Name: Visualizando a motilidade bacteriana com base em uma reação de cor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Aprenda a detectar motilidade bacteriana usando o método de ágar semi-sólido com TTC. Este protocolo simples diferencia Staphylococcus aureus e Escherichia coli por reação de cor, sendo ideal para microbiologistas clínicos e pesquisadores.

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Este estudo foi apoiado pelo Desenvolvimento do Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD) e pelo Projeto de Pesquisa de Reforma do Ensino da Universidade Farmacêutica da China (2019XJYB18).

1. Preparo do meio semissólido
<ol><li>Ágar semissólido tradicional
	<ol><li>Preparar o ágar semissólido tradicional de acordo com a receita do meio teste de motilidade bacteriana utilizando os ingredientes básicos11. Dissolver 10 g de triptose, 15 g de NaCl, 4 g de ágar em água destilada suficiente, ajustar o pH para 7,2 ± 0,2 e perfazer o volume final para 1.000 mL.</li>
		<li>Autoclavar o ágar a 121 °C por 20 min e distribuí-lo em tubos de ensaio de 10 mL como meio semissólido de 3 cm de altura.</li>
	</ol></li>
	<li>Ágar semissólido tradicional com TTC
	<ol><li>Após a autoclavagem do meio semissólido convencional, resfriá-lo a 50 °C, adicionar 5 mL de solução TTC 1% estéril a 100 mL de meio, misturar e dispensá-lo em tubos de ensaio de 10 mL para formar um meio semissólido de 3 cm de altura.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cepas bacterianas
NOTA: Oitenta cepas foram isoladas do ambiente aquático e identificadas usando um instrumento automatizado de identificação bacteriana (ver Tabela de Materiais), incluindo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp. , Klebsiella pneumoniae e Aeromonas hydrophila (Tabela 1). Staphylococcus aureus (ver Tabela de Materiais) foi utilizado como controle negativo não móvel; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium (ver Tabela de Materiais) foram utilizadas como cepas controle positivas.
<ol><li>Identificar cepas bacterianas de teste a serem usadas para análise de motilidade.</li>
	<li>Inclua controles negativos não móveis e cepas de controle positivo móveis.</li>
</ol>3. Observação da motilidade bacteriana reforçada pelo TTC
<ol><li>Seleccionar colónias únicas de bactérias de ensaio a partir de placas de ágar e inocular-as nos dois meios semissólidos acima referidos (passos 1.1.2 e 1.2.1) por punção utilizando agulhas inoculantes.</li>
	<li>Cultivar os tubos a 37 °C na incubadora por 24-48 h para observar os resultados.</li>
	<li>Observe o estado de crescimento: caracterize as bactérias como não móveis (-) se apenas a linha de punção for vermelha. Caracterizar as bactérias como móveis (+) se a cor vermelha se espalhar levemente para fora ao longo da linha de punção12.</li>
</ol>4. Efeito de diferentes concentrações de ágar sobre a motilidade bacteriana
<ol><li>Preparar meios semissólidos contendo 0,3%, 0,5% e 0,8% de ágar e inocular-os por punção, conforme descrito acima. Observe os resultados após 24-48 h de incubação.</li>
</ol>

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<li>Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+and+its+role+during+initial+stage+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis.</a> Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).</li>
<li>Ding, S. S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+flagella-dependent+motility+and+biofilm+in+bacteria+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Microbiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review.</a> Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).</li>
<li>Zeng, J., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+mechanism+of+bacterial+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).</li>
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<li>Chouhan, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+site-directed+mutagenesis+at+the+GGEEF+domain+of+the+biofilm+forming+GGEEF+protein+from+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae.</a> AMB Express. 6 (1), 2(2016).</li>
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<li>Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explore+the+influencing+factors+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Care+Today%22%5BJournal%5D)">Explore the influencing factors of bacterial motility.</a> Health Care Today. 6, 50-51 (2018).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Phytophthora+pathogens+deploy+effectors+to+interfere+with+bacterial+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 581511(2020).</li>
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<li>Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+agar+concentration+on+the+growth+and+morphology+of+submerged+colonies+of+motile+and+non-motile+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria.</a> Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).</li>
<li>Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+mechanism+for+how+sigma+factor+AlgT+and+transcriptional+regulator+AmrZ+inhibit+twitching+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).</li>
<li>Bartley, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+invasion+of+Neisseria+meningitidis+to+host+cells+is+related+to+surface+hydrophobicity%2C+bacterial+cell+size+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule.</a> PLoS One. 8, 55798(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A detecção da motilidade bacteriana pelo método do meio semissólido é afetada por váriosfatores13,14. Condições de crescimento bacteriano, como oxigênio (aeróbio na superfície do ágar, não aeróbio no fundo do tubo com o meio semissólido), pH e temperatura, podem afetar a viabilidade dos flagelos bacterianos, o que pode levar à redução da motilidade ou mesmo à perda da motilidade15. Além disso, algumas bactérias do tipo muco como sua motili...

