Name: Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a medir a mecânica de conjuntos de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas. Este método permite investigar a dinâmica de proteínas motoras com alta precisão em sistemas citoesqueléticos.

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Este trabalho é apoiado em parte pela University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), pela University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), pelo Mississippi Space Grant Consortium sob o número de concessão NNX15AH78H (JCW, DNR) e pela American Heart Association sob o número de concessão 848586 (DNR).

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Um estudo in vitro utilizando pinças ópticas combinadas com imagens de fluorescência foi realizado para investigar a dinâmica de conjuntos de miosina interagindo com filamentos de actina. Os feixes de actina-miosina-actina foram montados usando miosina muscular II, actina de rodamina na parte inferior do feixe e na superfície da lâmina de cobertura e filamentos de actina biotinilados marcados com 488 no topo do feixe. A proteína actina do músculo coelho foi polimerizada e estabilizada usando tampões gerais de ac...

As proteínas motoras são essenciais à vida, convertendo energia química em trabalho mecânico 1,2,3. Os motores de miosina interagem com os filamentos de actina dando passos ao longo dos filamentos semelhantes a uma trilha, e a dinâmica das redes de actina-miosina realiza a contração muscular, a motilidade celular, o anel contrátil durante a citocinese e o movimento de carga dentro da célula, entre outras tarefas essenciais 3,4,5,6,7,8 . Como as miosinas têm tantos papéis essenciais, a falha na funcionalidade da rede miosina-actina pode levar ao desenvolvimento de doenças, como mutações na cadeia pesada da miosina que causam hipercontratilidade cardíaca na cardiomiopatia hipertrófica (CMH)9,10,11,12,13,14 . Na contração muscular, os motores individuais de miosina cooperam entre si, trabalhando como um conjunto para fornecer a energia mecânica necessária que realiza o deslizamento relativo das FAs 4,15,16,17,18. Os motores de miosina formam pontes transversais entre as FAs e utilizam alterações conformacionais devido ao seu ciclo mecanoquímico para se moverem coletivamente em direção à extremidade farpada dos filamentos alinhados 17,18,19,20,21.
O desenvolvimento de ensaios quantitativos de motilidade in vitro no nível do SM usando técnicas como o aprisionamento óptico facilitou a coleta de detalhes sem precedentes de como os motores individuais de miosina funcionam, incluindo a medição da geração de força SM e os tamanhos dos passos 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. desenvolveram o ensaio de aprisionamento óptico "três contas" ou "halteres" para investigar a mecânica de geração de força de motores de miosina II simples23,31. Como a miosina II muscular trabalha em equipes para contrair FAs, mas não é processiva no nível do SM, a orientação do ensaio de aprisionamento óptico teve que ser rearranjada a partir da abordagem clássica do grânulo ligado ao motor32. Para formar o ensaio de halteres, duas armadilhas ópticas foram utilizadas para segurar uma FA sobre um motor de miosina ligado a um cordão preso por deslizamento de cobertura, e a saída de força pelo motor único foi medida através de movimentos da FA dentro da armadilha23.
No entanto, as forças SM e o uso de uma única orientação motor/ensaio de filamento único não fornecem uma imagem completa sobre a geração de força no nível do sistema, uma vez que muitas proteínas motoras, incluindo a miosina II, não funcionam isoladamente e muitas vezes não funcionam como uma soma de suas partes 15,16,17,32,33,34,35,36 . Estruturas mais complexas que incluam mais de um motor interagindo com mais de um filamento são necessárias para melhor compreender a sinergia das redes de filamentos de miosina e actina15,32. A orientação do ensaio de halteres tem sido explorada para investigar a geração de força de pequenos conjuntos por ter múltiplas miosinas ligadas a um grânulo ou usando um filamento de miosina espessa ligado a uma superfície e permitindo que os motores interajam com a FA suspensa 4,23,34,37,38,39,40.
Outros pequenos ensaios de conjunto incluem um ensaio de deslizamento de filamento in vitro em que os motores de miosina são revestidos em uma superfície de deslizamento de cobertura, e um talão ligado a um FA é usado para sondar a força gerada pela equipe de motores 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . Em ambos os casos, as miosinas estão ligadas a uma superfície rígida – grânulos ou deslizamento de cobertura – e utilizam um AF. Nesses casos, os motores não são capazes de se mover livremente ou se comunicar uns com os outros, nem ter miosinas rigidamente ligadas reflete o ambiente hierárquico e compatível em que os motores trabalhariam juntos no sarcômero32. Estudos anteriores sugeriram que a miosina II pode sentir seu ambiente e adaptar-se de acordo com as mudanças nas condições de concentração viscoelástica ou motora, alterando características como geração de força e razão de serviço41,44,45. Assim, há uma necessidade de desenvolver um ensaio de armadilhagem óptica que promova e capture a comunicação motora e a conformidade com o sistema para pintar uma imagem mais realista dos fundamentos mecanicistas da geração de força do conjunto de miosina II.
Aqui, desenvolvemos um método para acoplar estrutura hierárquica in vitro com aprisionamento óptico, formando feixes de actomiosina ou sanduíches consistindo de múltiplos motores de miosina interagindo entre dois filamentos de actina. Esta geometria de ensaio modular tem a capacidade de investigar diretamente como os fatores moleculares e ambientais influenciam a geração de força de miosina do conjunto. Além disso, investigar os mecanismos de geração de força por meio desses conjuntos de actina-miosina tem o potencial de auxiliar na modelagem e compreensão de como tarefas celulares em larga escala, como a contração muscular, se propagam a partir do nível molecular 9,10,13.

