Name: Estudando o Mecananosense do Intestino Delgado Urinário de Partículas Luminais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a estudar o mecanossenso intestinal em roedores usando um protocolo modificado de gavagem e imagem ex vivo. Este método permite analisar o trânsito de materiais com diferentes propriedades físicas no intestino delgado.

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Agradecemos à Sra. Lyndsay Busby pela assistência administrativa e ao Sr. Joel Pino pelo apoio da mídia. As subvenções do NIH apoiaram este trabalho: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 e Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Mayo Clinic.
1. Configuração
<ol><li>Ratos rápidos de 8 a 10 semanas de idade por 4 h. Forneça aos ratos acesso à água. NOTA: Usamos camundongos machos C57BL/6J do tipo selvagem para todos os experimentos apresentados aqui, mas eles podem ser realizados em camundongos de qualquer cepa, gênero e genótipo.</li>
	<li>Arrefecer 15 ml de água destilada num tubo cónico de 50 ml num frigorífico a 4 °C.</li>
	<li>Aqueça mais 15 mL de água destilada em um copo usando uma placa quente com uma barra de agitação magnética a aproximadamente 80-90 °C.</li>
	<li>Meça 0,5% de metilcelulose para um total de 30 mL (0,15 g).</li>
	<li>Adicione suavemente a metilcelulose a 15 mL de água quente para que ela não se aglomer. A solução de metilcelulose ficará turva durante este processo.</li>
	<li>Uma vez dissolvido, retire o copo da placa quente e adicione os 15 mL de água gelada ao copo quente.</li>
	<li>Colocar num frigorífico a 4 °C até que a solução esteja límpida, aproximadamente 15-20 min.</li>
	<li>Quando estiver límpido, pesar 3 mg de isotiocianato de rodamina (RITC)-dextrano por 5 ml de solução de metilcelulose a 0,5% e misturar para combinar. Esta é a condição líquida na seção Resultados Representativos .<ol><li>Em alternativa, pesar 25 mg de microesferas fluorescentes de polietileno e misturar com 200 μL da solução de metilcelulose até incorporar bem. A incorporação completa de microesferas é assegurada pelo vórtice antes da gavagem. O experimentador deve visualizar a distribuição homogênea das microesferas suspensas na mistura.</li>
		<li>Como a solução RITC-dextran é sensível à luz, refrigere a solução. Preparar a solução de RITC-dextran e a mistura de microshpere com antecedência e utilizar no prazo de 2 meses. Ressuspenda a mistura de microesferas antes de ser usada. NOTA: Microesferas de tamanhos variados são usadas para estudar o manuseio gastrointestinal de diferentes materiais. Na seção Resultados Representativos , demonstramos os resultados do uso de microesferas pequenas (diâmetro: 75-90 μm) e maiores (diâmetro: 180-212 μm).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Gavagem do conteúdo intraluminal
<ol><li>Preparar a gavagem ligando um tubo de alimentação de 18 Ga x 50 mm a uma seringa de 1 ml e retirando 200 μL de solução RITC ou solução de microesfera.</li>
	<li>Conservar manualmente o animal em jejum utilizando a técnica de contenção com uma mão25. Consulte as informações da instituição sobre as técnicas adequadas de contenção murina.</li>
	<li>Insira suavemente o tubo de alimentação através da boca e do esôfago do rato até que ele entre no estômago. NOTA: A etapa de gavagem é fundamental para um experimento bem-sucedido. Requer mãos experientes que possam inserir consistentemente o tubo aproximadamente à mesma distância em cada rato. Essa etapa precisa ser padronizada pelos experimentadores que realizam o protocolo. O mesmo experimentador deve gavagar todas as coortes de camundongos que serão comparadas entre si.</li>
