Name: Estabelecendo organoides pulmonares humanos e diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a estababelecer organoides pulmonares humanos a partir de tecidos primários e diferenciá-los em vias aéreas maduras. Este método permite expandir culturas estáveis por mais de um ano para estudar biologia respiratória.

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Agradecemos ao Centro de Ciências Panorômicas e Unidade de Microscópio Eletrônico, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Universidade de Hong Kong, pela assistência em imagens confocal e citometria de fluxo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Fundo de Pesquisa Médica e de Saúde (HMRF, 17161272 e 19180392) da Secretaria de Alimentação e Saúde; Fundo Geral de Pesquisa (GRF, 17105420) do Conselho de Bolsas de Pesquisa; e Health@InnoHK, Comissão de Inovação e Tecnologia, o Governo da Região Administrativa Especial de Hong Kong.

Toda a experimentação usando tecidos humanos descritos aqui foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 e UW21-695). O consentimento informado foi obtido dos pacientes antes da coleta de tecidos.
1. Derivação do organoide pulmonar humano
<ol><li>Preparação de materiais experimentais<ol>
<li>Prepare o meio basal suplementando médio avançado DMEM/F12 com glutamina de 2 mM, HEPES de 10 mM, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.</li>
		<li>Prepare o meio de expansão organoide pulmonar humano suplementando o meio basal com 10% R-spondin 1 meio condicionado, 10% noggin médio condicionado, 1x suplemento B27, 1,25 mM N-acetilcisteína, 10 mM nicotinamida, 5 μM de Y-27632, 500 nM de A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de fator de crescimento fibroblst (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 e 100 μg/mL de primocina (ver Tabela de Materiais). NOTA: O meio condicionado R-spondin 1 e Noggin pode ser substituído por R-spondin 1 (500 ng/mL) e Noggin (100 ng/mL).</li>
		<li>Pré-aquecimento uma placa de cultura de suspensão de 24 poços em uma incubadora de cultura celular. Use uma incubadora de cultura celular padrão com 5% de CO2 e atmosfera umidificada a 37 °C. Descongele a matriz do porão em uma geladeira de 4 °C. Mantenha a matriz do porão e a cultura média no gelo durante a experimentação.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento celular dos tecidos pulmonares humanos para a cultura organoide 3D<ol>
<li>Procure tecidos pulmonares humanos recém-ressecados de cerca de 0,5 cm de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica devido a várias doenças. Transporte os tecidos pulmonares em 30 mL de meio basal à temperatura ambiente e processe o mais rápido possível dentro de uma capa de biossegurança.</li>
		<li>Moce tecidos pulmonares em pequenos pedaços (0,5-1 mm) com um bisturi estéril em um prato de cultura celular de 10 cm. Lave peças de tecido com 10 mL de meio basal frio em um tubo de centrífuga de 15 mL, seguida de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Descarte o supernaspetivo e resuspenque a pelota em 8 mL de meio basal suplementado com colagemnase em uma concentração final de 2 mg/mL. Digerir os pedaços de tecido sacudindo o tubo a 120 rpm por 30-40 min a 37 °C.</li>
		<li>Pipeto para cima e para baixo por 20x para tesourar os pedaços de tecido digerido usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Empilhe um coador de 100 μm em um tubo de centrífugas de 50 mL e filtre a suspensão.</li>
		<li>Recupere as peças de tecido no coador com o meio basal e transfira-as para um tubo de centrífuga de 15 mL, seguida de uma segunda rodada de tesoura e filtragem. Podem ser realizadas filtragem adicional de tesoura 1x-2x para isolar mais células, especialmente quando um pequeno pedaço de tecido (por exemplo, <0,5 cm) é adquirido.</li>
		<li>Adicione FBS ao fluxo com uma concentração final de 2% para interromper a digestão, seguido de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Resuspend a pelota celular em 10 mL de meio basal, seguido de centrifugação a 400 x g para 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.</li>
		<li>(Opcional) Se muitos eritrócitos forem vistos na pelota (estimado pela cor da pelota), resuspende a pelota de célula em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, adicione 10 mL de meio basal ao tubo, seguido de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.</li>
		<li>Resuspend a pelota em matriz fria do porão e mantenha no gelo. Adicionar 80-160 μL de matriz de porão para células recuperadas de um tecido pulmonar de tamanho em torno de 0,5 cm; a quantidade é suficiente para semear 2-4 gotículas.</li>
		<li>Dispense 40 μL de suspensão a cada poço de uma placa de cultura de suspensão pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar para formar uma gota.</li>