A motilidade bacteriana desempenha um papel crítico na patogenicidade bacteriana, na formação de biofilme e na resistência a drogas1. A motilidade bacteriana está intimamente associada à patogenicidade e é necessária para a colonização bacteriana durante a infecção precoce das células dohospedeiro2. A formação de biofilme está intimamente relacionada à motilidade bacteriana, onde as bactérias aderem à superfície do meio sólido através da motilidade. A motilidade bacteriana tem sido considerada positivamente correlacionada com a formação de biofilme. Um alto grau de resistência bacteriana a drogas devido ao biofilme pode levar a infecções persistentes que são uma ameaça à saúde humana 3,4,5. Portanto, é importante detectar a motilidade bacteriana. O teste de motilidade bacteriana é usado principalmente para examinar a motilidade de diferentes formas de bactérias no estado vivo, que podem determinar indiretamente a presença ou ausência de flagelos e, portanto, tem um papel importante na identificação de bactérias.
Existem métodos diretos e indiretos para detectar a motilidade bacteriana6. Como as bactérias com flagelos apresentam motilidade, é possível detectar se as bactérias são móveis indiretamente, detectando a presença ou ausência de flagelos. Por exemplo, é possível detectar a motilidade indiretamente por microscopia eletrônica e coloração flagelar para indicar que as bactérias são móveis. Também é possível detectar por métodos diretos, como queda de suspensão e punção semissólida. 
O método de punção semissólido comumente utilizado em laboratórios de microbiologia de graduação para detectar motilidade bacteriana inocula a bactéria na punção em meio ágar semissólido contendo 0,4-0,8% de ágar, de acordo com a direção do crescimento bacteriano. Se a bactéria crescer ao longo da linha de punção para se espalhar, aparecem vestígios de crescimento semelhantes a nuvens (semelhantes a escovas), indicando a presença de flagelos e, portanto, motilidade. Se não houver vestígios de crescimento na linha de punção, a bactéria não é flagelada nem móvel. 
No entanto, este método tem suas desvantagens: as bactérias são incolores e transparentes, a atividade flagelar é afetada pelas características fisiológicas das bactérias vivas e outros fatores, e a concentração de ágar e o pequeno diâmetro do tubo de ensaio. Além disso, bactérias aeróbias são adequadas apenas para o crescimento na superfície do ágar, afetando a observação da motilidade bacteriana. Assim, para aprimorar este experimento, o cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) (incolor) foi adicionado ao meio para estabelecer um método mais confiável e intuitivo de determinação da motilidade bacteriana do que o método atual de punção direta, utilizando desidrogenases intracelulares para catalisar a formação de um produto vermelho do TTC 7,8,9,10.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>ATCC25922</td><td>Controlo positivo</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC27853</td><td>Controlo positivo</td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td>Controlo positivo</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td>Controle imóvel negativo</td></tr><tr><td>Triptose</td><td>&nbsp; OXOID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>VITEK 2 sistema automatizado de identificação microbiana</td><td>Bio M&eacute; rieux</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando a motilidade bacteriana com base em uma reação de cor

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

A motilidade bacteriana é crucial para a patogenicidade bacteriana, formação de biofilme e resistência a drogas. A motilidade bacteriana é crucial para a invasão e/ou disseminação de muitas espécies patogênicas. Portanto, é importante detectar a motilidade bacteriana. Condições de crescimento bacteriano, como oxigênio, pH e temperatura, podem afetar o crescimento bacteriano e a expressão de flagelos bacterianos. Isso pode levar à redução da motilidade ou mesmo à perda da motilidade, resultando na avaliação imprecisa da motilidade bacteriana. Com base na reação de cor do cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) por desidrogenases intracelulares de bactérias vivas, o TTC foi adicionado ao ágar semissólido tradicional para detecção da motilidade bacteriana. Os resultados mostraram que este método de ágar semissólido TTC para detecção de motilidade bacteriana é simples, fácil de operar e não envolve instrumentos grandes e caros. Os resultados também mostraram que a maior motilidade foi observada em meio semissólido preparado com 0,3% de ágar. Em comparação com o meio semissólido tradicional, os resultados são mais fáceis de avaliar e mais precisos.