	<li>Expulse lentamente o conteúdo da seringa para o estômago e remova cuidadosamente o tubo do rato.</li>
	<li>Após a gavagem, devolva o rato à gaiola.</li>
	<li>Descarte o tubo de gavagem.</li>
	<li>Repita o processo conforme necessário para o número desejado de animais.</li>
</ol>3. Dissecção intestinal
<ol><li>Antes de iniciar as dissecções, ligue o instrumento de imagem in vivo para permitir que ele atinja a temperatura.</li>
	<li>Sacrifique o rato 30 min após a gavagem. Use a inalação de dióxido de carbono para sacrificar o rato, seguida de luxação cervical para garantir uma eutanásia bem-sucedida.</li>
	<li>Depois de confirmar a eutanásia bem-sucedida, coloque o rato em decúbito dorsal em um estágio de dissecção e fixe seus quatro apêndices no palco para ter acesso ao abdômen. Molhe a superfície do abdômen com etanol a 70% para molhar os pelos abdominais.</li>
	<li>Use pinça de microdissecção 5 para puxar a pele e adquirir tesoura cirúrgica afiada para fazer uma incisão transversal 1 cm acima do ânus. Para expor a cavidade intraperitoneal, continue a incisão verticalmente até o abdômen até a caixa torácica.</li>
	<li>Mova suavemente o ceco para a esquerda com a pinça de microdissecção para expor o cólon distal.</li>
	<li>Corte o cólon distal com uma tesoura de microdissecação apenas proximal ao reto.</li>
	<li>Desvende suavemente o cólon, o ceco e o intestino delgado, puxando lentamente na direção oposta. NOTA: Manter os intestinos dissecados em um segmento contínuo criará a maior facilidade para o investigador. Rasgos e rasgos ao longo do segmento farão com que as etapas subsequentes sejam mais difíceis.</li>
	<li>Use uma tesoura de microdissecação para cortar a proximal do estômago.</li>
	<li>Use fórceps para transferir os intestinos dissecados para a folha de medição (Figura 1). Coloque o estômago a 0 mm e disponha os intestinos ao longo da régua até 200 mm. Use uma tesoura de microdissecação para cortar a 200 mm. Repita este processo de alinhamento dos intestinos de 0 mm a 200 mm ao longo das réguas, mantendo-se confiante de que a orientação dos intestinos não se confunde.<ol><li>Tenha cuidado para evitar esticar as entranhas enquanto se alinha com as réguas.</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez que o tecido esteja disposto na régua, organize o ceco de modo que ele seja paralelo ao tecido, mas não em contato direto com ele (se alguma fluorescência for encontrada dentro dessa região, será necessária uma distinção clara entre o ceco e os intestinos).</li>
	<li>Coloque a folha de medição com o tecido dissecado em uma área escura para que a fluorescência possa ser preservada até a hora da imagem.</li>
</ol>4. Imagem ex vivo
<ol><li>Abra o software de imagem in vivo e faça login.</li>
	<li>Inicialize o instrumento de imagem para que ele esteja pronto para a aquisição de imagens.</li>
	<li>Defina os campos 'Citação' e 'Emissão' para a cor correspondente usada para a gavagem de contas ou RITC. Vermelho (líquido): excitação 535 nm /emissão 600 nm. Verde (microesferas): excitação 465 nm /emissão 520 nm.</li>
	<li>Defina a exposição como 'Auto'.</li>
	<li>Selecione o campo de visão.</li>
	<li>Antes de colocar a folha de medição no instrumento, certifique-se de que os intestinos não se deslocaram durante o transporte.</li>
	<li>Coloque a folha de medição no instrumento dentro do campo de visão.</li>
	<li>Feche com segurança a porta do instrumento e selecione Instantâneo para fotografar o campo de visão.</li>
