Caracterizando Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis em camundongos

A sepse é uma resposta imune disregulada à invasão microbiana ou danos teciduais, levando a lesões de órgãos em um local distante do de infecção ou dano. O público em geral tornou-se mais consciente dessa desordem, durante a pandemia COVID-19. Em 2017, houve 48,9 milhões de incidências de sepse e 11 milhões de mortes em todo o mundo, representando quase 20% de todas as mortes globais.

Como se pode esperar, a maioria dos casos está em hospitais. De fato, um estudo descobriu que quase 62% dos isolados positivos de pacientes com UTI com sepse, eram organismos gram-negativos. Existem vários modelos, e alguns dos modelos de sepse de camundongos comumente usados incluem endotoxemia induzida por LPS, o modelo de ligadura e punção cecal, e os sistemas de modelos de infecção monobacteriana.

Em nosso laboratório, padronizamos um sistema modelo de camundongos para induzir sepse peritoneal usando Salmonella Typhimurium. Este modelo é vantajoso em relação aos outros, pois Salmonella Typhimurium é um patógeno intracelular que imita a condição clinicamente relevante da sepse gram-negativa. O desfecho da peritonite sepse nesse modelo, é sistêmico com 100% de mortalidade, dentro de 96 horas após a infecção.

Portanto, este modelo é fundamental no estudo das respostas inflamatórias do hospedeiro. Neste modelo, a sepse é induzida pela injeção intraperitoneal de 0,5 milhões de UFC de Salmonella Typhimurium, em um mouse C57BL/6 de 8-10 semanas de idade. A infecção sistêmica pode ser confirmada, avaliando a carga bacteriana dos órgãos, cerca de 16 horas após a infecção.

Os experimentos usando Salmonella Typhimurium exigem instalações BSL-2 e adesão às diretrizes BSL-2. Deve-se tomar cuidado para usar EPI adequado e garantir a segurança e seguir os métodos padrão de descarte de risco biológico BSL-2. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê institucional de ética animal.

Preparação cultural de Salmonella Typhimurium. Adicione uma centena de microliter de Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glicerol stock, em 3 mL de caldo LB. Incubar a cultura a 160 revoluções por minuto, a 37 graus celsius durante a noite.

Raia 50 microliter da cultura cultivada durante a noite em caldo LB, em uma placa de ágar Salmonella Shigella, e incubar a 37 graus celsius por 12 horas. Escolha uma única colônia da placa de ágar da SS listrada, usando uma microtipa. Ejete a microfina em 3 mL de caldo LB, e cultura a 160 RPM a 37 graus celsius durante a noite.

Adicione 0,1 mL da cultura bacteriana em 50 mL de caldo LB, e incubar a 37 graus celsius, em uma incubadora shaker a 160 RPM, por três a quatro horas, para alcançar a fase logarítmica de crescimento. Diluir a cultura por um fator de dois usando caldo LB. Meça a densidade óptica da cultura a 600 nanômetros de comprimento de onda de luz em um espectrofotômetro.

Uma vez que o OD atinja um, faça duas alíquotas de 1 mL de cultura, em tubos de microfusão de 1,5 mL. Centrifugar os tubos a 7.750 G por 15 minutos. Descarte este supernatante e lave a pelota com 1 mL de 1XPBS duas vezes.

Centrifugar os tubos a 7.750 G por 15 minutos. Resuspenja a pelota em 0,5 mL de 1XPBS, em dois tubos diferentes de microfuça de 1,5 mL. Combine as suspensões de ambos os tubos, em um tubo de 1,5 mL, agora contendo, aproximadamente dois multiplicados por 10 elevados à potência oito unidades formadoras de colônias por mL.

Prepare uma suspensão celular bacteriana de 10 potências seis UFC/mL, diluindo a solução de estoque. Nota importante, otimize a UFC correspondente ao OD em seu laboratório, para determinar a UFC para um OD, antes de iniciar os experimentos. Ratos e infecções.

No dia da infecção, segure o rato com uma mão, limpe a pele abdominal com 70% de etanol e espalhe as patas traseiras para melhor acessibilidade da parede abdominal. Injete 0,5 mL de 10 elevados à potência seis suspensão bacteriana CFU/mL intraperitoneally, com a ajuda de uma seringa de 1 mL. Pós-infecção, aplaque a cultura para verificar a CFU real injetada, que pode variar de 0,2 a 0,8 milhões de UFC por 0,5 mL.

Avaliação da UFC dos órgãos. O rato foi sacrificado usando asfixia por dióxido de carbono. Depois de sacrificar o rato infectado, limpe o abdômen com um pedaço de algodão, mergulhado em 70% de etanol.

Abra a pele abdominal. Consulte o artigo de Ray e Dittle, para um protocolo de vídeo, sobre como coletar fluido de lavage peritoneal. Abra a cavidade peritoneal e colete o órgão de interesse.

Neste vídeo, estamos demonstrando a enumeração do órgão CFU do fígado. O fígado sofre extensos danos histopatológicos, neste modelo de sepse. Corte um pequeno pedaço de fígado e coloque-o em um tubo de microfuça.

Isso pode ser armazenado no gelo por duas a três horas, antes de prosseguir para o próximo passo. Pesar a peça e transferi-la para um tubo de microfusão. Preferencialmente, corte as peças pesando em torno de 10 a 15 mgs, para homogeneização adequada.

