume de peptídeo adicionado para análise futura. NOTA: O uso de cuvetas que possuem 115 μL, adicionando 3,83 μL de peptídeo de 300 μM produz uma concentração final de peptídeo de 9,7 μM.</li>
		<li>Incubar a solução por 5 minutos para alcançar o equilíbrio. Regisso espectro de absorção. NOTA: Se a afinidade de ligação do metal-peptídeo e metal-ligante for semelhante, a concentração de peptídeo adicionado precisará estar em grande excesso. Certifique-se de explicar o volume total de peptídeo adicionado para normalização.</li>
		<li>Repita a adição de alíquotas de peptídeos na solução [(phen)3]2+ para os seguintes equivalentes aproximados: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 e 26. Registo o volume de peptídeo adicionado para que a concentração diluída possa ser determinada.</li>
		<li>Remova a amostra e limpe bem a cuvette de acordo com as instruções do fabricante. Colete um espectro do buffer. Colete um espectro de 50 μM peptídeo no buffer.</li>
		<li>Exporte todos os dados como arquivos csv para processamento e limpe as cuvetas de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Processamento dos dados<ol>
<li>Carregue o espectro em um programa de planilha e subtraia o espectro tampão do outro espectro.</li>
		<li>Normalize o espectro seguindo arquivo suplementar, Eq (2)14.</li>
		<li>Utilizando o coeficiente de extinção para [(phen)3]2+ a 265 nm (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22, determine a concentração de [(phen)3]2+ com cada adição do peptídeo.</li>
		<li>Para cada adição do peptídeo, determine a concentração do complexo(II)-peptídeo subtraindo a concentração restante de [(phen)3]2+, conforme determinado na etapa 2.3.2, a partir da concentração inicial de [(phen)3]2+ (a 0 μM peptídeo).</li>
		<li>Calcule a concentração de ligante defenal livre pela equação em Arquivo Suplementar, Eq (3)14.</li>
		<li>Calcule a concentração de peptídeo livre usando Arquivo Suplementar, Eq (4)14, onde o estoque [peptídeo]representa o peptídeo não diluído titulado no cuvette, V1 representa o volume de peptídeo adicionado, V2 é o volume total da cuvette, e [2+-peptídeo] é determinado na etapa 2.3.4.</li>
		<li>Calcule a afinidade de ligação experimental (Kex) usando Eq (5) no Arquivo Suplementar23.</li>
		<li>Relacionar a constante de dissociação de(II)-peptídeo a Kex por Eq (6)23 em Arquivo Suplementar, onde Kd,(II)-phen = 1,0 × 10-9 (ver 22). Determine o desvio médio e padrão de todas as constantes de dissociação determinadas. NOTA: Sob uma proporção de 4:1 de feno:Cu(II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(fen)2]2+, e [Cu(phen)]2+ existem na solução, e o peptídeo se afastará cu(II) da espécie ([Cu(phen)]2+) com a ligação mais fraca22.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Calorimetria de titulação isotérmica
<ol><li>Preparação da amostra<ol>
<li>Prepare uma solução tamponada de 15 mM 3-morpholinopropano-1-sulfônico ácido (MOPS) em pH 7.4 usando água ultrapura (resistência > 18 MΩ). Remova íons metálicos de traço incubando com uma resina de alta afinidade por pelo menos 2 h com filtragem subsequente de vácuo através de uma membrana de 0,45 μm de garrafa.</li>
		<li>Dissolva uma massa conhecida de CuCl2 em água ultrauso para preparar uma solução de ≈50-100 mM. Diluir esta solução(II) em tampão para obter uma solução de 1,0 mL com concentração final de 1,4 mM(II). Regisso o volume exato da solução CuCl2 utilizada.</li>
		<li>Dissolva ou dilua a solução de peptídeo no buffer para fazer 450 μL de uma solução de peptídeo de 154 μM. Certifique-se de que a mesma proporção de água ultrauso adicional da etapa 3.1.2 seja adicionada à solução de peptídeo, que reduzirá o calor da diluição e aumentará o sinal-ruído.</li>
		<li>Após a preparação das amostras, certifique-se de que as soluções estejam no mesmo pH e, se necessário, ajuste em conformidade.</li>
		<li>Passo opcional: Degas as soluções para minimizar microbolhas carregadas no ITC.</li>
	</ol></li>
	<li>Executando o experimento<ol><li>Ligue o ITC. Inicie o software ITC para executar o instrumento. Aguarde a primeira inicialização, que pedirá para reabrigar o buret; em seguida, siga as instruções na tela.</li>
		<li>Remova a tampa da célula de referência. Remova qualquer água da célula de referência e enxágue três vezes com 450 μL de água ultrapura desgaseada.</li>
		<li>Desenhe lentamente água ultrauso para a marca de 450 μL de uma seringa de carregamento, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na seringa. Insira a seringa de carregamento na célula de referência até que esteja ≈1 mm a partir da parte inferior, e injete lentamente parte da solução até que 150 μL permaneça na seringa de carregamento. Mova o êmbolo de seringa de carga rapidamente para cima e para baixo ≈25 μL várias vezes para desalojar quaisquer bolhas na superfície da célula. Injete lentamente até que o êmbolo atinja a marca de 100 μL na seringa de carregamento, dispensando assim um total de 350 μL de água ultrapura na célula de referência e substitua a tampa da célula de referência.</li>
		<li>Remova qualquer solução residual da célula amostral e carregue com 450 μL de ácido 10 mM etilenodiaminetetraacético (EDTA) usando uma seringa de carregamento. Mergulhe por 10 minutos para garantir que os íons metálicos de traço sejam removidos porque o EDTA ligará metais de traço.</li>
		<li>Remova a solução EDTA (com íons metálicos de traço ligado) e enxágue completamente a seringa de carregamento com quantidades abundantes de água ultrapura.</li>
		<li>Limpe o ITC de acordo com as instruções do fabricante, enxaguando a célula amostral com água ultrapura.</li>
		<li>Condicionar a célula amostral enxaguando com 450 μL de tampão pelo menos três vezes.</li>
		<li>Remova o tampão que está condicionando a célula amostral. Carregue a solução de peptídeo na célula amostral usando a seringa de carregamento (siga o passo 3.2.3).</li>