	<li>Salve as imagens coletadas em uma unidade flash para análise. Salve capturas individuais das imagens fluorescentes e fotográficas. Uma sobreposição da fotografia e fluorescência indica a localização do material fluorescente no trato gastrointestinal (Figura 1). Observação : recomendamos salvar os arquivos no formato de arquivo de imagem de marca (.tif) para processamento downstream.</li>
</ol>5. Análise
<ol><li>Abra os arquivos de imagem fluorescentes e de fotografia em um software de edição de imagens.</li>
	<li>Ajuste o tamanho do pixel de ambas as imagens de modo que elas tenham exatamente as mesmas dimensões (nossa convenção era definir ambas as imagens para 1280 pixels por 850 pixels [altura x largura]).</li>
	<li>Feche o arquivo de fotografia. As etapas a seguir envolvem apenas a imagem fluorescente.</li>
	<li>Use uma ferramenta de borracha para remover o plano de fundo e torná-lo transparente. Uma borracha pode ser necessária para remover manchas do plano de fundo restante.</li>
	<li>Crie uma nova camada. Torne-o um fundo totalmente preto para o sinal fluorescente. Isso pode ser conseguido escolhendo um preenchimento preto para a camada e arrastando a camada para ficar abaixo da camada com a imagem fluorescente.</li>
	<li>Salve a nova imagem fluorescente, contendo apenas o sinal fluorescente em um fundo preto, como um novo arquivo de .tif.</li>
	<li>Abra as novas imagens fluorescentes e fotográficas no ImageJ.</li>
	<li>Transforme cada imagem em uma imagem de 32 bits escolhendo Imagem > Tipo > 32 bits.</li>
	<li>Crie uma imagem mesclada de ambos escolhendo Imagem > Cores > Mesclar canais. Na caixa de diálogo que é aberta, selecione o arquivo de fotografia para o canal cinza e o arquivo fluorescente em qualquer canal colorido.</li>
	<li>Desative a escala da imagem mesclada selecionando Analisar > Definir escala > Clique para remover escala.</li>
	<li>Selecione a ferramenta "Retângulo" no ImageJ.</li>
	<li>Desenhe um retângulo em torno de uma seção do intestino delgado. Preste muita atenção à largura dessa região de interesse (ROI), pois ela deve permanecer constante entre todos os ROIs. O valor nominal não é essencial, apenas que é mantido consistente em todas as ROIs desenhadas nesta imagem [uma vez que o intestino delgado assume várias linhas, ROIs individuais serão desenhadas em cada seção do intestino delgado em uma linha diferente (Figura 1)]. A Figura 2 mostra o local do valor de largura na barra de ferramentas ImageJ.</li>
	<li>Duplique o ROI selecionando Imagem > Duplicar. Selecione apenas o canal correspondente ao canal colorido.</li>
	<li>Use a ferramenta retângulo novamente para desenhar um ROI sobre toda a nova imagem.</li>
	<li>Recupere um perfil da fluorescência selecionando Analisar perfil de plotagem >. O gráfico resultante plota no eixo y a intensidade média de cada pixel ao longo do comprimento do ROI. Este foi selecionado na etapa 5.12 para ser o comprimento da seção analisada do intestino delgado</li>
	<li>Abra a lista de valores e copie-os para um software de planilha.</li>
	<li>Repita os passos 5.12-5.16 para cada seção do intestino delgado em uma linha de régua diferente. Continue colando os valores no mesmo arquivo de planilha imediatamente abaixo de cada conjunto anterior de valores, de modo que todas as linhas contínuas nessa coluna contenham o valor de intensidade média para todo o comprimento do intestino delgado.</li>
