Name: Multiplex Imagem química baseada em banda larga estimulada raman dispersão microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a construir e operar um microscópio de espalhamento Raman estimulado de banda larga para imagem química não invasiva e sem marcação de células e tecidos.

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D. P. reconhece o financiamento do projeto CRIMSON da União Europeia sob o Acordo de Subvenção nº 101016923 e o projeto Regione Lombardia NEWMED sob o Acordo de Subvenção Nº. POR FESR 2014-2020. G. C. reconhece o financiamento do projeto da União Europeia GRAPHENE Core3 sob o número do acordo de subvenção 881603. G. C. também reconhece financiamento da Universidade King Abdullah de Ciência e Tecnologia, Número do Prêmio Grant: OSR-2016-CRG5-3017-01.

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G. C. declara envolvimento com a empresa, Cambridge Raman Imaging, que visa comercializar a tecnologia de microscopia SRS de banda larga. Os outros autores não declaram conflitos de interesse.

A microscopia de BANDA LARGA SRS é uma poderosa técnica de imagem que oferece contraste químico autêntico para identificar e desembaraçar os componentes químicos de uma amostra heterogênea. O potencial dessa ferramenta analítica pode ser benéfico para diversos campos de pesquisa, desde a ciência dos materiais até a histopatologia. A desvantagem da microscopia de BANDA LARGA SRS é o fato de que ela é tecnicamente exigente; o experimentalista não só requer know-how sobre fontes de laser de banda larga, mas também precisa manipular os pulsos de laser para gerar com eficiência o SRS, um sinal que, por sua vez, precisa ser medido com sofisticados esquemas de detecção. Este artigo apresenta um protocolo que descreve um fluxo de trabalho para produzir mapas químicos de compostos químicos mistos usando um microscópio SRS de banda larga multiplex. Embora o trabalho descrito possa ser trivial para alguns físicos a laser e microscopistas não lineares, pode não ser o caso dos leitores interessados nos benefícios da microscopia de SRS de banda larga cujo conhecimento científico reside fora desses domínios. Por isso, buscamos detalhar cada passo para orientar o grande público interessado na microscopia de SRS de banda larga.
O protocolo em questão começou mostrando como preparar uma amostra simples, mas espectroscopicamente rica, composta por vários dispersores raman fortes e conhecidos. Discutimos como obter a bomba de banda larga e os feixes de stokes de banda estreita necessários para configurar um microscópio SRS. A Figura 5C mostra um esquema das configurações SHG e OPO. Observe que a lente f1 concentra o feixe fundamental no LBO1 para gerar o SHG, enquanto um espelho dicroico reflete a radiação SHG e transmite o feixe fundamental residual. Uma segunda lente f2 collima o feixe SHG. Como f2 &gt; f1, o feixe SHG é expandido por um fator igual a f2/f1. Uma terceira lente f3 concentra o feixe SHG expandido em um segundo cristal LBO tipo I (LBO2) cortado a φ = 90° e φ = 29,0°. Ao bombear LBO2 com o supracitado SGH (520 nm), a radiação dentro da faixa de 680-910 nm emergirá de LBO2 até a geração de frequência de diferença (DFG), produzindo dois feixes: o sinal e o o ocler27 (Figura 5D,E). Este último é descartado enquanto o primeiro é amplificado na cavidade OPO para fornecer os pulsos da bomba empregados nos experimentos srs. A bomba do OPO a 520 nm, ou seja, o feixe SHG, não deve ser confundida com a bomba dos experimentos SRS (ou seja, o feixe de sinal do OPO).