Adicione 0,5 mL de 1XPBS no tubo e homogeneize os órgãos usando um homogeneizador de mão. Certifique-se de que os órgãos estão completamente homogeneizados. Compondo o volume a 1 mL, adicionando 0,5 mL de 1XPBS.

Centrifugar os tubos a 200 G por cinco minutos, a 4 graus celsius. Colete o supernatante em tubos de microfuge frescos. Prepare diluições de 10 para a potência menos um, e 10 para a potência menos dois, em uma placa de 96 poços.

Espalhe 50 microliter do diluído, em placas frescas de ágar SS, e incubar as placas a 37 graus celsius por 12 horas. Conte o número de colônias que aparecem em cada condição, e normalize os dados com o peso do órgão, utilizando a seguinte fórmula. A UFC/mg é igual ao número de colônias, multiplicada por 20, multiplicada pelo fator de diluição, o todo dividido pelo peso do órgão em mgs.

Note que o número 20 é usado na fórmula, para converter as colônias por placa em CFU/mL. Este número é chegado, dividindo 1 mL da quantidade de um determinado volume de cultura banhado. Neste caso, 50 microliter.

Por exemplo, se você encontrar uma centena de colônias em uma placa de ágar SS, onde 50 microliter de 10 potências menos uma diluição de órgão homogeneizado, pesando 10 mgs é espalhado, então a UFC/mg será igual a 100 multiplicado por 20, multiplicado por 10, o todo dividido por 10, que é igual a 2000 UFC/mg. Análise citométrica de vários grupos imunológicos em exsudato peritoneal. Coletar as células peritoneal como descrito anteriormente, por Ray e Dittle.

Resuspense a pelota celular do fluido de lavage peritoneal, em 1 mL de RPMI complementado com 10% de FBS. Enumerar os números totais de células na lavagem peritoneal, usando um hemócito. Ajuste o número da célula de tal forma, que cada tubo receba de dois a cinco multiplicados por 10 elevados à potência cinco células.

Gire as células a 200 G a 4 graus celsius por 10 minutos. Descarte o supernatante. Lave as células uma vez com 1XPBS.

Centrifugar as células a 200 G por 10 minutos. Bloqueie os receptores Fc usando bloqueador FcR. Uma delas é a diluição de 400, preparada no tampão de bloqueio, composta por 5% FBS e 0,02% de azida de sódio na PBS.

Incubar no gelo por 15 minutos. Centrifugar as células a 200 G por 10 minutos. Descarte o supernatante.

Diluir os anticorpos conjugados fluorocromo de interesse em bloquear o buffer. Aqui, usamos uma é para 500 diluição de Ly6G anti-rato, para manchar neutrófilos. Note que outras populações de células imunes também podem ser mostradas, usando o anti-rato B220 para células B, CD3 anti-rato para células T, anti-rato F4/80 para macrófagos, etc.

Incubar cerca de 0,2 milhão de células em 200 microlitres de soluções diluídas de anticorpos, em tubos separados. Como controle negativo, reserve um tubo em cada tipo fluorocromo, para controle não manchado. Neste tubo, incubar as células com 200 microliter de tampão de bloqueio sem anticorpos.

Incubar as amostras no gelo por 45 minutos, com toques intermitentes a cada 15 minutos. Centrifugar as células a 200 G por 10 minutos, a 4 graus celsius. Descarte o supernatante.

Fixar as células com 4% de paraformaldeído por 15 minutos em temperatura ambiente, se necessário para armazenar por vários dias. Resuspense as células em 200 microliter de tampão de coloração FACS, 2% FBS em PBS. Adquira os dados no citômetro de fluxo.

As imagens das placas de ágar ss mostradas aqui, indicam a carga de CFU do órgão no fígado e baço de camundongos sépticos. O órgão homogeneizado Lys6 foi espalhado em diluição de 10 para a potência menos um, e incubado a 37 graus celsius. As colônias de S.Typhimurium pigmentadas negras apareceram após cerca de 12 horas após a incubação.

Uma parte da placa é mostrada aqui como entrada ampliada para destacar as colônias. Esses resultados sugerem que o patógeno se disseminou sistematicamente e colonizou os órgãos internos. Esta figura mostra a soro isolada de camundongos saudáveis e sépticos.

O volume de sangue colecionável de camundongos sépticos é menor do que os controles saudáveis, por isso o soro obtido é menor. Isso acontece por causa do aumento da coagulação na sepse. Também a sera de camundongos sépticos, apresentam coloração vermelha distinta, indicando a ocorrência de hemólise extensiva.

A figura mostra parcelas citométricas de células peritoneal de camundongos saudáveis e sépticos, manchadas com anticorpo anti-Ly6G. Estas imagens são representativas de um camundongo saudável e dois infectados. Camundongos sépticos viram uma infiltração aumentada de neutrófilos na cavidade peritoneal.

Neste vídeo, mostramos um método de induzir a sepse bacteriana em camundongos, por injeção intraperitoneal de Salmonella Typhimurium. Este é um modelo útil para estudar os efeitos das intervenções terapêuticas na atenuação da sepse. Neste sistema modelo, a composição celular da cavidade peritoneal muda drasticamente para combater o patógeno.

Portanto, é um modelo útil, no estudo das alterações cinéticas nas composições e funções das células imunes durante a sepse. O modelo também é útil na compreensão do aumento de espécies intercelulars de oxigênio reativo, níveis pró-inflamatórios de citocina, hemolise e coagulação sanguínea, tudo isso acontece durante a sepse.