	<li>No software de planilha, multiplique cada valor de intensidade média pela largura constante do retângulo de ROI criado na etapa 5.12. Isso produzirá o valor real da intensidade ao longo do intestino delgado em cada ponto. NOTA: Diferentes animais terão pequenas variações no comprimento do intestino delgado. Para evitar que as diferenças de comprimento afetem o resultado da análise de dados a jusante, a cadeia de valores de intensidade precisa ser agrupada em um número consistente de compartimentos em todas as amostras experimentais (a Figura 3, a Figura 4 e a Figura 5 exibem os resultados para três tamanhos de compartimentos).</li>
	<li>Divida o número de valores de intensidade pelo número de compartimentos desejados. O quociente resultante S determina o número de valores de intensidade que estão sendo incluídos em cada compartimento.</li>
	<li>Determine o compartimento para onde cada valor de intensidade bruta irá usando uma fórmula de arredondamento. Esta etapa coloca cada valor de intensidade bruta em uma caixa. Cada valor de intensidade bruta é indexado cronologicamente com o inteiro N. O quociente N/S determina o número de compartimentos atribuído a cada valor bruto. A fórmula de arredondamento deve arredondar esse quociente para um número inteiro sem decimais.</li>
	<li>Gere o valor para cada compartimento usando uma fórmula averageif. O objetivo é calcular a média dos valores brutos atribuídos a um compartimento específico na Etapa 5.20. Assim, os argumentos na fórmula devem ser: (1) compartimentos atribuídos gerados na Etapa 5.20, (2) número do compartimento, (3) valores de intensidade bruta. NOTA: A primeira análise que podemos realizar nos dados binados é uma análise de centro geométrico, que quantifica até que ponto observamos a maior intensidade fluorescente ao longo do intestino delgado (Figura 4).</li>
	<li>Normalize cada valor de intensidade sobre a intensidade fluorescente total. Em outras palavras, divida cada valor de intensidade pela soma de todas as intensidades.</li>
	<li>Multiplique cada valor normalizado pelo número do compartimento. O produto reflete o peso relativo de cada caixa, contribuindo para a intensidade fluorescente total.</li>
	<li>A soma de todos os valores gerados na Etapa 5.23 produz o número do compartimento no centro do sinal fluorescente. Divida pelo número de caixas para expressar o centro geométrico como a fração do intestino delgado percorrida pelo centro fluorescente. NOTA: Para refletir a distribuição espacial do sinal, a próxima etapa é gerar o espectro de potência do conjunto de dados de intensidade binned (Figura 5).</li>
	<li>Abra um assistente de Transformação Rápida de Fourier (FFT) no software de planilha. Selecione a entrada como o conjunto de dados binned e a saída como um conjunto vazio do mesmo número de linhas que bins.</li>
	<li>Extraia o componente de valor real da FFT.</li>
	<li>Eleve cada valor real da FFT para a segunda potência. Isso produz um conjunto de dados de espectros de potência.</li>
	<li>Selecione a primeira metade do conjunto de dados de espectros de potência e mova-o para que fique abaixo da segunda metade. Isso tem o efeito de centralizar os espectros de potência em torno da frequência central quando ela é plotada na próxima etapa.</li>
	<li>Plote os espectros de potência no eixo y de um gráfico x-y onde os valores do eixo x são o intervalo de -1 x (número de caixas/2) a (número de caixas/2) -1. No caso de 1000 caixas, os valores do eixo variariam de -500 a 499.</li>
	<li>Os espectros de potência para cada animal devem ser comparados com base na propagação de picos diferentes de zero e nas alturas desses picos diferentes de zero.</li>
</ol>