O contraste na microscopia SRS origina-se de um sinal não linear gerado no ponto focal do microscópio, um sinal que exige confinar um grande número de fótons no plano amostral em um determinado momento. Este confinamento de fótons é alcançado com um objetivo de microscópio de alta abertura numérica (NA), uma matriz de lentes que também define a resolução espacial do sistema: quanto maior a NA, maior a resolução espacial. No entanto, os objetivos de NA elevados são densamente embalados com vidro, o que introduz GDD positivo à radiação pulsada, um chirp de frequência que, em última análise, amplia o perfil temporal dos pulsos39. Assim, o GDD introduzido pelo objetivo do microscópio pode aumentar a duração dos pulsos da bomba de banda larga, tornando-o ainda mais longo do que o envelope temporal de Stokes e reduzindo a largura de banda eficaz e acessível do sinal Raman. Além disso, essa ampliação também pode introduzir uma distorção do perfil espectral do espectro SRS medido.
Em CARS, o sinal espectroscopicamente relevante emerge em comprimentos de onda que diferem dos dos campos de excitação. Um simples tubo fotomultiplier ou câmera ccd (dispositivo acoplado por carga) pode ser usado para integrar o sinal CARS a tempo, somando milhares de pulsos para obter a média do ruído do laser. Em vez disso, o sinal SRS aparece como uma transferência de modulação fraca incorporada dentro de um fundo laser forte e flutuante. Como essa modulação é fraca, o ruído do laser pode facilmente sobrecarregá-lo, reduzindo tanto a velocidade de imagem quanto a sensibilidade do microscópio SRS. Portanto, antes da imagem, é imprescindível medir o ruído de intensidade relativa (RIN) para determinar se o laser é adequado para imagens de SRS de alta velocidade e selecionar a frequência de modulação com o menor ruído. O RIN é definido como a densidade espectral de potência sonora [δP(f), com unidades W2/Hz] do laser normalizado pela potência óptica média (<img alt="Diagrama de equilíbrio estático ΣFx=0; equilíbrio de forças na análise estrutural; ferramenta de física educacional." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2">)40,41. Em outras palavras, o RIN descreve as flutuações do laser normalizadas em diferentes frequências (Eq [4]).
<img alt="Ruído de intensidade relativa, equação: RIN=10log₁₀(δP(f)/P̅²) [dB/Hz], estabilidade do sinal óptico." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 7"> (4)
Assim, o RIN é um parâmetro do sistema SRS que determina a faixa de frequência de modulação ideal para os experimentos. Por exemplo, a barra de azeitona na Figura 8 mostra a faixa de frequência de modulação ideal para imagens SRS. No caso de SRS de banda estreita, o usuário deve medir o RIN tanto da bomba quanto do Stokes para escolher qual feixe precisa ser modulado para alcançar o desempenho ideal. Nota da Figura 8, por exemplo, que o feixe de Stokes tem um RIN ligeiramente maior do que a bomba, implicando que as medidas SRG ficariam mais ruivas do que suas contrapartes SRL. No caso da SRS de banda larga, o feixe que deve ser modulado é o feixe de banda estreita.
A dispersão angular D da grade expressa o ângulo de difração em função do comprimento de onda, e é definida como a derivada da equação de grade. Para a configuração Littrow, a dispersão angular é dada por Eq (5).
<img alt="Fórmula de difração D = dβ/dλ = 2/λ tanβ; análise de dispersão óptica, equação física." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq08.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 8"> (5)
Para obter Eq (5), assumimos α = β, resolvemos Eq (2) para m/d e inserimos o resultado em dβ/ dλ. Observe que na configuração Littrow, β = sin-1(mλ/2d). Dentro da aproximação de ângulo pequeno, a mudança de posição ao longo do espectro é fdβ ≈ dl (Figura 10). Assim, inserindo dβ em Eq (5), podemos calcular a dispersão linear, uma quantidade com unidades de nm mm-1 utilizando Eq (6):
<img alt="Equação diferencial para dispersão de comprimento de onda; fórmula da equação; óptica, conceitos de espectroscopia." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq09.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 9"> (6)
Para uma grade de difração operando na configuração Littrow com 1.851,85 ranhuras/mm, d = 540 nm. Se usarmos a difração de primeira ordem de luz a ~789 nm, D = 0,0027 rad nm-1. Com uma lente f = 750 mm, temos uma dispersão linear de ≈ 0,5 nm mm-1, traduzindo em ≈ 7,8 cm-1 mm-1. Assim, a distância focal da lente determina a "densidade" de nm por mm no plano detector: Quanto maior a distância focal, menor a distância por mm obtida, aumentando o espaço entre as linhas espectrais da bomba de banda larga. Por outro lado, com distâncias focais mais curtas, haverá mais nm por mm no plano detector, reduzindo o espaço ocupado pela bomba dispersa.