		<li>Enxágüe a seringa de titulação com 200 μL de solução tamponada. Para isso, remova o êmbolo e use uma micropipette para pipetar o tampão através do orifício na parte superior da seringa de titulação de vidro, através da seringa, e para fora da agulha abaixo.</li>
		<li>Insira totalmente o êmbolo na seringa de titulação.</li>
		<li>Mergulhe a ponta da agulha de seringa de titulação na solução metálica e puxe lentamente o êmbolo para cima, fazendo com que a solução metálica encha a seringa e resulte em um volume vazio na parte superior da parte de vidro da seringa de titulação. Remova a maior parte do volume vazio girando a seringa de titulação paralela ao chão, remova o êmbolo e incline ligeiramente a parte do vidro em direção ao chão. Dê à seringa titulação um aperto suave para que a solução se mova para a extremidade da parte de vidro da seringa de titulação e preencha a maior parte do volume vazio, mas certifique-se de que 2-3 μL de volume vazio permaneça. Mantendo a seringa paralela ao chão, reinserir o êmbolo.</li>
		<li>Segure a seringa de titulação ereto, mergulhe a ponta da agulha de volta na solução metálica e empurre o êmbolo para baixo até que o ar deixe de sair da agulha. Carregue a seringa de titulação puxando lentamente o êmbolo para pouco acima da marca de 50 μL, mantendo a ponta da agulha na solução.</li>
		<li>Insira cuidadosamente a parte de vidro da seringa de titulação no arroto e enrosque até que esteja bem apertado. Quando uma pequena quantidade de solução sair da seringa de titulação devido à compressão do êmbolo, use um limpador delicado leve para absorver cuidadosamente a solução sem tocar na ponta da agulha.</li>
		<li>Insira o buret com a seringa de titulação na célula amostral e fixe-a com segurança.</li>
		<li>Configure os parâmetros no software ITC. A partir do Controle de Instrumentos, defina a taxa de agitação (taxas típicas de agitação variam de 150 a 350 RPM) e a temperatura na qual o experimento será realizado (tipicamente 25 °C). Digite as concentrações de seringas e células em unidades mililitros em Detalhes de Experimento.</li>
		<li>Na seção Método de experimento , selecione Titulação Incremental. Clique em Configurar e especifique 20 injeções de 2,5 μL. Se for necessário mais resolução para observar o evento de ligação, aumente o número de injeções e diminua o volume por injeção. Insira o espaçamento de tempo entre cada injeção para que seja longo o suficiente para que o sinal se equilibre e retorne à linha de base, tipicamente 300 s.</li>
		<li>Clique no botão executar para iniciar o experimento e especifique onde os dados são salvos.</li>
		<li>Após a conclusão do experimento, limpe a célula amostral e a seringa de titulação.</li>
		<li>Execute todos os experimentos em pelo menos triplicado para garantir a coleta precisa de dados.</li>
		<li>Execute um experimento de controle onde a solução metálica é titulada na solução tamponada (na ausência de peptídeo) para garantir que o calor da diluição do íon metálico seja pequeno e que não haja equilíbrio não contabilizado. Se o calor da diluição for grande, considere um sistema tampão diferente, se possível.</li>
	</ol></li>
	<li>Processamento dos dados<ol>
<li>Inicie o software de análise ITC e carregue o arquivo de dados para análise.</li>
		<li>Navegue até a guia Linha de Base e inspecione o termograma. Note que qualquer calor exógeno evoluiu ou absorveu de bolhas de ar ou outros artefatos no termograma. Procure por picos que não são devido à injeção da solução metálica.</li>
		<li>Certifique-se de que a linha de base gerada pelo software de análise segue a parte dos dados após a injeção e o equilíbrio. Se ele se desviar, use pontos de pivô de linha de base para ajustar a linha de base. Certifique-se de que as Regiões de Integração incluam o pico gerado a partir da injeção do metal, mas ocluam quaisquer bolhas de ar ou artefatos no termograma encontrado na etapa 2. Subtraia a linha de base do termograma. NOTA: Este tipo de manipulação é recomendada somente após a coleta de múltiplos termogramas, para que o experimentador saiba o que são dados reais e o que é um artefato, pois o ajuste da linha de base e das Regiões de Integração pode afetar drasticamente os dados.</li>
		<li>Navegue até a janela Modelagem para começar a encaixar os dados onde o software de análise mostrará os dados integrados e normalizados de concentração para cada injeção.</li>
		<li>Clique esquerdo no datum da primeira injeção para removê-lo do algoritmo de montagem. NOTA: Isso é comum, uma vez que haverá uma pequena mistura entre a solução de células de titante e amostra que levar à dispensação inexata do molar da primeira injeção.</li>
		<li>Na seção Modelos , selecione Blank (constante) no menu dropdown Style , que é baseado na incontegnição de injeção final e será subtraído de todos os pontos de dados, contabilizando o calor da diluição. Além disso, selecione Independente (ou o melhor modelo para o sistema) no segundo menu de dropdown Style para se adequar aos dados. NOTA: Para interações de ligação padrão 1:1, o modelo mais comum é Independente.</li>
		<li>Encaixe os dados usando os dois modelos pressionando o botão de reprodução verde com um Σ. NOTA: Outro software para processar dados ITC é o SEDPHAT24.</li>
		<li>Conta de todo o equilíbrio concorrente na análise pós-hoc relatada anteriormente por Grossoehme et al. Dia 20.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Este artigo fornece um método robusto para quantificar a afinidade e termodinâmica de(II) vinculando-se aos peptídeos. Complexos com(II) são idealmente adequados para monitorar a banda de absorção d-d no local do metal devido à sua configuração de elétrons d9 . Embora o coeficiente de extinção seja pequeno, exigindo concentrações maiores do complexo para produzir um sinal confiável, as titulações de(II) em peptídeo podem rapidamente fornecer uma visão da estoquiometria vinculante e afinidade aproximada de liga...