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</ol>

O trato gastrointestinal, assim como outros órgãos tubulares, como os vasos sanguíneos, necessita de sensores mecânicos e efetores para manter a homeostase26,27,28. No entanto, o trato gastrointestinal é único na medida em que as propriedades físicas dos materiais que o atravessam não são constantes entre as refeições. Conteúdos intraluminais de várias propriedades físicas (sólido, líquido e gasoso) transitam pelo intestino, ger...

O trato gastrointestinal (GI) humano é um sistema de órgãos de vários metros de comprimento, aproximadamente aproximado como um tubo de diferentes dimensões e propriedades físicas1. À medida que o conteúdo se move através de seu comprimento, a principal função do trato gastrointestinal é absorver substâncias críticas para a vida. O intestino delgado é especificamente responsável pela absorção de nutrientes. O trânsito do intestino delgado é rigidamente regulado para combinar com as funções de digestão e absorção, resultando em vários padrões de motilidade. Bayliss e Starling descreveram a "lei do intestino"2 em 1899, mostrando o programa de propulsão contrátil no intestino conhecido hoje como reflexo peristáltico; o segmento proximal ao bolo alimentar se contrai para impulsioná-lo para a frente, e o segmento distal relaxa para recebê-lo. Em teoria, esse padrão por si só poderia ser suficiente para transportar material aboricamente, mas mais de um século de pesquisa pintou um quadro mais complexo da atividade contrátil no trato gastrointestinal. Três períodos de motilidade do intestino delgado são reconhecidos em humanos: o complexo motor migratório (MMC), o período de jejum e o período pós-prandial3. Os mesmos padrões foram relatados em camundongos 4,5. A MMC é um padrão motor cíclico conservado na maioria dos mamíferos 6,7. A MMC tem um padrão característico de quatro fases que serve como um marcador clínico útil nos distúrbios gastrointestinais funcionais7. As quatro fases, em ordem de ocorrência, são (I) quiescência, (II) contrações irregulares e de baixa amplitude, (III) contrações regulares de alta amplitude e (IV) período de rampa para baixo de atividade declinante7. O MMC marca o principal padrão motor do período de jejum3. MMCs do período de jejum limpar o conteúdo do intestino delgado em preparação para a próxima refeição.
Os padrões motores do período pós-prandial são otimizados para as funções digestiva e absortiva3. Independentemente da composição calórica, o trânsito inicial é rápido ao longo do intestino delgado, o conteúdo é espalhado ao longo do comprimento do intestino e, posteriormente, o trânsito diminui8. A absorção é otimizada aumentando a área de superfície de contato e retardando-a para aumentar o tempo de residência. Uma vez que os nutrientes estão dentro do lúmen, o padrão dominante consiste em contrações descoordenadas próximas (<2 cm de distância) (contrações segmentadoras), com algumas contrações sobrepostas de grande amplitude abrangendo toda a extensão do intestino delgado (contrações peristálticas)9. As contrações segmentantes misturam o conteúdo intraluminal no lugar. As grandes contrações peristálticas ocasionais impulsionam o conteúdo em direção ao cólon.
O momento dessa transição de volta aos MMCs depende do volume de alimentos e da composição calórica10. Assim, o intestino delgado amostras pistas luminais para regular quando a transição entre os períodos de motilidade. Pistas mecânicas, como propriedades físicas do conteúdo luminal11, volume luminal e tensão da parede, envolvem células mecanorreceptoras na parede gastrointestinal 12,13,14,15,16. De fato, o aumento do componente sólido de uma refeição leva a um aumento no trânsito do intestino delgado17. Especulamos que propriedades físicas, como o estado líquido ou sólido dos conteúdos intraluminais, devem envolver diferentes mecanorreceptores devido às várias forças que geram na parede gastrointestinal18.
O padrão-ouro para medir o trânsito gastrointestinal in vivo em humanos, como em camundongos, é o uso de marcadores radioativos medidos por cintilografia à medida que saem do estômago ou transitam ao longo do cólon19,20. Em mamíferos, o intestino delgado circula de maneiras imprevisíveis, tornando o intestino delgado difícil de visualizar in vivo de forma confiável, mas o progresso está sendo feito21. Além disso, atualmente há uma falta de ferramentas para quantificar como o intestino delgado lida com partículas de propriedades e tamanhos variados. O ponto de partida aqui foi uma técnica padrão-ouro que padroniza o estudo do trânsito do intestino delgado 22,23,24 e da função de barreira 22. Consiste em gavagar camundongos com material fluorescente, aguardar a motilidade gastrointestinal para transportar o material, excisar o trato gastrointestinal, segmentá-lo em várias seções do estômago ao cólon, seccionar e homogeneizar o conteúdo intraluminal para quantificação da fluorescência. Fizemos duas melhorias. Primeiro, alteramos a composição do conteúdo gavado para incluir contas microscópicas fluorescentes para determinar como o intestino delgado distribui partículas físicas. Em segundo lugar, melhoramos a resolução espacial ao visualizar todo o trato gastrointestinal, do estômago ao cólon, ex vivo e usamos binning de tamanho variável para padronizar nossa análise entre os animais. Postulamos que isso revela novos insights sobre o equilíbrio das contrações propulsivas versus segmentadoras durante a fase pós-prandial.