A detecção equilibrada melhora a qualidade da imagem e a sensibilidade das configurações ruivas. Por exemplo, de acordo com o espectro rin mostrado na Figura 8 e considerando o SRS típico com uma amplitude de 1 x 10-5, a relação sinal-ruído desequilibrada (SNR) é ≈60. Usando detecção equilibrada (ou seja, perto do ruído de tiro), é possível alcançar um SNR de ≈145. A Figura 11 mostra espectros e imagens compostas em condições equilibradas e desequilibrados. Naturalmente, os efeitos da detecção equilibrada impactam os resultados finais dos experimentos, ou seja, os mapas químicos. Apoiados por esses resultados, enfatizamos que a detecção equilibrada é uma técnica poderosa para combater os efeitos prejudiciais das flutuações do laser na qualidade da imagem. Vale ressaltar que a detecção equilibrada é mais adequada para lasers barulhentos, como osciladores de fibra. Microscópios SRS operando com fontes de luz óptica silenciosas (por exemplo, lasers de estado sólido), podem não exigir detecção equilibrada.
O protocolo também explica uma abordagem baseada na óptica não linear para encontrar a sobreposição espostetorial entre os pulsos desses feixes. Descrevemos as vantagens de usar o 1em vez da0ª ordem de difração de um AOM como o feixe de Stokes modulado. Além disso, os efeitos prejudiciais da dispersão sobre a eficiência de geração srs foram descritos com sugestões de maneiras de mitiga-los através de um compressor prisma. Além disso, o protocolo explica como alinhar os prismas e destaca três aspectos críticos a serem considerados para o melhor desempenho. Não apenas discutimos a relevância do RIN para microscopia SRS, mas também mostramos como medi-lo com um amplificador lock-in e, com o espectro RIN, definir a melhor frequência de modulação. Com um exemplo concreto, este artigo explica como a equação de grade ajuda na concepção da cadeia de detecção. Por fim, o protocolo ilustra, com dados reais da SRS, a estrutura do hipercubo SRS e como analisá-lo com uma linguagem de programação científica convencionalmente utilizada.
Este protocolo tem três pequenas limitações. Em primeiro lugar, o esquema de detecção empregado nesta contribuição consiste em um detector de bloqueio multicanal não conventídeo projetado e construído internamente por Sciortino et al.26 Como demonstrado anteriormente25, este detector pode ser substituído por um fotodiodo balanceado fora da prateleira. Embora essa modificação diz respeito apenas ao detector e deixe o protocolo praticamente inalterado, com um fotodiodo único, é preciso escanear cada componente espectral no detector em vez de medi-los todos de uma vez. Em segundo lugar, este protocolo emprega detecção equilibrada inline, que requer a inserção de vários elementos ópticos no caminho do feixe. Esses elementos ópticos aumentam a complexidade do sistema e levam a perdas de energia óptica e ampliação de pulso.
A detecção equilibrada inline também exige que as duas réplicas da bomba passem pela amostra, situação que pode não ser ideal para amostras sensíveis à luz, como células vivas, ou para as que as duas réplicas da bomba podem experimentar diferentes propriedades ópticas, cancelando assim a detecção equilibrada. Em terceiro lugar, o protocolo conta com um OPO construído em casa, um dispositivo que pode não estar prontamente disponível. No entanto, as alternativas aos espectros de banda larga entregues pelo OPO são o supercontinua de fibras ópticas não lineares ou cristais a granel. Este último só poderia ser empregado com lasers de baixa taxa de repetição (até 5 MHz). Assim, como em todo projeto experimental, o protocolo em questão tem algumas limitações. No entanto, são mínimos e não comprometem o sucesso dessa abordagem.