A biologia evoluiu para utilizar a diversificada química dos íons metálicos necessários para que a vida se adapte e sobreviva em seu ambiente circundante. Estima-se que 25%-50% das proteínas usam íons metálicos para estrutura e função1. O papel particular e o estado redox do íon metálico estão diretamente relacionados com a composição e geometria dos ligantes biológicos que o coordenam. Além disso, íons metálicos ativos de redox, como(II), devem ser fortemente regulados para que não interajam com agentes oxidantes através da química fenton para formar espécies reativas de oxigênio (ROS)2,3,4. Compreender os modos de ligação e afinidade que impulsionam sua bioquímica deve ajudar a elucidar o papel biológico do íon metálico.
Muitas técnicas são utilizadas para estudar as interações vinculantes de metais e peptídeos. Estas são principalmente técnicas espectroscópicas, mas também incluem simulações de computador usando dinâmica molecular, como visto através de interações(II) com um fragmento de beta amiloide (Aβ)5. Uma técnica espectroscópica amplamente utilizada que é acessível a muitas universidades é a ressonância magnética nuclear (RMN). Usando a natureza paramagnética de(II), Gaggelli et al. foram capazes de mostrar onde o íon metálico se liga a um petide através do relaxamento dos núcleospróximos 6. A ressonância paramagnética eletrônica (EPR) também pode ser utilizada para sondar a localização e o modo da ligação de íon metálico paramagnético7. Outras técnicas espectroscópicas, como o dicromaísmo circular (CD) podem descrever a coordenação sobre(II) em sistemas como sistemas tripeptídeos8, e espectrometria de massa pode mostrar estequiometria e para que resíduos o íon metálico seja coordenado através de padrões de fragmentação 9,10.
Algumas dessas técnicas, como a RMN, são livres de rótulos, mas exigem grandes concentrações de peptídeos, colocando desafios para o estudo. Outra técnica comum chamada espectroscopia de fluorescência tem sido utilizada para relacionar a posição de uma tirasina ou triptofano com a sacieçação de um(II)11,12. Da mesma forma, esta técnica pode apresentar alterações estruturais como resultado da ligação(II) 13. No entanto, os desafios com esses estudos de ligação metal-peptídeo são que eles sondam aminoácidos cromofóricos, como a tyrosina que nem todos os sistemas têm, que o íon metálico se liga sob um modelo clássico, e que a técnica pode não ser propícia em condições fisiológicas. De fato, existem vários peptídeos que não contêm tais aminoácidos cromofóricos ou se ligam sob modelos clássicos, impedindo o uso dessas técnicas14,15. Este artigo detalha abordagens para avaliar propriedades vinculantes nesses cenários em condições fisiologicamente relevantes.
Ligantes biológicos podem adotar diferentes estados de protonação que podem afetar a ligação de íons metálicos, como o anel de imidazol na histidina. Se o pH não for mantido de forma consistente, os resultados podem ser complicados ou conflitantes. Por essa razão, os buffers são um componente essencial no estudo das interações metal-proteína/peptídeo. No entanto, muitos buffers têm sido mostrados para interagir favoravelmente com íons metálicos16,17. Além de competir com a molécula biológica de interesse, o tampão pode ter átomos coordenados semelhantes que podem ser difíceis de distinguir dos átomos coordenadores do peptídeo ou proteína. Neste estudo, o foco está na espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria isotemal de titulação (ITC) como duas técnicas complementares para o estudo das interações(II)-peptídeos, com considerações especiais sobre a escolha do tampão.
A espectroscopia de absorção eletrônica é uma técnica rápida e amplamente acessível para estudar interações de ligação metálica. A irradiação com luz no comprimento de onda ultravioleta (UV) ou visível pode levar à absorção de bandas d-d centradas no metal, que fornecem informações valiosas sobre classificação de ligantes, geometrias metálicas e afinidades de ligação aparente18,19. Para esses complexos, as titulações diretas de íons metálicos em soluções de proteína ou peptídeo podem quantificar estoquitometrias vinculantes e afinidades aparentes de ligação. Em alguns casos, como configurações de5 oud 10 elétrons, o complexo não absorve luz (ou seja, é espectroscopicamente silencioso). Nestes complexos metálicos de transição espectroscópicamente silenciosos, essas limitações podem ser contornadas usando um ligante concorrente que, ao coordenar para o íon metálico, produz faixas detectáveis de transferência de carga. Em ambos os casos, esta abordagem limita-se a quantificar apenas a estequiometria e a afinidade de ligação aparente, e nenhuma percepção sobre a entalpia vinculante é fornecida sem aproximações.