<table><tbody><tr><td>Proteína de actina (biotina): músculo esquelético</td><td>Citoesqueleto</td><td>AB07-A</td><td>Proteína de actina biotinilada</td></tr><tr><td>Proteína de actina, músculo esquelético de coelho</td><td>Citoesqueleto</td><td>AKL99-A</td><td>Proteína de actina</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Estabilizador de actina e coloração Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher scientific</td><td>BP413-25</td><td>Necessário para actina montagem e motilidade da miosina</td></tr><tr><td>Beta-D-glicose</td><td>Fisher</td><td>scientific MP218069110</td><td>Parte do sistema de eliminação de oxigênio usado para reduzir o fotobranqueamento durante a imagem de fluorescência</td></tr><tr><td>Bloqueador de grau de borrão (caseína)</td> <td>Biorad</td><td>1706404</td><td>Usado para bloquear a superfície da ligação não específica</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>C79500</td><td>Cloreto de cálcio, fornece o controle necessário sobre a dinâmica da rede de actina miosina</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Fisher scientific</td><td>ICN10040280</td><td>Parte do sistema de eliminação de oxigênio usado para reduzir o fotobranqueamento durante a imagem de fluorescência</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>Usado para fazer células de fluxo</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher scientific</td><td>AC327190010</td><td>Usado para preparação</td></tr> <tr><td>de tampãoEtanol</td><td>Fisher scientific</td><td>A4094</td><td>Regent usado para limpeza de lamínulas</td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>Fisher scientific</td><td>34-538-610KU</td><td>Parte do sistema de eliminação de oxigênio usado para reduzir o fotobranqueamento durante a imagem de fluorescência</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>Usado para preparação de tampão</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher scientific</td><td>P250-1</td><td>Usado para gravar lamínulas e ajustar tampão pH</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>Usado para preparação de tampão</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>Usado para fazer células de fluxo</td></tr><tr><td>Proteína de miosina II: músculo esquelético de coelho</td><td>Citoesqueleto</td><td>MY02</td><td>Proteína motora de miosina de comprimento total isolada do músculo esquelético de coelho</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>Instrumento de aprisionamento óptico</td></tr><tr><td>Poli-l-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Instalações adesão de filamentos de actina na superfície de vidro da lamínula</td></tr><tr><td>Citoesqueleto de faloidina de rodamina</td><td></td><td>PHDR1</td><td>Estabilizador de actina e corante fluorescente de rodamina</td></tr><tr><td>Grânulos de estreptavidina, 1 &mu; m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>Alça de captura óptica</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher scientific</td><td>PR H5121</td><td>Usado para preparação de tampão</td></tr></tbody></table>

sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

As miosinas são proteínas motoras que hidrolisam o ATP para percorrer as trilhas do filamento de actina (FA) e são essenciais em processos celulares, como motilidade e contração muscular. Para entender seus mecanismos geradores de força, a miosina II tem sido investigada tanto no nível de molécula única (SM) quanto como equipes de motores in vitro usando métodos biofísicos, como armadilhas ópticas.
Esses estudos mostraram que o comportamento gerador de força da miosina pode diferir muito quando se move do nível de molécula única em um arranjo de três esferas para grupos de motores trabalhando juntos em um grânulo rígido ou superfície de deslizamento de cobertura em um arranjo de deslizamento. No entanto, essas construções de ensaio não permitem avaliar a dinâmica de grupo da miosina dentro da hierarquia estrutural viscoelástica como fariam dentro de uma célula. Desenvolvemos um método utilizando pinças ópticas para investigar a mecânica de geração de força por conjuntos de miosina interagindo com múltiplos filamentos de actina.
Esses feixes de actomiosina facilitam a investigação em um ambiente hierárquico e complacente que captura a comunicação motora e a saída de força do conjunto. A natureza personalizável do ensaio permite alterar as condições experimentais para entender como as modificações no conjunto de miosina, no feixe de filamentos de actina ou no ambiente circundante resultam em diferentes saídas de força.

As células de fluxo que contêm os sistemas de feixe de actomiosina são de um projeto padrão, consistindo de uma lâmina de microscópio e uma lâmina de cobertura gravada separada por um canal feito de fita adesiva de dupla face (Figura 1). O ensaio é então construído a partir do deslizamento de cobertura usando introduções em estágios, conforme descrito no protocolo. O ensaio final consiste em filamentos de actina marcados com rodamina; a concentração de miosina desejada (1 μM foi utilizado pa...

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Investigar o comportamento da actina usando este protocolo é significativo porque permite ao usuário sondar a dinâmica do conjunto de proteínas motoras usando a precisão da armadilha óptica. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de medir a mecânica da miosina dentro da hierarquia estrutural da actina, em oposição à orientação tradicional de filamento único motor usada em muitos experimentos de aprisionamento óptico. Outra vantagem deste protocolo é a sua natureza modular, que permite ao usuário personalizar o ensaio para o sistema de citoesqueleto hierárquico de sua escolha.Para começar, aplique dois pedaços de fita adesiva de dupla face no meio de um microscópio deslizando de três a quatro milímetros de distância um do outro. Em seguida, rasgue ou corte o excesso de fita que fica pendurado na borda do slide. Em seguida, adicione a tampa revestida de PLL em cima da fita perpendicular ao longo eixo da lâmina do microscópio para formar um canal.Usando um pequeno tubo para comprimir a tampa deslize para a fita e o microscópio, deslize completamente até que a fita fique transparente, garantindo que não haja bolhas na fita, pois isso pode causar vazamento do canal de fluxo.

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Demonstrar os usos do Spectrometer Novel Força Gravitacional para esticar e Medida Proteínas fibrosas

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Reconstituindo e caracterizando compósitos de actina-microtúbulo com dinâmica e mecânica sintonizáveis acionadas por motor

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A Mecânica das Redes de Actomiosinas (Poro-)Contráteis Elásticas como Sistema Modelo do Citoesqueleto Celular

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