Embora uma amostra de referência seja descrita aqui, este protocolo pode desembaraçar com sucesso espécies químicas dentro de células e tecidos animais e vegetais, como celulose, espécies lipídicas ou proteínas, encontrando aplicações práticas em diferentes missões bioquímicas ou como uma ferramenta de diagnóstico na histopatologia. Da mesma forma, este protocolo pode ser uma ferramenta valiosa em ciências materiais. Por exemplo, seguindo este protocolo, pode-se interrogar a composição molecular e concentração das espécies poliméricas42. Além disso, essa metodologia é compatível com outras técnicas de microscopia não linear, como microscopia de banda larga baseada na sonda de bomba43 e heterodyne CARS44, processos de mistura de quatro ondas que, como acontece com o SRS, também requerem dois feixes de luz de excitação e medições de transferência de modulação. Finalmente, algumas das informações contidas neste artigo podem ser aplicadas a técnicas de imagem não lineares que não dependem de técnicas de transferência de modulação, mas requerem o alinhamento de dois ou mais raios laser pulsados, como as microscopias convencionais CARS45 e SFG46.
Em resumo, este protocolo descreve uma metodologia poderosa baseada na microscopia SRS de banda larga para extrair mapas químicos e seus espectros característicos de SRS de misturas quimicamente heterogêneas, fornecendo conjuntos de dados que permitem a análise quantitativa direta dos dados. A versatilidade e simplicidade do método também dão ao leitor interessado a possibilidade de adaptá-lo a diferentes técnicas não lineares.

A microscopia de Raman é uma poderosa técnica de imagem que fornece mapas químicos ricos medindo Raman espalhando1, um processo radiativo inelástico que se origina de moléculas vibrando em resposta à luz incidente 2,3. Cada pixel de um mapa de Raman contém um espectro que carrega informações diretas sobre a composição química e estrutura da amostra, resultando em imagens com contraste vibracional intrínseco. Até o momento, a microscopia de Raman é o ponto de vista de referência para estudos de microspectroscopia de vibrações moleculares, pois nenhuma outra técnica de imagem pode produzir imagens com alta especificidade química e alta resolução espacial4. Apesar de sua excelente especificidade química, a eficiência de geração da dispersão de Raman é baixa, exigindo tempos de moradia de pixels estendidos ou excitação de alta potência, levando, respectivamente, a baixas taxas de aquisição e incompatibilidade com amostras sensíveis.
Essa única deficiência da microscopia de Raman levou os pesquisadores a aplicar raman coerentes espalhando 5,6,7,8,9 como fonte de contraste para microscopia. Trata-se de um processo óptico não linear que aumenta a resposta vibracional por várias (até sete) ordens de magnitude, permitindo assim imagens químicas de alta velocidade 10,11,12,13. Em particular, as duas técnicas de dispersão raman mais empregadas são a dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS)14 e estimuladas a dispersão de Raman (SRS)15. Em contraste com os CARS, o SRS mostra uma dependência linear da concentração de moléculas ressonantes. É imune ao fundo não ressonante, um efeito não linear não relacionado a qualquer transição vibracional, mas distorcido às formas lorentzianas características do espectro de Raman das vibrações moleculares16,17. Assim, a microscopia SRS produz informações autênticas do Raman que permitem análise direta de imagem quantitativa.