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>outros camundongos podem ser usados com este protocolo</td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Software Excel</td><td>Microsoft</td><td>n/a</td><td>usado para análise de planilhas</td></tr><tr><td>Microesferas de Polietileno Verde Fluorescente 1.00g/cc 75-90um - 10g</td><td>Cosférico</td><td>UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g</td> <td>"contas menores" no manuscrito</td></tr><tr><td>Microesferas de polietileno verde fluorescente 1,00g/cc 180-212um - 10g</td><td>Cosférico</td><td>UVPMS-BG-1,00 180-212um - 10g</td> <td>"contas maiores" no manuscrito</td></tr><tr><td>Agulhas de gavagem</td><td>Instech</td><td>FTP-18-50-50</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>usado para extrair perfil de fluorescência</td></tr><tr><td>Papel de régua laminado (preparado internamente)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose (viscosidade: 400 cP)</td><td>Sigma</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>Software Photoshop</td><td>Adobe</td><td>n/a</td><td>usado para processamento de imagem</td></tr><tr><td>Isotiocianato de rodamina B-Dextrano</td><td>Sigma</td><td>r8881-100mg</td> <td>condição "líquida" no manuscrito</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Sistema de imagem in vivo</td></tr></tbody></table>

estudando o mecananosense do intestino delgado urinário de partículas luminais

Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

A motilidade gastrointestinal (GI) é fundamental para a digestão e absorção normais. No intestino delgado, que absorve nutrientes, a motilidade otimiza a digestão e a absorção. Por esta razão, alguns dos padrões de motilidade no intestino delgado incluem segmentação para mistura de conteúdo luminal e peristaltismo para sua propulsão. As propriedades físicas do conteúdo luminal modulam os padrões de motilidade do intestino delgado. A estimulação mecânica dos circuitos mecanossensoriais gastrointestinais pelo conteúdo luminal em trânsito e pela motilidade intestinal subjacente inicia e modula padrões motores GI complexos. No entanto, os mecanismos mecanossensoriais que impulsionam esse processo permanecem pouco compreendidos. Isto é principalmente devido à falta de ferramentas para dissecar como o intestino delgado lida com materiais de diferentes propriedades físicas. Para estudar como o intestino delgado lida com partículas de tamanhos variados, modificamos um método estabelecido in vivo para determinar o trânsito do intestino delgado. Nós gavagamos ratos vivos com líquido fluorescente ou minúsculas contas fluorescentes. Após 30 minutos, dissecamos os intestinos para obter imagens da distribuição do conteúdo fluorescente em toda a totalidade do trato gastrointestinal. Além das medições de alta resolução do centro geométrico, usamos binning de tamanho variável e análise espectral para determinar como diferentes materiais afetam o trânsito do intestino delgado. Exploramos como um mecanismo de "toque intestinal" recentemente descoberto afeta a motilidade do intestino delgado usando essa abordagem.

Mostramos resultados representativos a partir do Passo 3 em diante. A Figura 1 mostra os intestinos explantados intactos, com medidas fluorescentes sobrepostas. O estômago (roxo) é colocado ao longo do mesmo eixo que o intestino delgado (laranja), mas preferimos mover o ceco (azul) para o lado para evitar a sobreposição com o intestino grosso (laranja). Como evidenciado no painel esquerdo, isso nem sempre é possível devido ao tamanho do órgão. Cortamos o intestino delgado a ~200 mm para maxi...

Para estudar como o intestino delgado lida com partículas de tamanhos variados, modificamos um método estabelecido in vivo para determinar o trânsito do intestino delgado.

Estudando o Mecananosense do Intestino Delgado Urinário de Partículas Luminais

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Este é um protocolo que estuda como o intestino delgado lida com materiais de diferentes propriedades físicas e como distribui esses materiais no espaço. É uma ferramenta complementar em nosso estudo da mecanossensibilidade intestinal. As principais vantagens deste protocolo são que ele pode ser usado para estudar materiais ou misturas com diferentes propriedades físicas e que a resolução nos permite resolver trânsitos regionais em segmentos intestinais curtos.Esta técnica contribui para a nossa compreensão da mecanossensibilidade intestinal. Isso nos ajuda a entender como o intestino delgado toma decisões de trânsito com base nas pistas mecânicas que recebe do conteúdo intraluminal. Para começar, prepare a gavagem anexando um tubo de alimentação de espessura de calibre 18 e comprimento de 50 milímetros a uma seringa de 1 mililitro e desenhando 200 microlitros de solução RITC ou solução de microesfera.Em seguida, restrinja manualmente o animal em jejum usando a técnica de contenção com uma mão e, em seguida, insira suavemente o tubo de alimentação através da boca e do esôfago do rato até que ele entre no estômago. Uma vez inserido, expulse lentamente o conteúdo da seringa para o es

