Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos
31 de março de 2022
A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.
A técnica de clareza descrita pela primeira vez em 2013 é uma técnica de limpeza tecidual que permite a amostragem de maiores quantidades de células, vasos sanguíneos, de modo que mesmo proteínas como uma resolução celular única em fatias cerebrais grossas. Esta técnica permite o estudo de estruturas microscópicas intactas, tornando todo o cérebro transparente. Este protocolo é um simples chip e um pipeline simples para limpar tecidos.
Esta técnica pode ser usada para limpar tecidos em outros sistemas, além de tecidos cerebrais. Para começar, sele o tubo e a tampa usando parafilme e puna dois furos na tampa. Em seguida, transfira gás nitrogênio do tanque usando um tubo flexível com cinco milímetros de diâmetro interno e uma agulha de calibre 19 conectada em sua extremidade.
Comece a desgasear anexando o tubo ao tubo e permitindo a troca de gás por 30 minutos em temperatura ambiente. Retire o tubo e sele imediatamente os orifícios com argila modeladora. Em seguida, transfira os tubos selados de degas para um banho Celsius de 37 graus por 3 horas e meia para polimerizar a solução de hidrogel.
Tire o cérebro do tubo. Usando lenços de laboratório, remova o hidrogel polimerizado ao redor do cérebro, garantindo que nenhum gel residual permaneça ligado à superfície do cérebro. Divida o cérebro em fatias grossas que contenham todas as áreas de interesse.
Coloque as fatias na primeira solução de compensação e incubar a 37 graus Celsius com rotação a 70 RPM por 24 horas. Enquanto isso, prepare um tubo perfurado para colocar o cérebro. Coloque o tubo perfurado em um béquer preenchido com segunda solução de compensação em um dispositivo de agitação.
Em seguida, coloque o cérebro no béquer e sele-o com papel alumínio para evitar branqueamento. Depois que o tecido se tornar transparente, transfira o cérebro para PBST em incubar a 37 graus Celsius com rotação a 70 RPM por 24 horas. Substitua a solução por PBST fresco e continue a incubação por mais 24 horas.
Em seguida, transfira o cérebro para PBS em temperatura ambiente por 24 horas. Após 24 horas, remova o cérebro da PBS e transfira-o para uma solução de correspondência de índices refrativos. Incubar o cérebro a 37 graus Celsius durante a noite.
Primeiro, coloque a amostra no meio do slide. Usando cola quente, crie paredes nas bordas do escorregador, quase tão alto quanto o tecido. Certifique-se de deixar uma pequena lacuna em um dos cantos.
À medida que a camada de cola quente se aproxima da altura da fatia cerebral, aplique uma a duas gotas da solução de correspondência de índice refrativo na amostra para umedecer a superfície superior e evitar a formação de bolhas. Enquanto a cola quente ainda é líquida, sele a parte superior com um deslizamento de tampa, colocando-a o mais uniformemente possível e, em seguida, encha a câmara com a solução de correspondência de índice refrativo. Feche a lacuna com cola quente.
Se as paredes de cola quente se estenderem além das bordas do slide, corte as bordas de extensão. Se um objetivo de imersão em óleo for usado para imagens, adicione mais dois a três milímetros de cola às paredes acima do deslizamento da tampa para manter a solução de imersão. Após este protocolo, o tecido cerebral será limpo.
Fatias cerebrais claras foram preparadas usando este protocolo para visualizar populações de astrócitos e neurônios na região ca1 do hipocampo de camundongos. Todos os astrócitos expressaram tdTomato e neurônios excitatórios expressaram H2B-GFP em seus núcleos. A câmara preparada para o tecido esclarecido foi ideal para imagens sob um microscópio de dois fótons ou confocal.
Usando um microscópio de dois fótons, mais de 300 astrócitos foram observados em uma seção desmatada da região ca1 do hipocampo do rato. Os astrócitos hipocampais em células vermelhas e piramidais, somata em verde eram visíveis e grossos, tecido transparente representando a proximidade espacial entre esses dois tipos de células. Usando um microscópio confocal a laser de varredura, feixes axonais de neurônios excitatórios foram rastreados por todo um hemisfério.