SRS é um processo óptico de terceira ordem, não linear, que fornece informações diretas sobre as ligações químicas de uma amostra. Ela se origina da superposição espostetemporal de dois campos ópticos geralmente na região espectral quase infravermelha, ou seja, a bomba e os Stokes na frequência ωpu e ωS, respectivamente 10,11,18. Esta superposição gera uma batida na frequência bomba-Stokes desafinando Ω = ωpu-ω S. Quando Ω corresponde a uma vibração molecular ΩR, a molécula ressoa, causando uma transferência de energia coerente entre os campos de luz e a molécula. Como resultado, a molécula atinge um estado vibracionalmente animado. Esse processo pode ser monitorado medindo a aniquilação de fótons de bomba (um sinal conhecido como perda de Raman estimulada [SRL]) ou a amplificação concomitante dos fótons Stokes (um processo conhecido como ganho de Raman estimulado [SRG]). SRG e SRL são pequenos sinais (ΔI) que se sentam em cima de um fundo intenso e flutuante (I). Como os valores típicos do sinal SRS (ΔI/I) estão na faixa 10-6-10-4, o ruído laser pode facilmente obscurecê-lo. Para mitigar os efeitos prejudiciais do ruído laser na relação sinal-ruído (SNR) e, consequentemente, na velocidade de imagem, a detecção de SRS conta com técnicas de transferência de modulação (por exemplo, amplificadores de lock-in, circuitos ressonantes ou mediadores de box-car) em altas frequências de modulação (>1 MHz), onde o ruído laser atinge seus valores mínimos 15,19,20.
A microscopia srs convencional emprega a bomba narrowband (≈10 cm−1) e os pulsos de Stokes para produzir imagens químicas em uma única frequência vibracional, permitindo imagens de taxa de vídeo com tempos de pixel tão baixos quanto ≈100 ns21,22. No entanto, como a microscopia SRS da banda estreita forma mapas químicos escaneando sequencialmente a amostra em apenas algumas frequências vibracionais, suas informações são limitadasa 23. Imagens srs com um ou dois contrastes vibracionais podem não ser suficientes para diferenciar espécies químicas com bandas Raman sobrepostas, especialmente dentro de sistemas heterogêneos. Portanto, o microscópio SRS de banda estreita paradigmática não explora todo o potencial do SRS, pois investigar um punhado de frequências vibracionais dificulta sua especificidade química e negligencia a riqueza de informações codificadas dentro de espectro vibracional. Além disso, a varredura sequencial da amostra em diferentes frequências resulta em tempos prolongados de habitação de pixels que podem desencadear fotodamagem e evitar um rigoroso coregissto espacial entre imagens consecutivas, levando a artefatos de movimento.
Ao contrário de sua contraparte de banda estreita, a microscopia SRS de banda larga recupera um espectro vibracional por pixel em cada amostra de varredura 10,12,24. Assim, a rede larga SRS fornece imagens hiperespectrais com estrita coregistração espacial de diferentes contrastes vibracionais, permitindo uma análise rigorosa dos dados. Isso não só revela os componentes químicos do espécime através do espectro de Raman, mas também ajuda a determinar suas concentrações relativas. Dependendo de como os espectros são adquiridos, a microscopia SRS de banda larga é classificada como SRS hiperespectral ou SRS multiplex. No SRS hiperespectral, o espectro SRS por ponto digitalizado da amostra é adquirido sequencialmente (ou seja, é recuperado varrendo a frequência de detuning Ω), construindo um espectro SRS empilhando os sinais SRS em turnos raman consecutivos. O espectro Raman é medido simultaneamente em vários modos vibracionais em SRS multiplex. Assim, a abordagem multiplex SRS combina um pulso de banda estreita modulada com um pulso de banda larga para conduzir o sinal SRS em diferentes frequências, e usa um detector multicanal com uma sensibilidade comparável à do SRS de banda estreita para detectar o espectro SRS.