Tanto as cepas padrão quanto as isoladas foram comparadas para detecção da motilidade, e os resultados são mostrados na Tabela 1. Devido à ausência de flagelos, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae cresceram apenas ao longo da linha inoculada em ambos os meios semissólido tradicional e TTC. Em contraste, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella typhimurium apresentaram crescimento em todas as direções ao redor da linhagem inoculada após c...

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar motilidade bacteriana baseado em uma reação de cor. As principais vantagens deste método são que é fácil de avaliar e mais preciso, e não requer equipamentos especializados.

Visualizando a motilidade bacteriana com base em uma reação de cor

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

A detecção da motilidade bacteriana é importante porque a motilidade é crucial para a patogenicidade. O protocolo aqui descrito é um método confiável para a detecção da motilidade bacteriana, pois se baseia na reação de cor do TTC com desidrogenases intracelulares de bactérias vivas. O método de ágar semi-sólido TTC para detectar a motilidade bacteriana é simples, fácil de operar e não envolve instrumentos grandes e caros.O método pode ser usado por microbiologistas clínicos ou pesquisadores para investigar bactérias patogênicas. Demonstrando o procedimento estará Xiyi Zhuang, um experimentalista sênior do meu laboratório. Para começar, prepare o meio semissólido tradicional adicionando 10 gramas de triptose, 15 gramas de cloreto de sódio e quatro gramas de ágar em um volume adequado de água destilada.Ajustar o pH a 7,2 e perfazer o volume final a 1 000 ml. Autoclave o meio a 121 graus Celsius por 20 minutos e dispense o meio em tubos de ensaio de 10 mililitros a uma altura de três centímetros. Para preparar o meio TTC, resfrie o meio tradicional autoclavado a 50 graus Celsius e, em seguida, adicione cinco mililitros de solução estéril de TTC a 1% a 100 mililitros de meio.Misture e dispense o meio em tubos de ensaio de 10 mililitros a uma altura de três centímetros. Escolha colônias únicas de bactérias de placas de ágar e inocule-as em ambos os meios semi-sólidos por punção usando agulhas inoculantes. Lembre-se de incluir as deformações não modais como controlos negativos e as deformações modais como controlos positivos.Para observar o efeito da concentração de ágar na motilidade bacteriana, prepare meios semi-sólidos contendo diferentes concentrações de ágar e inocule-os por punção. Incubar os tubos a 37 graus Celsius e observar os resultados após 24 a 48 horas de incubação. Se apenas a linha de punção for vermelha, caracterize a bactéria como não modal.Se a cor vermelha se espalhar para fora ao longo da linha de punção, caracterize a bactéria como modal. A motilidade bacteriana foi comparada para várias cepas em meios semi-sólidos tradicionais e TTC e resumida nesta tabela. Após cultivo por 24 horas em meio semissólido TTC, Staphylococcus aureus apresentou crescimento ao longo da linha inoculada.Considerando que, Escherichia coli apresentou crescimento em todas as direções ao redor da linha inoculada. A maior motilidade para Escherichia coli foi observada no meio TTC semi-sólido preparado com 0,3% de ágar no qual o meio ficou quase inteiramente vermelho. Em contraste, a área de difusão vermelha diminuiu em 0,5% de ágar e a difusão foi prolongada com o aumento da concentração de ágar para 0,8% É importante ajustar o pH para 7,2 e resfriar o meio autoclavado a 50 graus Celsius antes da inoculação usando as agulhas.As bactérias devem ser inoculadas por punção no meio semi-sólido contendo TTC. É um método direto para detectar a motilidade bacteriana. Também é possível detectar a motilidade indiretamente por microscópio eletrônico e

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