		<li>Adicione 500 μL de organoides pulmonares humanos meio de expansão complementado com 5 nM de Heregulin beta-1 para cada poço e incubar a placa em uma incubadora de cultura celular.</li>
		<li>Refrescar o meio a cada 3 dias. Remova o meio antigo mantendo a gota intacta e adicione o meio fresco com cautela. Passagem dos organoides após incubação por 10-14 dias. Use Heregulin beta-1 apenas na cultura inicial antes da primeira passagem.</li>
		<li>Observe os organoides sob um microscópio para garantir que os organoides não estejam incorporados com uma densidade celular muito alta. Se uma gotícula se desintegrar devido a uma densidade celular excessivamente alta, recupere e reindua os organoides e células com um maior volume de matriz de porão para fazer mais gotículas com uma densidade celular menor e desejável.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Expansão de organoides pulmonares humanos
<ol><li>Prepare uma pipeta Pasteur queimando a ponta de uma pipeta Pasteur em uma chama, como um queimador bunsen, para reduzir a abertura de 1,5 mm para cerca de 1,0 mm de diâmetro. Esfrie as pipetas, seguidas de autoclaving para esterilizar. Molhe as pipetas com o meio basal para evitar a fixação e perda da célula durante a tesoura mecânica.</li>
	<li>Passagem de organoides pulmonares com cisalhamento mecânico<ol>
<li>Use uma ponta de 1 mL e pipeta para cima e para baixo para quebrar as gotículas obtidas acima. Em seguida, transfira os organoides junto com o tubo médio para uma centrífuga de 15 mL e ajuste o volume para 10 mL com meio basal frio. Descarte o supernatante após centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 °C</li>
		<li>Lave os organoides com 10 mL de meio basal frio mais uma vez. Resuspenda os organoides em 2 mL de meio basal frio. Pipeta para cima e para baixo para esmatar os organoides em pequenos pedaços com uma pipeta Pasteur.</li>
		<li>Suplemento com meio basal a um volume total de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C. Resuspend os fragmentos organoides com matriz de porão frio suficiente para permitir uma expansão de 1:3 a 1:5. Mantenha-se no gelo.</li>
		<li>Coloque 40 μL de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar.</li>
		<li>Adicione 500 μL de meio de expansão organoide pulmonar a cada poço e incubar em uma incubadora de cultura celular. Refrescar o meio a cada 3 dias. Passagem os organoides a cada 2 semanas com uma razão de 1:3 a 1:5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passagem de organoides pulmonares com trippsinização NOTA: A trippsinização é preferida quando é difícil cisar o organoide pulmonar em pequenos pedaços usando uma pipeta Pasteur, ou o tamanho dos organoides é altamente variável, ou as experimentações subsequentes requerem organoides de tamanho mais uniforme.<ol>
<li>Colher os organoides pulmonares conforme mostrado na etapa 2.2.1. Resuspend o organoide em 1 mL de enzima dissociação e incubar em um banho de água de 37 °C por 3-5 min.</li>
		<li>Adicione 1 mL de meio basal ao tubo. Tesourar os organoides mecanicamente, pipetando os organoides para cima e para baixo em pequenos pedaços usando uma tubulação Pasteur. Verifique o tamanho das peças organoides sob um microscópio a 4x de ampliação. Em seguida, adicione 40 μL de FBS para interromper a digestão. NOTA: Determine o tamanho dos fragmentos organoides sob o microscópio de acordo com o arranjo experimental. Se um experimento precisa de mais organoides ou organoides de tamanho mais uniforme, os organoides de tesoura em pedaços menores ou mesmo células únicas. Então, leva mais tempo, provavelmente 3 semanas, antes que os organoides estejam prontos para experimentação.</li>
		<li>Cubra com meio basal a um volume final de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C. Resuspend as peças organoides em matriz de porão frio com um volume suficiente para passagem com uma razão de 1:5-1:10. Mantenha-se no gelo.</li>
		<li>Coloque 40 μL de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar.</li>
		<li>Suplementar com 500 μL de meio de expansão organoide pulmonar por poço e incubar em uma incubadora de cultura celular. Atualize o meio de expansão a cada 3 dias. Passagem os organoides após 2-3 semanas. NOTA: Cerca de 100 organoides são montados dentro de uma gotícula de 40 μL da matriz do porão. Os organoides pulmonares normalmente crescem melhor com uma densidade celular relativamente alta. Reinscreva os organoides com uma densidade celular menor se as gotículas se desintegrarem ou os organoides em crescimento se unirem devido à densidade celular excessivamente alta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas
<ol><li>Prepare o meio de diferenciação proximal (meio PD) complementando o meio basal da interface líquida ar com suplemento de interface líquida de ar 1x, suplemento de manutenção da interface líquida de ar 1x, 4 μg/mL de heparina, 1 μM de hidrocortisona, 10 μM de Y-27632 e 10 μM de DAPT (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Organoides das vias aéreas 3D<ol>