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Íleo pós-operatório (POI) é uma complicação da cirurgia abdominal levando a um aumento da morbidade e permanência hospitalar prolongada. Porque estratégias profiláticas e terapêuticas faltam pesquisa intensificada é necessário. Por isso, estabeleceu um modelo de mouse padronizada e viável para o entendimento da fisiopatologia POI e estudar potenciais opções terapêuticas.

Avaliação Funcional da motilidade intestinal e inflamação da parede do intestino em Roedores: Análises em um modelo padronizado de Manipulação Intestinal

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de alça ileal para estudar a permeabilidade intestinal em um modelo de camundongo. Este método fornece um modelo vivo para entender a função da barreira epitelial e a consequente resposta imune.

Modelo de alça ileal de camundongo: um modelo cirúrgico para estudar a permeabilidade intestinal no camundongo

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para gerar alça de cólon proximal de camundongo ou segmento pcLoop seguido de injeção intraluminal de marcadores fluorescentes no segmento para estudar a permeabilidade epitelial intestinal.

Geração do modelo de alça de cólon proximal de camundongo: um procedimento cirúrgico para gerar alça de cólon proximal e medir a permeabilidade intestinal pela detecção de marcadores fluorescentes no soro após injeção intraluminal

A medição in vivo das contrações do músculo liso ao longo do trato gastrointestinal de animais de laboratório continua sendo uma técnica poderosa, embora subutilizada. Strain gages flexíveis de elemento duplo não estão disponíveis comercialmente e requerem fabricação. Este protocolo descreve a construção de strain gages confiáveis e baratos para implantação aguda ou crônica em roedores.

Fabricação e Implantação de miniatura de elemento duplo Medidores de tensão para medição<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinal Contrações em roedores.

Este protocolo descreve o uso de preparações de tecido intestinal excisadas ou "sacos intestinais" como um modelo ex vivo da função da barreira intestinal. Este modelo pode ser usado para avaliar a integridade da barreira epitelial e da camada de gel mucoso em locais intestinais específicos em modelos animais de doenças digestivas.

Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

Este artigo descreve uma técnica de imagem de vídeo e mapeamento espaço-temporal de alta resolução para identificar mudanças na regulação neural da motilidade colônica em camundongos adultos. Efeitos sutis na função gastrointestinal (GI) podem ser detectados usando essa abordagem em preparações de tecidos isolados para avançar nossa compreensão da doença gastrointestinal.

Vídeo Imagem e Mapas espaço-temporais para analisar Motilidade Gastrointestinal em Ratos

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

Este estudo apresenta um método de imagem 3D usando tecidos intestinais de montagem total e microscopia multifóton para quantificar o muco secretado, permitindo uma análise volumétrica precisa e visualização da dinâmica do muco em resposta a estímulos como o cloreto de carbamoilcolina.

Quantificação tridimensional do muco intestinal usando imagens de tecido de montagem total

Este artigo descreve: (1) entrega oral por gavage de moléculas de teste para camundongos neonatais já no DOL 6; e (2) avaliação ex vivo da função da barreira epitelial do cólon em biópsias desde filhotes DOL 10 até desmame (DOL 20), avaliando a permeabilidade paracelular e transcelular com câmaras de Ussing.

Gavage Oral em Filhotes de Camundongos Neonatais e Avaliação Funcional da Integridade da Barreira Intestinal Usando Câmaras de Uso

Aprenda a estudar o mecanossenso intestinal em roedores usando um protocolo modificado de gavagem e imagem ex vivo. Este método permite analisar o trânsito de materiais com diferentes propriedades físicas no intestino delgado.

Estudando o Mecananosense do Intestino Delgado Urinário de Partículas Luminais

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