Complementando informações obtidas a partir da espectroscopia de absorção eletrônica, o ITC é uma técnica atraente para quantificação direta e rigorosa da ligaçãoenthalpy 20. O ITC mede diretamente o calor liberado ou consumido durante um evento de ligação e, uma vez que a titulação ocorre em pressão constante, o calor medido é a entalpia de todo o equilíbrio (ΔHITC). Além disso, quantificam-se a estequiometria do evento de ligação (n) e a aparente afinidade de ligação (KITC). A partir desses parâmetros, a energia livre (ΔGITC) e a entropia (ΔSITC) são determinadas, fornecendo um instantâneo termodinâmico do evento de ligação. Como não depende da absorção de luz, o ITC é uma técnica ideal para espécies espectroscopicamente silenciosas, por exemplo, d5 ou d10 peles de íons metálicos. No entanto, uma vez que a calorimetria mede o calor, qualquer sistema tampão incomparável e equilíbrio não contabilizado pode afetar negativamente a análise para determinar com precisão a termodinâmica de ligação de íons metálicos, e muito cuidado deve ser tomado para lidar com esses fatores20. Se realizado com o rigor adequado, o ITC é uma técnica robusta para determinar a termodinâmica dos complexos metal-proteína/peptídeo.
Aqui, um peptídeo de ligação de cobre cromoohoricamente silencioso, C-peptídeo, é usado para demonstrar o uso complementar das duas técnicas. C-peptídeo é um produto de decote de resíduos (EAEDLQVGQGQGGGGGLQPLALEGSLQ) formado durante a maturação da insulina; não possui resíduos cromofóricos, mas tem se mostrado que liga(II) com afinidade fisiologicamente relevante14,15. O sítio de ligação(II) consiste nas cadeias laterais de um glutamato e um aspartato, bem como o N-terminus do peptídeo 14,15. Estes átomos coordenadores se assemelham muito aos de muitos sistemas tamponados comumente usados. Aqui, é mostrado o uso tandem das bandas d-d e transferência de carga em espectroscopia de absorção eletrônica e ITC na quantificação da termodinâmica de ligação(II) para C-peptídeo. A abordagem do estudo(II) vinculativo ao C-peptídeo pode ser aplicada a outros íons metálicos e sistemas de proteína/peptídeo.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantrolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>131377-25G</td><td></td></tr><tr><td>tampão bis-Tris</td><td>Fisher</td><td>BP301-100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de 0,45 mícron</td><td>Nalgene</td><td>296-4545</td><td>Qualquer sistema de filtração que remova a resina sem introduzir contaminantes é aceitável</td></tr><tr><td>Cloreto de cobre(II)</td><td>Alfa Aesar</td><td>12458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de absorção eletrônico</td><td>Varian</td><td>Cary 5000</td><td>Outro espectrofotômetro sensível adequado é a</td></tr><tr><td>resina de alta afinidade</td> aceitável <td>Sigma Aldrich</td><td>C7901-25G</td><td></td></tr><tr><td>Calorímetro de titulação isotérmica (ITC)</td><td>TA Instruments</td><td>Nano ITC Software</td> de análise ITC de baixo volume <td></td></tr><tr><td></td><td>TA Instruments</td><td>NanoAnalyze</td><td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&ndash; 148) também pode ser usado</td></tr><tr><td>Software ITC</td><td>TA Instruments</td><td>ITCRun</td><td></td></tr><tr><td>limpador delicado leve</td><td>Kimwipe</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>seringa de carregamento</td><td>Hamilton</td><td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td><td></td></tr><tr><td>cubetas combinadas</td><td>Starna Cells, Inc</td><td>16.100-Q-10/Z20 Certifique-se</td><td>de que a janela para a cubeta de pequeno volume corresponda à altura do feixe do espectrofotômetro</td></tr><tr><td>Amortecedor MOPS</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td></td></tr><tr><td>software de espectrofotômetro</td><td>Cary</td><td>WinUV Programa</td> de planilha de varredura <td></td></tr><tr><td></td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>Qualquer programa de planilha adequado funcionará</td></tr><tr><td>seringa de titulação</td><td>TA Instruments</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>água ultrapura</td><td>Millipore Sigma</td><td>Milli-Q</td><td>Qualquer água é boa desde que >18 M&Omega; resistência</td></tr></tbody></table>

quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(ii) e peptídeos na presença e ausência de cromóforos

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

O cobre(II) é um metal essencial em sistemas biológicos, conferindo propriedades químicas únicas às biomoléculas com as quais interage. Foi relatado para se ligar diretamente a uma variedade de peptídeos e desempenhar papéis necessários e patológicos que vão desde a estrutura mediadora até propriedades de transferência de elétrons até a função catalítica de transmissão. Quantificar a afinidade vinculante e a termodinâmica desses complexos(II)-peptídeos in vitro fornece insights sobre a força motriz termodinâmica de vinculação, competições potenciais entre diferentes íons metálicos para o peptídeo ou entre peptídeos diferentes para(II), e a prevalência do complexo(II)-peptídeo in vivo. No entanto, quantificar a termodinâmica de ligação pode ser desafiador devido a uma miríade de fatores, incluindo a contabilização de todos os equilíbrios concorrentes dentro de um experimento de titulação, especialmente nos casos em que há falta de alças espectroscópicas discretas representando o peptídeo, o íon metálico d-block e suas interações.
Aqui, um conjunto robusto de experimentos é fornecido para a quantificação precisa da termodinâmica(II)-peptídeo. Este artigo foca no uso da espectroscopia de absorção eletrônica na presença e ausência de ligantes cromofóricos para fornecer a alça espectroscópica necessária em(II) e o uso de calorimetria isotérmica isotermal livre de rótulos. Em ambas as técnicas experimentais, um processo é descrito como responsável por todo o equilíbrio concorrente. Embora o foco deste artigo esteja em(II), o conjunto descrito de experimentos pode ser aplicado além das interações(II)-peptídeos, e fornecer uma estrutura para quantificação precisa de outros sistemas de metal-peptídeos em condições fisiologicamente relevantes.

O objetivo foi quantificar e corroborar a termodinâmica de(II) vinculando-se ao C-peptídeo utilizando as técnicas complementares de espectroscopia de absorção eletrônica e ITC. Devido à natureza robusta da espectroscopia de absorção eletrônica, foi realizada uma titulação direta de(II) em 300 μM C-peptídeo (Figura 1). A adição de 150 μM de(II) causou um aumento imediato na banda em 600 nm, atribuída à banda d-d de(II), e continuou a aumentar até 300 μM(II) foi adicionado. Além disso, acima d...

Este artigo foca no uso de espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria de titulação isotérmica para sondar e quantificar a termodinâmica de(II) vinculando-se a peptídeos e proteínas.

Quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(II) e Peptídeos na Presença e Ausência de Cromóforos