<li>Incubar organoides pulmonares no meio de expansão por 7-10 dias após a passagem via cisalhamento mecânico. Substitua o meio de expansão pelo meio PD. Incubar os organoides no meio dp por 14 dias em uma incubadora de cultura celular.</li>
		<li>Descarte o meio DP em cada poço. Adicione tampão de lise celular para colher o organoide diferenciado das vias aéreas para extração de RNA e detecção de expressão genética celular pelo ensaio RT-qPCR.</li>
		<li>Alternativamente, incubar os organoides a 37 °C por 60 minutos após a adição de 10 mM EDTA para desassociar os organoides em células únicas, seguido de análise de citometria de fluxo para examinar populações celulares. Os organoides estão prontos para várias manipulações experimentais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organoide das vias aéreas 2D<ol>
<li>Prepare organoides pulmonares 3D suficientes para a cultura de diferenciação 2D. São necessárias 1,3 x 105 e 4,5 x 105 células para uma inserção de suporte permeável de 24 poços e uma inserção de suporte permeável de 12 poços, respectivamente.</li>
		<li>Após os organoides pulmonares 3D crescerem no meio de expansão por 2 semanas, digerir os organoides em células únicas e sementes nas pastilhas de 24 poços e 12 poços para gerar organoides das vias aéreas 2D.</li>
		<li>Pré-incubar as pastilhas com o meio basal durante a noite em uma incubadora de cultura celular. Adicione 250 μL e 500 μL de meio basal na câmara superior e inferior de uma placa de 24 poços, respectivamente. Para uma placa de 12 poços, adicione 500 μL e 1.000 μL de meio basal na câmara superior e inferior, respectivamente.</li>
		<li>Colher organoides pulmonares 3D conforme descrito na etapa 2.2.1. Resuspend os organoides com 1 mL de enzima dissociação e incubar em um banho de água de 37 °C por 3-5 min.</li>
		<li>Adicione 1 mL de meio basal ao tubo. Encarreça para cima e para baixo para transformar os organoides em células únicas com uma tubulação Pasteur e verificar as células sob um microscópio. Em seguida, adicione 40 μL de FBS para interromper a digestão.</li>
		<li>Filtre as células através de um coador de 40 μm em um tubo centrífuga de 50 mL. Transfira a suspensão da célula filtrada para um tubo de 15 mL. Cubra com meio basal a um volume total de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Resuspende a pelota, coletada de 24 gotículas (40 μL), em 1-2,5 mL de meio de expansão organoide pulmonar, dependendo da densidade celular nas gotículas. Conte o número de células com um contador de células sob um microscópio. Ajuste a concentração celular para 1,3 x 106/mL (para inserções de 24 poços) ou 9 x 105/mL (para inserções de 12 poços).</li>
		<li>Remova o meio basal das câmaras superior e inferior. Adicione 500 μL e 1.000 μL de meio de expansão na câmara inferior da inserção de 24 poços e inserção de 12 poços, respectivamente. Sementes 100 μL e 500 μL de suspensão celular preparada na etapa 3.3.7 na câmara apical da inserção de 24 poços e inserção de 12 poços, respectivamente.</li>
		<li>Incubar em uma incubadora de cultura celular por 2 dias. Substitua o meio de expansão pelo meio PD tanto na câmara apical quanto na parte inferior das placas. Incubar os organoides na incubadora de cultura celular por 14 dias e atualizar o meio DP a cada 3 dias. NOTA: Cílios móveis são perceptíveis nos organoides 3D e 2D sob um microscópio a partir do dia 7 após a incubação no meio PD. Após 14 dias de cultura de diferenciação no meio dp, os organoides das vias aéreas são maduros para várias manipulações experimentais.</li>
		<li>Meça a resistência elétrica trans-epitelial (TEER) a cada dois dias usando um sistema de medição de resistência elétrica de acordo com um protocolo padrão descrito em17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modelling+in+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li>
<li>Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</a> (2021).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098(2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt%2Fbeta-catenin+and+Wnt%2FPCP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li>
<li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li>
<li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
<li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li>
<li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+immunological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li>
<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z., C.L., e M.C.C. estão listados como inventores na patente de organoides das vias aéreas (publicação Nº: US-2021-0207081-A1). Os outros autores não declaram interesses concorrentes.

