Name: Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda a estababelecer organoides de dente humano para estudar biologia de células-tronco dentárias e regeneração tecidual. Este modelo robusto permite expandir células epiteliais e investigar formação do esmalte.

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Somos gratos a todos os membros da equipe da Cirurgia Oral e Maxilofacial (MKA) da UZ Leuven, bem como aos pacientes, por sua ajuda inestimável na coleta de terceiros molares recém-extraídos. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Reinhilde Jacobs e à Dra. Este trabalho foi apoiado por subvenções da KU Leuven (BOF) e FWO-Flanders (G061819N). L.H. é um Ph.D. Fellow (1S84718N).

<ol><li>Yu, T., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+tooth+development%2C+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair.</a> Development (Cambridge). 147 (2), (2020).</li>
<li>Arrow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+enamel+defects%2C+caries+experience+and+oral+health-related+quality+of+life%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Dental+Journal%22%5BJournal%5D)">Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study.</a> Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitsiadis%2C+TA+%22Dental+Stem+Cells%3A+Regenerative+Potential.+Stem+Cell+Biology+and+Regenerative+Potential.+Stem+Cell+Biology+and+Regenerative+Medicine%22">Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine</a>. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+a+new+era+in+dentistry%3A+stem+cell-based+approaches+for+tooth+and+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration.</a> Frontiers in Physiology. 7, 357(2016).</li>
<li>Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+dental+stem+cell-based+research+approaches%3A+the+future+of+dentistry%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry.</a> Stem Cells International. 2016, 7231038(2016).</li>
<li>Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+epithelial+cell+rests+of+malassez+can+differentiate+into+ameloblast-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).</li>
<li>Davis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epithelial+cell+rests+of+Malassez+on+the+bicentennial+of+their+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Dentistry%22%5BJournal%5D)">A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description.</a> Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).</li>
<li>Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adult+epithelial+stem+cells+from+the+periodontal+ligament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament.</a> Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).</li>
<li>Kim, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+establishment+of+dental+epithelial-like+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2F+epithelial+rests+of+malassez+cell+line+from+human+periodontium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium.</a> Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+the+stem+cell+markers+in+human+hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2FEpithelial+rests+of+Malassez+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells.</a> Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).</li>
<li>Tsunematsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+odontogenic+epithelial+cells+derived+from+epithelial+rests+of+Malassez+possess+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).</li>
<li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+and+application+of+3D-organoid+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li>
<li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+pituitary+as+a+novel+research+model+toward+pituitary+stem+cell+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Schutgens, F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+tools+for+understanding+biology+and+treating+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases).</a> Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).</li>
<li>Hemeryck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+human+tooth+showing+epithelial+stemness+phenotype+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153(2022).</li>
<li>Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+organoids%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Oral organoids: progress and challenges.</a> Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
<li>Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+rests+of+malassez+contain+unique+stem+cell+populations+capable+of+undergoing+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).</li>
<li>Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath.</a> Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).</li>
<li>Fukumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+functions+of+enamel+matrices+in+calcified+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Dental+Science+Review%22%5BJournal%5D)">New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues.</a> Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).</li>
<li>Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERM+functions%2C+EGF+and+orthodontic+movement+or+Why+doesn%27t+orthodontic+movement+cause+alveolodental+ankylosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Press+Journal+of+Orthodontics%22%5BJournal%5D)">ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis.</a> Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).</li>
<li>Guajardo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+epidermal+growth+factor+in+cat+paradental+tissues+during+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Orthodontics+and+Dentofacial+Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+quantitative+reduction+of+rests+of+Malassez+according+to+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age.</a> Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+Model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: Model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADULT+%28acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth%29+syndrome%3A+a+case+report+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Dermatology+Online+Journal%22%5BJournal%5D)">ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India.</a> Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194(2018).</li>
<li>Future Health Biobank. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://futurehealthbiobank.com/ch-en/">https://futurehealthbiobank.com/ch-en/</a> (2022).</li>
<li>Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+co-culture+of+human+intestinal+organoids+and+lamina+propria-derived+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100519(2021).</li>
<li>Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+cell+communication+in+cancer+with+organoids%3A+Making+the+complex+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166(2020).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyisocyanide+hydrogels+as+a+tunable+platform+for+mammary+gland+organoid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation.</a> Advanced Science. 7 (18), 2001797(2020).</li>
<li>Mollaki, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+challenges+in+organoid+use%5BTitle%5D)+AND+%22BioTech%22%5BJournal%5D)">Ethical challenges in organoid use.</a> BioTech. 10 (3), 12(2021).</li>
</ol>

O autor correspondente garante que todos os autores tenham divulgado todo e qualquer conflito de interesse.