Este artigo apresenta um protocolo para produzir mapas químicos de amostras heterogêneas usando microscopia multiplex SRS. Um esquema do microscópio SRS empregado neste protocolo é descrito na Figura 1 e descrito em detalhes em outros lugares 25,26,27. Resumidamente, um laser comercial de fibra Yb bloqueado pelo modo, produzindo pulsos de 140 fs centrados em 1040 nm, com potência média de 10 W e uma taxa de repetição de 80 MHz, impulsiona o microscópio SRS de banda larga. Um divisor de feixe polarizador (PBS) separa o feixe fundamental em dois ramos. Para produzir os pulsos de Stokes de banda estreita, um ramo com 4 W do feixe fundamental é enviado para um étalon que gera um feixe de banda estreita (≈15 cm-1), que é então modulado a 1,6 MHz com um modulador óptico acústico (AOM). A fração restante com 6 W do feixe fundamental é dobrada de frequência com um cristal de 2,8 mm de espessura de lítio triborate (LBO), cortado para correspondência de fase tipo I (φ = 90°, φ = 13,8°). A segunda geração harmônica resultante a 520 nm viaja para uma cavidade dobrada x para bombear um oscilador paramétrico óptico (OPO), um dispositivo que usa um cristal LBO de 3,0 mm de espessura (correspondência de fase tipo I, φ = 90°, φ = 9,8°) como meio ativo para fornecer uma radiação óptica de banda larga incapaz dentro da região espectral de 680-910 nm (Figura 2). Esses pulsos de banda larga servem como bomba nos experimentos srs e se propagam a um compressor prisma para précompensar os efeitos de dispersão induzidos pelo objetivo do microscópio.
Após o estágio de compressão, uma placa de onda λ/2, combinada com uma placa de birefringent YVO4 , produz duas réplicas ortogonalmente polarizadas cuja subtração eletrônica no plano de detecção cancela o ruído da bomba de banda larga. Um espelho dicroico combina a bomba e os feixes de Stokes e os envia para um microscópio vertical. Um objetivo de imersão em água com uma abertura numérica (NA) de 1,27 concentra a luz na amostra, enquanto um objetivo de imersão em óleo com um NA de 1,4 a coleta. Antes do estágio de detecção, um filtro de passagem curta (SPF) remove os Stokes modulados, enquanto uma grade de difração operando na configuração Littrow dispersa a bomba de banda larga transmitida. Um segundo PBS2 separa as réplicas da bomba, e uma lente as concentra em duas matrizes de fotodiodo. Os sinais dessas matrizes de fotodiodo são subtraídos eletronicamente e enviados para um amplificador multicanal-lock-in (M-LIA). O sinal desmodulado é então normalizado pelas leituras de corrente direta (DC) de uma das matrizes de fotodiodos, produzindo assim o espectro SRL.
Como um experimento exemplar, nós imagem misturas de vários dispersores raman bem conhecidos, cada um com um espectro raman único. Assim, o protocolo começa descrevendo como preparar as amostras de referência. À medida que detectamos o SRL, continuamos a explicar como obter pulsos de banda estreita Stokes e configurar a fonte óptica que fornece os pulsos da bomba de banda larga (≈ 250 cm-1), ou seja, o OPO construído em casa. O protocolo mostra o alinhamento e otimização dos feixes ópticos, descrevendo parâmetros críticos como a potência e os espectros da banda estreita Stokes e da bomba de banda larga. O protocolo descreve em detalhes o caminho óptico da bomba de banda larga porque requer elementos ópticos especiais. Também explica como encontrar a sobreposição espaçoetotemporal entre os pulsos de bomba-Stokes e mostra uma maneira prática de determinar o ruído de intensidade relativa (RIN), que por sua vez ajuda a definir a melhor frequência de modulação para experimentos de SRS. Em seguida, explicamos o princípio de trabalho e calibração da cadeia de detecção. Finalmente, o protocolo mostra o processo de aquisição de dados, quimiometria e pipeline de processamento de imagens.