As vias aéreas humanas são forradas com o epitélio das vias aéreas, também conhecido como epitélio ciliado pseudostratificado. Os principais tipos celulares do epitélio das vias aéreas superiores são células ciliadas que permitem o movimento coordenado de seus cílios apical para expelir muco e partículas inaladas das vias aéreas, células de cálice que produzem e secretam muco, e células basais que revestem a membrana do porão e estão implicadas na regeneração. Nas pequenas vias aéreas, como os brônquios, o epitélio das v...

Os organoides tornaram-se uma ferramenta robusta e universal para a modelagem in vitro do desenvolvimento de órgãos e estudo da biologia e da doença. Quando cultivadas em um meio de cultura definido por fatores de crescimento, as células-tronco adultas (ASC) de uma variedade de órgãos podem ser expandidas em 3 dimensões (3D) e auto-montadas em aglomerados celulares semelhantes a órgãos compostos por múltiplos tipos de células, denominados organoides. O laboratório de Clevers relatou a derivação do primeiro organoide derivado do ASC, organoide intestinal humano, em 2009 1,2. Posteriormente, organoides derivados do ASC foram estabelecidos para uma variedade de órgãos e tecidos humanos, incluindo próstata 3,4, fígado 5,6, estômago 7,8,9, pâncreas10, glândula mamária11 e pulmão 12,13 . Esses organoides derivados do ASC mantiveram as propriedades críticas celulares, estruturais e funcionais do órgão nativo e mantiveram a estabilidade genética e fenotípica na cultura de expansão de longo prazo14,15.
Organoides também podem ser derivados de células-tronco pluripotentes (PSC), incluindo células de tronco embrionária (ES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPS)16. Enquanto organoides derivados do PSC exploram os mecanismos de desenvolvimento de órgãos para seu estabelecimento, as ASCs podem ser coagidas a formar organoides por meio da reconstrução de condições que imitam o nicho de células-tronco durante a autoconexão do tecido fisiológico ou reparação de tecidos. Os organoides derivados do PSC são modelos favoráveis para explorar o desenvolvimento e a organogênese, embora incapazes de atingir o nível de maturação comparável dos organoides derivados do ASC. O estado de maturação fetal dos organoides derivados do PSC e a complexidade para o estabelecimento desses organoides impedem substancialmente suas amplas aplicações para estudar biologia e patologia em tecidos maduros.
O trato respiratório humano, do nariz ao brônquio terminal, é forrado com o epitélio das vias aéreas, também chamado de epitélio ciliado pseudostratificado, que consiste em quatro tipos principais de células, ou seja, célula ciliada, célula de cálice, célula basal e célula do clube. Estabelecemos o organoide pulmonar humano derivado do ASC a partir de tecidos pulmonares humanos em colaboração com o laboratório 12,13 da Clevers. Esses organoides pulmonares são consecutivamente expandidos no meio de expansão por mais de um ano; a duração precisa varia entre diferentes linhas organoides obtidas de diferentes doadores. No entanto, em comparação com o epitélio das vias aéreas nativas, esses organoides pulmonares expansíveis de longo prazo não são maduros o suficiente, uma vez que as células ciliadas, a maior população celular nas vias aéreas humanas, são sub-representadas nesses organoides pulmonares. Assim, desenvolvemos um protocolo de diferenciação proximal e geramos organoides das vias aéreas 3D e 2D que, morfologicamente e funcionalmente, fenóquico das vias aéreas, a um nível quase fisiológico.
Aqui fornecemos um protocolo de vídeo para derivar organoides pulmonares humanos dos tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides 3D e 2D das vias aéreas.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes para cultura de organoides pulmonares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avançado DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>12634010-A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500nM</td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Matriz de Membrana Basal de Fator de Crescimento Reduzido Cultrex, Tipo 2 (BME 2)</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>70-80%</td></tr> <tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng / mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng / mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamina)</td> <td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Heregulin &beta; -1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin (meio condicional)</td><td>feito</td> <td>em</td> <td>casa-10x</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Rspondin1 (meio condicional)</td><td>feito</td> <td>em</td> <td>casa-10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &micro; M</td></tr><tr><td><forte>Meio de diferenciação proximal</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 &micro; </td></tr><tr><td>M Solução de Heparina</td><td>StemCell Technology</td><td>7980</td><td>4 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de Solução de Estoque de Hidrocortisona</td><td>StemCell Technology</td><td>7925</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X Suplemento</td><td></td><td></td><td>de interface ar-líquido</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td><td>StemCell Technology</td><td>05001</td><td>ar líquido interface basal meio</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Suplemento</td><td></td><td></td> de <td>manutenção de interface ar-líquido</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Equipment</td>Armário de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>segurança biológica</td><td>Baker</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 ou 800</td><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>Pipetador sorológico</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN preto ou ZEN azul Software</td> de <td>análise</td> <td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td><forte>Consumíveis</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12mm</td><td>Tecnologia</td> <td>Trans-well StemCell#38023</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 12 poços</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 e 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia de Células-Tronco Trans-well de 6,5mm</td><td></td>#<td>38024</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro de Seringa Médica, 0,22 &micro; m</td><td>Tubos Sigma-Aldrich</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de micropipeta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TFLR140-200-Q21190531</td><td></td></tr><tr><td>Copo de pipeta Pasteur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-378893</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (5ml, 10ml, 25ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BA08003, 08004, 08005</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cabra Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Coelho Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Coelho Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Rato Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>Rato Anti-Citoqueratina 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>Rato Anti-FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>Rato Anti-Mucina 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>Rato Anti-&beta;-tubulina 4</td><td>Sigma</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>Coelho Anti-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Rato Anti-Uteroglobina / CC-10</td><td>R & D Systems</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><tr><td>Outro reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td> enzima <td>de dissociação</td></tr></tbody></table>