Feixes verdes foram rastreados do hipocampo dorsal em direção aos corpos super mamillários. Os feixes vermelhos foram rastreados dos corpos mamillary em direção à sua origem no hipocampo de ventilação. Fatores como temperatura, concentrações e tempo de incubação influenciaram o resultado do procedimento de clareza.
Portanto, a precisão em cada etapa do protocolo é vital para o sucesso de alcançar tecido claro. Usando essa técnica, medimos as distâncias entre neurônios e astrócitos em várias estruturas cerebrais. Este protocolo permitiu a análise de duas a três ordem de magnitude mais células do que em estudos anteriores.
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Visão Geral
Este estudo utiliza o método CLARITY combinado com transdução de vetores virais para explorar as relações espaciais entre neurônios e astrócitos no hipocampo do rato. Ao tornar o tecido transparente, esta técnica permite aos pesquisadores investigar um número maior de células, revelando insights sobre a organização e interações celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de clareamento de tecido
- Imagem celular
Fundamentos
- A técnica CLARITY permite a visualização do tecido cerebral a nível celular.
- Ela permite a análise de grandes populações de neurônios e astrócitos em tecidos intactos.
- Este método melhora a clareza de secções cerebrais espessas em comparação com métodos de imagem tradicionais.
- O estudo enfatiza o papel da transparência do tecido na compreensão da arquitetura neuronal.
Propósito do Estudo
- Investigar as relações estruturais entre astrócitos e neurônios no hipocampo do rato.
- Medir as distâncias entre diferentes tipos de células em várias estruturas cerebrais.
- Demonstrar a eficácia do método CLARITY para imagem celular.
Métodos Utilizados
- O estudo utilizou a técnica CLARITY para clareamento de tecido em secções cerebrais.
- O tecido do hipocampo do rato foi utilizado para visualizar astrócitos e neurônios excitatórios.
- Nenhum fluxo de trabalho multiomics foi mencionado.
- As principais etapas incluíram desgaseificação, polimerização do hidrogel e incubação em soluções de clareamento.
- O tecido foi imageado usando microscopia de dois fótons e confocal.
Principais Resultados
- Mais de 300 astrócitos foram visualizados em secções hipocampais clareadas.
- O contexto espacial dos astrócitos e neurônios excitatórios foi estabelecido, mostrando sua proximidade.
- Foram observadas significativamente feixes axônicos entre populações neuronais em tecidos clareados.
- Vários fatores afetaram a clareza dos tecidos, destacando a necessidade de metodologia precisa.
Conclusões
- Este estudo demonstra que o método CLARITY pode melhorar significativamente a visualização das relações celulares no cérebro.
- Os resultados permitem uma melhor compreensão da organização espacial de neurônios e células gliais.
- Os insights obtidos com este método podem ter implicações para pesquisas em mecanismos neuronais e potenciais modelos de doenças.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of astrocyte-neuron spatial interactions in intact brain tissue addresses a critical gap in early CNS target validation and mechanistic de-risking. The integration of viral vector labeling with CLARITY tissue clearing enables quantitative, large-scale analysis of cellular domains, supporting predictive confidence in neurobiological discovery. This capability enhances portfolio triage by providing robust, scalable data on cell-type interactions relevant to disease modeling and target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of astrocyte-neuron spatial relationships in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular domain boundaries and proximity metrics.
- Facilitates functional target validation through genetically defined cell-type labeling and imaging.
- Provides high-content data for predictive confidence in CNS target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact brain tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative spatial measurements.
- Enables scalable imaging of hundreds to thousands of cells per sample for robust screening.
- Supports assay development for compound evaluation targeting neuron-glia interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial mapping outputs with disease-relevant CNS models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by providing quantitative benchmarks for cell-type interactions.
- Supports biomarker discovery through high-resolution mapping of cellular domains.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neurobiology portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content spatial analysis of genetically defined brain cell populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on astrocyte-neuron interactions and clarifies mechanistic pathways in CNS tissue.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers cell proximity and domain occupancy metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects spatial mapping data to disease models and biomarker strategies when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue clearing and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector transduction, tissue clearing, and advanced microscopy.
- Demands access to two-photon or confocal imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates strict protocol standardization for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or model systems.
- Protocol precision is critical; temperature, reagent concentrations, and timing directly affect data quality.