Este protocolo descreve a geração eficiente e reprodutível de organoides a partir do dente humano. Para nosso conhecimento, esta é a primeira metodologia para o estabelecimento de organoides de conceito atual (epitelial) a partir do tecido dentário humano. Os organoides são expansíveis a longo prazo e apresentam um fenótipo de caule epitelial dentário, duplicando DESCs previamente relatados no compartimento ERM do DF7. Além disso, os organoides replicam características funcionais de DESC/ERM, incl...

Os dentes têm papéis essenciais na mastigação alimentar, fala e bem-estar psicológico (autoimagem). O dente humano consiste em tecidos altamente mineralizados de densidade e durezavariadas 1. O esmalte dentário, o principal componente da coroa dentária, é o tecido mineralizado mais alto do corpo humano. Durante a formação do esmalte (amelogênese), quando os dentes se desenvolvem, as células-tronco epiteliais dentárias (DESCs) se diferenciam em células formadoras de esmalte (ameloblasts). Uma vez formado, o esmalte raramente é reparado ou renovado devido à perda apoptótica dos ameloblastas no início da erupção dentária1. A restauração do tecido esmalte danificado, causado por trauma ou doença bacteriana, é atualmente realizada com materiais sintéticos; no entanto, estes são incomodados com deficiências importantes como microleakage, osseointegração e ancoragem inferiores, vida útil finita e falta de reparo totalmente funcional2. Assim, uma cultura robusta e confiável de DESCs humanos com capacidade para gerar ameloblasts e potencial para produzir tecido mineralizado seria um grande avanço no campo regenerativo dental.
O conhecimento sobre fenótipo e função biológica do DESC humano são escassos 3,4,5. Curiosamente, foram propostos DESCs de dentes humanos para existir nos Repousos de Célula Epitelial de Malassez (ERM), aglomerados celulares presentes dentro do folículo dentário (DF), que circunda dentes não rompidos, e permanece presente no ligamento periodontal ao redor da raiz uma vez que o dente entra em erupção1. Células ERM co-cultivadas com polpa dentária foram encontradas para se diferenciar em células semelhantes ao ameloblast e gerar tecido semelhante ao esmalte6. No entanto, estudos profundos sobre o papel específico das células ERM na geração de esmalte (re-) foram limitados devido à falta de modelos de estudo confiáveis7. Os sistemas atuais de cultura in vitro ERM são dificultados pela vida útil limitada e perda rápida de fenótipo nas condições 2D usadas standardmente 8,9,10,11,12. Assim, é fortemente necessário um sistema in vitro tratável para expandir, estudar e diferenciar deSCs humanos.
Durante a última década, uma técnica poderosa para cultivar células-tronco epiteliais in vitro foi aplicada com sucesso a vários tipos de tecidos epiteliais (humanos) para estudar sua biologia, bem como a doença 13,14,15,16. Essa tecnologia permite que as células-tronco epiteliais do tecido se auto-desenvolvam em construções de células 3D (ou seja, organoides) quando semeadas em uma matriz extracelular (ECM) -imitando andaimes (tipicamente, Matrigel) e cultivadas em um meio definido replicando a sinalização do nicho de células-tronco do tecido e/ou embriogênese. Os fatores típicos de crescimento necessários para o desenvolvimento organoide incluem fator de crescimento epidérmico (EGF) e ativadores de integração MMTV do tipo wingless (WNT) 14,15,16. Os organoides resultantes são caracterizados pela fidelidade duradoura na imitação das células-tronco epiteliais originais do tecido, bem como alta expansão, mantendo seu fenótipo e propriedades funcionais, superando assim a disponibilidade de tecido humano primário muitas vezes limitada como adquirido da clínica. Para estabelecer organoides, o isolamento das células-tronco epitelial do tecido heterogêneo (ou seja, compreendendo outros tipos de células, como células mesenquimais) antes da cultivo não é necessário, pois as células mesenquimais não se ligam ou prosperam no ECM, eventualmente resultando em organoides puramente epiteliais 13,16,17,18,19 . Esta tecnologia promissora e versátil levou ao desenvolvimento de modelos organoides múltiplos de vários tecidos epiteliais humanos. No entanto, os organoides derivados do dente humano, valiosos para o estudo profundo do desenvolvimento dentário, regeneração e doenças, ainda não foram estabelecidos20,21. Recentemente conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido DF a partir de terceiros molares (dentes do siso) extraídos de pacientes adolescentes19.
Aqui, descrevemos o protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano adulto (ou seja, do DF do terceiro molar) (Figura 1A). Os organoides resultantes expressam marcadores de haste associados ao ERM, sendo expansíveis a longo prazo. Curiosamente, ao contrário da maioria dos outros modelos organoides, o EGF tipicamente necessário é redundante para o desenvolvimento e crescimento organoide robusto. Curiosamente, os organoides de caule apresentam propriedades de diferenciação de ameloblast, imitando características e processos do ERM/DESC que ocorrem in vivo. O novo e único modelo organoide descrito aqui permite explorar a biologia, plasticidade e capacidade de diferenciação do DESC e abre as portas para dar os primeiros passos em direção a abordagens regenerativas dentárias.