estabelecendo organoides pulmonares humanos e diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

A falta de um modelo in vitro robusto do epitélio respiratório humano dificulta a compreensão da biologia e patologia do sistema respiratório. Descrevemos um protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos de células-tronco adultas no tecido pulmonar e induzir diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas. Os organoides pulmonares são então expandidos consecutivamente por mais de 1 ano com alta estabilidade, enquanto os organoides diferenciados das vias aéreas são usados para simular morfológica e funcionalmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico. Assim, estabelecemos um modelo organoide robusto do epitélio das vias aéreas humanas. A expansão a longo prazo de organoides pulmonares e organoides diferenciados das vias aéreas gera uma fonte estável e renovável, permitindo aos cientistas reconstruir e expandir as células epiteliais das vias aéreas humanas em pratos culturais. O sistema organoide pulmonar humano fornece um modelo in vitro único e fisiologicamente ativo para várias aplicações, incluindo o estudo da interação entre vírus e hospedeiros, testes medicamentosos e modelagem de doenças.

Este protocolo permite a derivação de organoides pulmonares humanos com uma alta taxa de sucesso. Tecido pulmonar humano fresco é picado em pequenos pedaços, e depois decomposto com colagemnase. As células únicas resultantes estão embutidas na matriz do porão e incubadas no meio de expansão organoide pulmonar complementada com um coquetel de fatores de nicho para o crescimento das células-tronco epiteliais (passo 1.1.2). A Figura 1 mostra a microfotografia de células pulmonares recém-isolada...

O protocolo apresenta um método para derivar organoides pulmonares humanos de tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides das vias aéreas 3D e 2D que ferem fielmente o epitélio das vias aéreas humanas.