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Este método permitirá que o pesquisador teste sistemas difíceis de estudar, como peptídeos e íons metálicos de transição de primeira linha, ambos geralmente desafiadores usando aplicações mais padrão. A principal vantagem aqui é usar técnicas ortogonais porque elas se complementam bem, e isso pode dar mais insights sobre o sistema e nos ajudar a não perder nenhum fenômeno. O método detalhado neste vídeo é muito adequado para estudar outros sistemas.Embora mostremos com(II) e um peptídeo, ele pode ser usado para muitas interações diferentes de peptídeos metálicos e proteínas metálicas. Acho que a parte mais difícil será encontrar uma boa escolha tampão para o seu íon de metal e peptídeo. Eu consultaria a literatura para ver quais tampões foram usados por outros antes.demonstrando o procedimento será Sohee Choi, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório de pesquisa. Para começar, ligue o espectrômetro de absorção eletrônica e deixe aquecer por aproximadamente 15 a 20 minutos antes do uso. Em seguida, inicie o software espectrômetro e configure os parâmetros, como alcance de digitalização de 200 a 900 nanômetros, a faixa de varredura de 200 nanômetros por segundo e a linha de base de feixe duplo corrigida.Em seguida, colete uma linha de base sem cuvetas ou amostras nos caminhos do feixe. Usando duas cuvetas combinadas no espectrômetro de feixe duplo, carregue uma cuvette com 115 microliters de água ultrapura e a outra cuvette com 115 microliters da amostra de peptídeo, garantindo que não haja bolhas de ar nas cuvetas, pois estas interferirão com o sinal. Depois, coloque a cuvette com água ultrapura no feixe de referência e a cuvette com peptídeo no feixe de amostra.Em seguida, colete o espectro de absorção do peptídeo sem metal. Adicione uma quantidade substoichiométrica da solução(II) no cuvette com a amostra de peptídeo e registe o volume para análise posteriormente. Tubo suavemente para cima e para baixo para misturar a solução, evitando a geração de bolhas de ar.Depois de equilibrar por cinco minutos, coloque o cuvette de volta no suporte da célula da amostra e registe o espectro de absorção. Em seguida, repita a adição de alíquotas de(II) na solução de peptídeo para vários equivalentes e registe o volume total de(II) adicionado ao cuvette. Depois de inicializar o software como descrito anteriormente em duas cuvetas combinadas carregam uma cuvette com 115 microliters de água ultra pura e outras cuvette com 115 microliters da solução complexa cobre-fen.Coloque a cuvette com água no feixe de referência e a cuvette com solução complexa de cobre-phen no feixe de amostra. Em seguida, colete o espectro de absorção do complexo de ligantes metálicos. Depois, adicione uma quantidade estequiométrica de peptídeo à solução complexa cobre-fen e tubo suavemente que para cima e para baixo para misturar completamente enquanto cuidado para não introduzir quaisquer bolhas de ar.Em seguida, incubar a solução por cinco minutos para alcançar o equilíbrio. Coloque o cuvette de volta no suporte da célula da amostra e registe o espectro de absorção. Mais tarde, repita a adição de alíquotas de peptídeos na solução complexa de cobre-fen para vários equivalentes, e registe o volume de peptídeo adicionado para que a concentração diluída possa ser determinada.Primeiro ligue o ITC e inicie o software ITC para executar o instrumento. Após a primeira inicialização, recoloque o burette e siga as instruções na tela. Em seguida, remova a burette e a tampa da célula de referência.Em seguida, remova qualquer água da célula de referência e enxágue três vezes com 450 microliters de água ultra pura desgaseada. Desenhe lentamente água ultra pura para a marca de 450 microliters de uma seringa de carga tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na seringa. Em seguida, insira a seringa de carregamento na célula de referência até que esteja a aproximadamente um milímetro da parte inferior e injete lentamente parte da solução até que 150 microliters permaneçam na seringa de carga.Depois, mova o êmbolo da seringa de carga rapidamente para cima e para baixo por aproximadamente 25 microliters várias vezes para desalojar quaisquer bolhas na superfície celular. Em seguida, injete lentamente até que o êmbolo atinja a marca de 100 microliters na seringa de carregamento, distribuindo assim um total de 350 microliters de água ultra pura na célula de referência e substitua a tampa da célula de referência. Depois de remover qualquer solução residual da célula amostra, carregue 450 microliters de 10 mililitros EDTA usando uma seringa de carregamento e mergulhe por 10 minutos para garantir que os íons metálicos sejam removidos porque o EDTA ligará metais de traço.Depois de remover a solução EDTA enxágue completamente a seringa de carregamento com