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120.086</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano de 48 poços</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SML0788</tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Bovina (grau de cultura celular)</td> <td>Serva</td><td>47330.03</td><td></td></tr><tr><td>AMELX anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365284</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15200018</td><td></td></tr><tr><td>B27 (sem vitamina A)</td> <td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td></td>7202191</tr><tr><td>Catalase de fígado bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>CD44 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab34485</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 &micro; m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Toxina da cólera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>CK14 anticorpo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>VWR</td><td>6310146</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1:1 F12 sem Fe</td><td>Invitrogen</td><td>074-90715A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM pó alta glicose</td><td>Gibco</td><td>52100039</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663 - 10ML</td><td></td></tr><tr><td>Estação de trabalho de embutimento, 220 a 240 Vac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto, &ge; 99,8% (EtOH)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>E / 0650DF / 15</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (= FGF básico)</td> <td>R & D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-25</td><td></td></tr><tr><td>GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RTN350-1KT</td><td>Inclui 1% de &beta;-mercaptoetanol dissolvido em tampão de lise</td></tr><tr><td>Pipeta de vidro Pasteur</td><td>Niko Mechanisms</td><td>170-40050</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>VWR</td><td>101194M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632 (inibidor de ROCK, RI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina do pâncreas</td><td>bovino Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA012696</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (fator de crescimento reduzido; sem fenol vermelho)</td> <td>Corning</td><td>15505739</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de microscópio</td> Unidade de filtro de seringa <td>Millex-GV J1800AMNZ</td><td></td>da <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>, 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SLGV033R</td><td></td></tr><tr><td>Águia média essencial mínima (&alpha; MEM)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>camundongo IgG (Alexa 555) anticorpo secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo P63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Pap Pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>Caneta de marcação</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA), 16%</td> <td>Merck</td><td>8.18715</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (Pen / Strep)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td> <td>de PetriCorning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tampolado com solução salina (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (P20, P200, P1000)</td> <td>Eppendorf ou outros</td><td>2231300006</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de plástico (3.5&nbsp; mL)</td> <td>Sarstedt</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>Coelho IgG (Alexa 488) anticorpo secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>RSPO1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (p38i)</td> <td>Biotechne (Tocris)</td> <td>1264</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi (lâmina cirúrgica)</td> <td>Swann-Morton</td><td>207</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>R & D Systems</td><td>464-SH-200</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de silicone (bloco de aquecimento)</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sódio (C3H3NaO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab92494</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Sistema <td>de PCR em Tempo Real</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Unidade de Filtro Superior de Tubo de Centrífuga Estéril, 0.22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 1000 &mu; L ponteiras de pipeta com filtro</td><td>Greiner</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 20 &mu; L ponteiras de pipeta com filtro</td><td>Greiner</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 200 &mu; L ponteiras de pipeta com e sem filtro</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>Estéril H2O</td><td>Fresenius</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III supermix de síntese de primeira fita</td><td>Invitrogen</td><td>11752-050</td><td>Kit de transcrição reversa</td></tr><tr><td>Processador de tecidos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>12505356</tr><tr><td>Transferrin</td><td>Serva</td><td>36760.01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem Vectashield+DAPI</td><td>Labconsult NV</td><td>H-1200</td><td>Meio de montagem antifade com DAPI</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>5036-WN-500</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos, 99%, para bioquímica e histologia</td><td>VWR</td><td>2,89,75,325</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