Estabelecendo organoides pulmonares humanos e diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Estamos introduzindo um método para estabelecer a cultura organoide do epitélio das vias aéreas humanas em placas de cultura. Derivamos organoide pulmonar humano diretamente de tecidos pulmonares primários com alta eficiência. O organoide pulmonar humano derivado é expandido por mais de um ano, e um protocolo de diferenciação proximal permite a geração de organoides maduros das vias aéreas que podem simular fielmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico.Portanto, o sistema cultural permite que os cientistas reconstruam e expandam o epitélio das vias aéreas humanas em placas de cultura. Demonstrando o procedimento estarão Man Chun Chiu e Yifei Yu, estudantes de doutorado em nosso laboratório Para iniciar o isolamento celular dos tecidos pulmonares humanos para a cultura organoide 3D, pica os tecidos pulmonares em pequenos pedaços de um milímetro com um bisturi estéril e lave os pedaços de tecido com 10 mililitros de meio basal frio. Centrifugar os tecidos a 400 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenante antes de reutilizar a pelota em oito mililitros de meio basal suplementado com colagenase em uma concentração final de dois miligramas por mililitro.Em seguida, digerir os pedaços de tecido sacudindo o tubo a 120 RPM por 30 a 40 minutos a 37 graus Celsius. Após a digestão, pipeta para cima e para baixo 20 vezes usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros para tesourar os pedaços de tecido digerido. Em seguida, filtre a suspensão com um filtro de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros.Recupere e transfira as peças de tecido do coador para um tubo de centrífuga de 15 mililitros com o meio basal. Para terminar a digestão, adicione o soro bovino fetal ao fluxo até uma concentração final de 2%Em seguida, centrifugar o tubo e resuspengar a pelota celular em 10 mililitros do meio basal como descrito anteriormente. Após a centrifugação, resuspenja a pelota em 80 a 160 microliters de matriz de porão frio média e coloque os tubos no gelo.Em seguida, dispense 40 microliters da suspensão para cada poço de uma placa de cultura de suspensão pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Permita que a matriz do porão se solidifique e forme uma gota.Após a incubação, adicione 500 microliters de organoides pulmonares humanos meio de expansão complementado com cinco nanomolar de heregulin-beta 1 para cada poço e incubar a placa em uma incubadora de cultura celular. Após três dias, remova o meio antigo mantendo a gota intacta e adicione cuidadosamente o meio fresco. Após 10 a 14 dias de passagem, observe os organoides sob um microscópio e certifique-se de que os organoides não estejam incorporados com uma densidade celular muito alta.Para passar os organoides pulmonares com cisalhamento, quebre as gotículas por pipetting para cima e para baixo com uma ponta de um mililitro. Em seguida, transfira os organoides junto com o tubo médio para um tubo centrífuga de 15 mililitros e ajuste o volume para 10 mililitros com um meio basal frio. Centrifugar o tubo a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, descartar o supernazio e lavar os organoides com 10 mililitros de meio basal frio.Em seguida, resuspenque os organoides em dois mililitros de meio basal frio e corte em pequenos pedaços com uma pipeta Pasteur. Em seguida, adicione meio basal a um volume total de 10 mililitros e centrífuga antes de reutilizar os fragmentos organoides com uma matriz fria de porão suficiente para permitir uma expansão de 1:3 a 1:5 e colocar os tubos no gelo. Dispense 40 microliters de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços para incubar a 37 graus Celsius para permitir que a matriz do porão se solidifique por 10 a 15 minutos.Posteriormente, adicione 500 microliters de meio de expansão organoide pulmonar a cada poço e incuba em uma incubadora de cultura celular. Refrescar o meio a cada três dias e passar os organoides a cada duas semanas. Para passagem de organoides pulmonares com trippsinização, resuspende colhiu organoides pulmonares colhidos em um mililitro de enzima dissociação.Incubar o organoide em um banho de água de 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio basal ao tubo e enlouco que os organoides mecanicamente tubos para cima e para baixo. Verifique o tamanho das peças organoides sob um microscópio a 