quantidades abundantes de água ultra pura. Limpe o ITC de acordo com as instruções do fabricante enxaguando a célula amostral com água ultra pura. Remova qualquer água residual da célula amostral e, em seguida, condicionar a célula amostrada enxaguando com 450 microliters de buffer pelo menos três vezes.Em seguida, remova o tampão residual que está condicionando a célula amostral e carregue a solução de peptídeo na célula amostral usando a seringa de carregamento. Em seguida, enxágue a seringa de titulação com 200 microliters da solução tamponada, removendo primeiro o êmbolo. Usando uma micro pipeta, pipeta a solução tampão através do orifício na parte superior da seringa de titulação de vidro através da seringa e para fora da agulha abaixo.Mais tarde, insira totalmente o êmbolo na seringa de titulação. Em seguida, mergulhe a ponta da agulha de seringa de titulação na solução metálica e puxe lentamente o êmbolo para cima fazendo com que a solução metálica encha a seringa e resultando em um volume vazio na parte superior da parte de vidro da seringa de titulação. Para remover o volume vazio gire a seringa de titulação paralela ao chão.Em seguida, remova o êmbolo e incline ligeiramente a parte de vidro em direção ao chão. Agite suavemente a seringa de titulação para que a solução se mova para a parte de vidro da seringa de titulação e preencha a maior parte do volume vazio. Mas certifique-se de que dois ou três microliters de volume vazio permaneçam.Mantendo a seringa paralela ao chão reinserir o êmbolo. Em seguida, segure a seringa de titulação e mergulhe a ponta da agulha de volta na solução metálica. Em seguida, empurre o êmbolo para baixo até que o ar deixe de sair da agulha e carregue a seringa de titulação puxando lentamente o êmbolo para pouco acima da marca de 50 microliters, mantendo a ponta da agulha na solução.Insira cuidadosamente a parte de vidro da seringa de titulação na burette e enrosque até que o dedo esteja apertado. Depois, utilizando um limpador delicado de serviço leve, absorva a solução que sai da seringa de titulação devido à compressão do êmbolo sem tocar na ponta da agulha. Em seguida, insira a burette com uma seringa de titulação na célula amostral e fixe-a com segurança.Para configurar os parâmetros do software ITC, selecione o Controle de Instrumentos. Defina a taxa de agitação e a temperatura. Em seguida, em Detalhes do Experimento, entre na seringa e nas concentrações celulares em unidades milimães.Em seguida, na seção Método de Experimento selecione Titulação Incremental. Clique em Configuração e especifique 20 injeções de 2,5 microliters e se for necessário mais resolução para observar o evento de ligação aumentar o número de injeções e diminuir o volume por injeção. Depois, insira o espaçamento de tempo entre cada injeção para que seja longo o suficiente para que o sinal se equilibre e retorne à linha de base, normalmente 300 segundos.Em seguida, clique no botão Executar para iniciar o experimento e especifique onde os dados são salvos. A titulação de(II) foi realizada em C-Peptídeo demonstrando que a adição de 150 micromolar de(II) causou um aumento imediato na banda em 600 nanômetros atribuídos à banda d-d de(II) e continuou a aumentar até que 300 milmolar(II)foi adicionado. Além disso, acima de 300 micromolar(II) não aumentou a absorção da proibição d-d indicando saturação e que(II)se liga ao C-Peptídeo em um complexo 1:1 com um valor de log K de mais de seis.C-Peptídeo foi titulado em aproximadamente 10 complexos de cobre-fenimene micromolar e a absorção da faixa de transferência de carga em 265 nanômetros diminuiu indicando que o C-Peptídeo foi capaz de quilatar(II) do ligante de fenanthrolina com um valor de log K de 7,4 a 7,8. O termograma ITC mostra a titulação de 1,4 milimiliar(II) em 154 micromolar C-Peptídeo em 15 milimiliar de mPS tampão. Verificou-se que a afinidade de ligação tinha um valor de log K de oito com alteração na entalpia como 8 kilojoules por toupeira.Gibbs energia livre como menos 46 kilojoules por toupeira, e mudança na entropia como 120 joules por toupeira por kelvin. Uma titulação controlada de 1,4 milimalha(II) em 15 milimilhas de buffer MOPS na ausência de C-Peptídeo não mostra nenhuma vinculação no termograma. Eu diria que ter certeza de que está tudo limpo.Se houver íons metálicos ou peptídeos que sobraram de experimentos anteriores, pode afetar drasticamente a estequiometria e fornecer competição desconhecida nos experimentos de ligação. O dicromaísmo circular é outro método para estudar as interações de peptídeos metálicos ou proteínas metálicas porque olha para a quiralidade. A espectrometria em massa também pode interrogar esses complexos olhando para mudanças na massa.Este conjunto de técnicas tem sido usado por muitos laboratórios que estudam íons metálicos interagindo com peptídeos ou proteínas.