Os dentes são de fundamental importância na vida não só para a mastigação alimentar e a fala, mas também para o bem-estar psicológico. O conhecimento sobre desenvolvimento dentário humano e biologia é escasso. Em particular, pouco se sabe sobre as células-tronco epiteliais do dente e sua função. Conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido dentário humano (ou seja, folículo dentário, isolado dos dentes do siso extraído). Os organoides são robustos e expansíveis a longo prazo e recapitulam o compartimento de células-tronco do dente humano proposto em termos de expressão de marcador, bem como atividade funcional. Em particular, os organoides são capazes de desdobrar um processo de diferenciação ameloblast como ocorre in vivo durante a amelogênese. Este modelo organoide único fornecerá uma ferramenta poderosa para estudar não apenas o desenvolvimento dentário humano, mas também a patologia dentária, e pode abrir caminho para a terapia regenerativa dentária. Substituir dentes perdidos por um dente biológico baseado neste novo modelo organoide pode ser uma alternativa atraente para a implantação padrão atual de materiais sintéticos.

Desenvolvimento organoide dentário Fornecemos um protocolo detalhado para estabelecer culturas organoides a partir do tecido DF humano adquirido após a extração do dente do siso (Figura 1A). O DF isolado é enzimaticamente e mecanicamente dissociado. As células obtidas são cultivadas dentro da BMM em mídias que foram empiricamente definidas para o desenvolvimento e crescimento organoide ideal (meio organoide dentário; TOM)19.
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Apresentamos um protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano. Os organoides são robustamente expansíveis e recapitulam as células-tronco epiteliais do dente, incluindo sua capacidade de diferenciação de ameloblast. O modelo organoide único fornece uma ferramenta promissora para estudar a biologia dentário humano (células-tronco) com perspectivas para abordagens regenerativas dentárias.

Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

Este novo modelo organoide derivado do dente humano fornece a primeira ferramenta poderosa para decifrar a biologia de células-tronco dentárias humanas com perspectivas para aplicações regenerativas dentárias. Atualmente, este modelo organoide dentário é a única ferramenta disponível para crescer e expandir de forma confiável e robusta células-tronco epiteliais. Este protocolo organoide pode ser aplicado para estabelecer modelos de pesquisa, não apenas de dentes saudáveis, mas também doentes, como tumores dentários e impacto bacteriano.A exploração de tais modelos de doenças pode descobrir novos alvos terapêuticos. Este modelo organoide é altamente instrumental na decifração do processo de formação de esmalte no dente humano, podendo permitir a construção de partes dentárias como o esmalte para fins generativos. Demonstrando o procedimento estará Lara Hemeryck, doutoranda do meu grupo de pesquisa.Para começar, colete os terceiros molares com folículos dentários associados no meio de coleta colocado no gelo e transfira o conteúdo dos tubos para uma placa de Petri. Segure o dente com uma pinça e isole cuidadosamente os folículos dentários usando uma lâmina cirúrgica. Lave o sangue restante dos folículos dentários colocando brevemente os tecidos folículos dentários no primeiro poço de 70% de etanol por 20 segundos, depois transfira-o para a próxima placa de etanol da morte por 20 segundos e mais para o terceiro poço de etanol.Continue enxaguando-o em poços salinos tamponados com fosfato três vezes seguidos de enxaguar os folículos dentários nos três poços de coleta de folículos dentário restantes por um máximo de 20 minutos no total. Transfira os folículos dentários enxaguados para uma nova placa de Petri. Corte um pequeno pedaço de um dos folículos dentários para uma fixação de paraformaldeído e armazene-o em um tubo de microcentrifusagem contendo 500 microliters de meio de coleta por um máximo de seis horas.Pique o resto dos folículos dentários em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio de dissociação pré-armado, em seguida, incubar o tubo a 37 graus Celsius por duas horas em banho-maria. A cada 15 minutos, pipeta os folículos dentários desintegráciação média e misture-se e para baixo usando uma pipeta de vidro para acelerar a desintegração do tecido. Quando pedaços de folículos dentários não forem mais observados, prossiga com a dissociação usando uma pipeta Pasteur estreita e polida pelo fogo.Enquanto isso, prepare 10 mililitros de médio A contendo 100 microliters de DNase e adicione cinco mililitros deste meio a cada tubo com folículos dentário dissociados. Incubar por um minuto em temperatura ambiente. Enxágüe o filtro com um mililitro de médio A.Combine os vários tubos de folículos dentários dissociados de um paciente nesta etapa e centrifugar a suspensão celular filtrada a 200 vezes g por 10 minutos a 4 graus Celsius.Remova o supernatante. Resuspenja a pelota em um mililitro de meio definido sem soro e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifus de 1,5 mililitro. Calcule a concentração celular usando um contador celular automatizado e calcule o número de poços que podem ser semeados.A mistura final é composta de suspensão celular e matriz de membrana de porão em uma proporção de 30 a 70. Remova a quantidade apropriada de supernasce e resuspensá-lo lentamente para obter uma proporção de 70 a 30 de matriz de membrana de porão gelado para suspensão celular para chapeamento. Uma vez resuspendido na matriz de membrana do porão, mantenha o tubo de microcentrifuuge no gelo para evitar a solidificação da matriz da membrana do porão.Pipet os 20 microliters de gotículas de matriz de membrana do porão no centro da placa de cultura pré-aquecido de 48 poços. Vire a placa de cabeça para baixo e coloque-a para solidificar em uma incubadora de dióxido de carbono de 1,9% a 37 graus Celsius por 20 minutos. Adicione o inibidor de quinase associado à roda e a anfotericina B ao meio organoide dentário e pré-aquecimento do meio em um banho de água de 37 graus Celsius.Pegue a placa de 48 poços da incubadora. Coloque-o ereto e adicione 250 microliters do meio pré-armado preparado para cada poço com uma gotícula de matriz de membrana do porão contendo as células e devolva a placa à incubadora de dióxido de carbono. Para refrescar o meio, incline a placa em um ângulo de 45 graus.Remova suavemente o meio anterior, evitando tocar na gotícula da matriz da membrana do porão e adicione 250 microliters de novo meio organoide dentário pré-armado a cada dois ou três dias. Para realizar a passagem dos organoides, remova o meio dos poços com organoides e acumule até quatro poços confluentes. Para coletar os organoides, adicione 400 microliters de meio definido sem soro frio por poço diretamente na gotícula da matriz da membrana e pipeta repetidamente o meio para cima e para baixo até que toda a gotícula seja desalojada.Se os poços estiverem agrupados, transfira os 400 microliters do primeiro poço para o próximo para desalojar o organoide contendo gotículas. Transfira o conjunto organoide desalojado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 microliter e repita a adição de meio definido sem soro até que todas as estruturas organoides sejam coletadas dos poços. Centrifuá-lo a 200 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius.Remova o supernatante do tubo de centrífuga e resuspenque a pelota em uma alíquota pré-enlata do TrypLE Express. Adicione 400 microliters de meio definido sem soro para inativar a enzima e centrífugue a 200 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Remova o supernatante.Pré-cubra uma ponta com meio definido sem soro e suspenda a pelota organoide em condições estéreis. Suspenda a pelota em 200 microliters de meio definido livre de soro gelado para o método de baixa passagem. Empurre a ponta de pipeta completamente esvaziada contra a parte inferior do tubo de micro centrífuga para reduzir seu diâmetro.Pipeta para cima e para baixo por cinco minutos para interromper mecanicamente os organoides. Para o método de passagem mais alto, resuspenque a pelota em 700 microliters de meio definido sem soro frio com ponta P1000. Adicione uma dica P200 a esta ponta P1000 e pré-casaco com meio definido sem soro frio.Evite a formação de bolhas de ar ajustando a configuração de volume da pipeta. Aspire pelo menos 90% do volume médio com organoides e pipeta para cima e para baixo por cinco minutos para interromper mecanicamente os organoides. Os organoides normalmente se desenvolvem duas semanas após a semeadura de células folículos dentárias.Os organoides são expansíveis a longo prazo até 11 passagens. A semeadura de cerca de 20.000 células por gotícula de matriz de membrana porão produz uma densidade ideal de organoides, enquanto a semeadura de números celulares mais altos leva ao crescimento organoide subótimo com organoides semelhantes em densidade muito alta devido ao espaço insuficiente para crescer. Os organoides desenvolvidos mostram uma aparência densa e contêm células que apresentam uma alta proporção nucleocitoplasmática.Além disso, os organoides expressam o marcador ERM citokeratin 14 confirmando sua origem epitelial e outros marcadores ERM propostos, como P63, CD44 e integrin alfa-6. Organoides expressam SOX2, um conhecido marcador DESC em camundongos. Curiosamente, o principal componente da matriz de esmalte, a amelogenina, também expressa nos organoides.Os organoides mantêm seu fenótipo de haste ERMM durante a passagem, como mostrado pela expressão estável dos marcadores. Para o crescimento ideal de organoides a longo prazo, é essencial usar os métodos de passagem recomendados ou a passagem baixa ou os métodos de passagem mais elevados. Uma vez formados, os organoides podem ser usados para examinar ainda mais o processo de amelogênese e a deposição da matriz de esmalte atualmente não alcançada na pesquisa odontológica.Essa técnica permite a exploração da biologia das células-tronco epiteliais dentárias, o processo de formação do esmalte e a interação com o mesenquime dentário, uma interação essencial para a correta formação do dente.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.

Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Este protocolo apresenta um método para a cultura e crescimento 3D de células semelhantes a ameloblastos em microgravidade para manter sua forma alongada e polarizada, bem como a expressão de proteínas específicas do esmalte. Condições de cultura para a cultura de construções de engenharia periodontal e órgãos pulmonares em microgravidade também são descritas.

Propagação de Células e Órgãos Dentários e Respiratórios em Microgravidade

O folículo dentário contém uma população epitelial e células mesenquimais. A população epitelial foi selecionada da população heterogênea de folículos dentário, proporcionando um meio de cultura distinto. As células epiteliais sobreviveram e formaram colônias em um meio livre de soro.

Isolamento de Células Epiteliais do Folículo Dental Humano

Este protocolo descreve os principais passos para gerar e caracterizar organoides 3D oro-esofágicos murinos que representam lesões normais, pré-neoplásicas e de carcinoma espinocelular induzidas por carcinogênese química.

Modelagem do carcinoma epidermóide orco-esofágico em organoides 3D

A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.

Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Um exemplo de terapia genética adenoviral nas córneas cultivadas de órgãos diabéticos humanos é apresentado para a normalização da cicatrização tardia de feridas e expressão de marcadores de células-tronco epiteliais marcadamente reduzida nessas córneas. Também descreve a otimização desse processo em culturas epiteliais límbicas enriquecidas com células-tronco.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

Aprenda a estababelecer organoides de dente humano para estudar biologia de células-tronco dentárias e regeneração tecidual. Este modelo robusto permite expandir células epiteliais e investigar formação do esmalte.

Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa

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