100X de ampliação antes de terminar a digestão com 40 microlitros de soro bovino fetal.Coma o volume para 10 mililitros com meio basal e centrífuga antes de reutilizar as peças organoides em uma matriz fria de porão com volume suficiente para passagem com uma razão de 1:5 a 1:10. Mais tarde, dispense 40 microliters de suspensão organoide em cada poço de uma placa de 24 poços e cultua a placa como demonstrado anteriormente. Para gerar organoides das vias aéreas 3D, incubar os organoides pulmonares no meio de expansão por sete a 10 dias após a passagem via cisalhamento mecânico.Em seguida, substitua o meio de expansão por meio de diferenciação proximal e incubar os organoides em uma incubadora de cultura celular. Após 14 dias, descarte o meio em cada poço e adicione tampão de lise celular para colher o organoide diferenciado das vias aéreas para extração de RNA e detecção de expressão genética celular pelo ensaio RT-qPCR. Pré-incubar as pastilhas na incubadora de cultura celular com 250 e 500 microliters do meio basal na câmara superior e inferior de uma placa de 24 poços, respectivamente.Em seguida, adicione um mililitro de meio basal ao tubo e pipeta para cima e para baixo para transformar os organoides em células únicas. Observe as células sob um microscópio antes de terminar a digestão com 40 microlitros de soro bovino fetal. Filtre as células através de um filtro de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros e transfira a suspensão celular filtrada para um tubo de 15 mililitros.Cubra a suspensão com meio basal a um volume total de 10 mililitros. Após a centrifugação, resuspengue a pelota coletada de 24 gotículas em 1 a 2,5 mililitros de meio de expansão organoide pulmonar, dependendo da densidade celular. Conte o número de células com o contador celular sob um microscópio, em seguida, ajuste a concentração celular para 1,3 vezes 10 para seis por mililitro para inserções de 24 poços.Remova o meio basal das câmaras superior e inferior antes de adicionar 500 microliters de meio de expansão na câmara inferior. Sementes 100 microliters de suspensão celular preparados anteriormente na câmara apical da inserção e incubação de 24 poços. Após dois dias, substitua o meio de expansão por meio de diferenciação proximal tanto na câmara apical quanto inferior da placa.Incubar os organoides por 14 dias e refrescar o meio a cada três dias. Meça a resistência elétrica trans-epitelial todos os dias usando um sistema de medição de resistência elétrica. Na microfotografia representativa, as células pulmonares recém-isoladas podem ser vistas embutidas na matriz de membrana de porão do fator de crescimento reduzido tipo dois.Os organoides císticos apareceram e cresceram ao longo do tempo. Os organoides pulmonares após a quarta passagem são demonstrados aqui. Duas horas após a cisalhamento mecânico, os fragmentos organoides embutidos no extrato da membrana do porão formaram os domínios císticos.A microfotografia do mesmo campo no quinto dia confirmou o crescimento organoide ao longo do tempo. Os organoides em expansão abrigaram todos os quatro principais tipos de células epiteliais das vias aéreas, incluindo célula ciliada positiva ou FOXJ1 positiva, célula basal P63 positiva, célula do clube CC10 positivo e célula de cálice positiva MUC5AC em um estado prematuro. Os organoides incubados no meio de expansão e diferenciação proximal desenvolveram morfologia distinta ao longo do tempo.Após duas semanas de diferenciação no meio de diferenciação proximal, cílios motil eram perceptíveis em cada organoide. Observou-se que o espancamento sincronia celia levou os detritos celulares para dentro do lúmen organoide e rodou-os unidiretamente para remover as partículas inalações. Além disso, a análise da citometria de fluxo demonstrou que os organoides diferenciados acomodavam quatro tipos de células epiteliais das vias aéreas em meio de diferenciação e expansão proximal.Após duas semanas de diferenciação, organoides das vias aéreas 2D desenvolveram uma barreira epitelial intacta. Foi realizado um ensaio de bloqueio do Dextran para avaliar a integridade da barreira epitelial formada em organoides das vias aéreas 2D. Os organoides 2D continham células ciliadas abundantes.O organoide pulmonar expansível de longo prazo e o organoide diferenciado das vias aéreas fornecem um sistema modelo fisiologicamente ativo e universal para estudar biologia respiratória e patologia, incluindo o COVID-19.