quantifying-binding-interactions-between-cu-ii-peptide-residues

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Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Aqui, o acúmulo de íons cuproso em um solução em um experimento de modelo e uma análise baseada em medições quantitativas de chapeamento de sulfato de cobre são descritos. Esta experiência reproduz o processo de acumulação de íons cuproso no chapeamento banho.

Acumulação e análise de íons cuproso em um chapeamento de solução de sulfato de cobre

A mobilidade do íon-espectrometria maciça e as técnicas de modelagem molecular podem caracterizar o desempenho quelante do metal seletivo de peptídeos metal-obrigatórios projetados e do methanobactin Copper-Binding do peptide. O desenvolvimento de novas classes de peptídeos quelantes metálicos ajudará a levar a terapêutica para doenças associadas ao desbalanceamento de íons metálicos.

Técnicas de espectrometria de massa de mobilidade de íons para determinação da estrutura e mecanismos de reconhecimento de íons metálicos e atividade redox de oligopeptídeos de ligação metálica

Este artigo descreve um protocolo experimental usando espectrometria eletrospray-ion mobilidade-massa, cálculos quânticos semi-empíricos e dissociação induzida por colisão limiar resolvida pela energia para medir a termoquímica relativa da dissociação de complexos metálicos ternários relacionados.

Estudos Termoquímicos de Ni(II) e Zn(II) Complexos Ternários utilizando Espectrometria de Ion Mobility-Mass

Aprenda a quantificar a termodinâmica de ligação de Cu(II) a peptídeos usando espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria de titulação isotérmica. Este método combina técnicas ortogonais para fornecer insights abrangentes sobre interações metal-peptídeo em sistemas bioquímicos.

Quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(II) e Peptídeos na Presença e Ausência de Cromóforos

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