establishing-human-lung-organoids-proximal-differentiation-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo eficiente dirige rato estaminais embrionárias endoderme definitivo de células-derivadas para amadurecer as células epiteliais das vias respiratórias. Esta técnica utiliza a diferenciação 3-dimensionais andaimes pulmonares descelularizados para dirigir especificação das linhagens celulares de pulmão, em, uma configuração de cultura isento de soro definido.

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Este artigo fornece uma metodologia detalhada para as abordagens de dissociação tecidual e fracionamento celular permitindo o enriquecimento de células epiteliais viáveis de regiões proximais e distais do pulmão humano. Aqui essas abordagens são aplicadas para a análise funcional das células progenitoras epiteliais pulmonares através do uso de modelos de cultura organoides 3D.

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

Descrevemos um protocolo simples para desenvolver organoides epiteliais mucociliais a partir de células ectoderm profundas isoladas dos embriões Xenopus laevis. Os progenitores multipotentes regeneram precursores de células de cálice epitelial e permitem o acompanhamento ao vivo da iniciação e progressão das transições celulares na superfície dos organoides.

Organoides epiteliais mucociliais de células embrionárias xenopus: geração, cultura e imagem ao vivo de alta resolução

O artigo descreve a diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes induzidas a organoides pulmonares inteiros tridimensionais contendo células pulmonares epiteliais proximais e disais, juntamente com mesenchyme.

Geração de organoides pulmonares 3D inteiros de células-tronco pluripotentes induzidas para modelagem da biologia e doença do desenvolvimento pulmonar

O protocolo descreve um bioreator habilitado para imagem que permite a remoção seletiva do epitélio endógeno da traqueia de rato e distribuição homogênea de células exógenas na superfície do lúmen, seguida pela cultura in vitro de longo prazo da construção do tecido celular.

Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Este artigo descreve a geração de um modelo complexo de barreira das vias aéreas multicelular composto por epitélio pulmonar derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), mesênquima, células endoteliais e macrófagos em uma cultura de interface ar-líquido.

Co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e imunes derivadas de iPSC para modelar a integridade da barreira das vias aéreas na saúde e doença pulmonar

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

A cultura agregada madura de membrana (MAAC) é um novo método para cultivar adipócitos humanos maduros. Aqui detalhamos como isolar adipócitos do adipose humano e como configurar o MAAC.

Isolamento e Cultura de Adipócitos Maduros Humanos Usando culturas agregadas de adipócitomaduros de membrana (MAAC)

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Aprenda a estababelecer organoides pulmonares humanos a partir de tecidos primários e diferenciá-los em vias aéreas maduras. Este método permite expandir culturas estáveis por mais de um ano para estudar biologia respiratória.

Estabelecendo organoides pulmonares humanos e diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas

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