<table><tbody><tr><td>Objetivo de coleta</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo Lambda S 60x Óleo, NA=1.4,</td><td>Nikon Objetivo de imersão em óleo</td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Thermo Fisher</td><td>043211-KJ</td><td>Quartzo, lamínula para lâmina de microscópio, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm</td></tr><tr><td>Linha de atraso</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>M-406.6PD</td><td>Estágio de microtradução de precisão, faixa de deslocamento de 150 mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>D8418-500ML</td><td>Metilsulfinilmetano, Grau de Biologia Molecular DMSO, DMSO, Metilsulfóxido</td></tr><tr><td>Etalon</td><td>SLS Optics Ltd</td> Revestimento antirreflexo <td>feito sob medida</td><td>a 1.040 nm, montado em uma célula de aço inoxidável de 38 mm de diâmetro x 35,5 mm de comprimento com tampas protetoras contra poeira e um diâmetro de 50 mm ' apertar' anel de montagem</td></tr><tr><td>Objetivo de excitação</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon</td><td>Objetivo de imersão em água</td></tr><tr><td>Grade de</td><td>Grade LightSmyth</td><td>T-1850-800s Series</td><td>Alta Eficiência Grade de Transmissão Série T-1850-800s</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Coerente</td><td>Custom made</td><td>Fidelity, HP</td></tr><tr><td>&lambda;/2</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td>Montado superacromático placa de meia onda</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thorlabs</td><td>CM5-PBS203/M</td><td>16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,</td></tr> <tr><td>contas de PMMA</td><td>Merck</td><td>MFCD00198073</td><td>Micropartículas à base de prismas de polimetacrilato</td></tr><tr><td></td><td>Crisel</td><td>320-8218</td><td>PRISMAS DE DISPERSÃO A LASER em contas SF11</td></tr><tr><td>PS</td><td>Merck</td><td>72986-10ML-F</td><td>Micropartículas à base de poliestireno</td></tr><tr><td>Cristal YVO4</td><td>Dr. Sztatecsny GmbH</td><td>Feito sob medida</td><td>&nbsp; espessura 8 mm, diâmetro 1,00 cm, 1 689,00 689,00 adequado para montagem de 1", revestido para 850 - 1.100 nm</td></tr></tbody></table>

multiplex imagem química baseada em banda larga estimulada raman dispersão microscopia

Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica óptica não linear para imagens químicas sem rótulo. Esta ferramenta analítica fornece mapas químicos em alta velocidade, e alta resolução espacial de amostras finas, interrogando diretamente suas vibrações moleculares. Em sua implementação padrão, a microscopia SRS é banda estreita e forma imagens com apenas uma única frequência vibracional de cada vez. No entanto, essa abordagem não só dificulta a especificidade química do SRS, mas também negligencia a riqueza de informações codificadas dentro de espectros vibracionais. 
Essas limitações podem ser superadas pela SRS banda larga, uma implementação capaz de extrair um espectro vibracional por pixel da imagem em paralelo. Isso fornece dados hiperespectrais que, quando associados à análise quimiotmétrica, maximizam a quantidade de informações recuperadas da amostra. Assim, a BANDA LARGA SRS melhora a especificidade química do sistema, permitindo a determinação quantitativa da concentração dos diferentes constituintes de uma amostra. Aqui, relatamos um protocolo para imagens químicas com microscopia SRS de banda larga, baseado em um microscópio SRS construído em casa operando com uma detecção personalizada de amplificador multicanal-lock-in diferencial. Discute a preparação da amostra, o alinhamento do aparelho SRS e a análise quimiotítrica. Ao adquirir espectros vibracionais de Raman, o protocolo ilustra como identificar diferentes espécies químicas dentro de uma mistura, determinando suas concentrações relativas.

A Figura 3 mostra resultados exemplares obtidos utilizando este protocolo com PS, PMMA e azeite de oliva. Esta rotação de LBO1 mudará o índice de refração experimentado pelo campo SHG, modificando diretamente sua velocidade de fase. Quando a velocidade de fase do campo SHG corresponde à da polarização não linear induzida no LBO1, o campo não gerado e a polarização não linear estarão em fase, levando à intensa radiação SHG. Em outras palavras, ajustar o ângulo φ do LBO1 permitirá que o usuário atinja a condição ideal de correspondência de fase para SHG. Como um cristal de correspondência de fase tipo I é usado aqui, a polarização do feixe SHG será ortogonal à do feixe fundamental (Figura 5B).
A Figura 8 mostra o RIN das fontes ópticas usadas neste protocolo e o limite de ruído de tiro, que é uma consequência da natureza quântica de elétrons e fótons que estabelece um limite fundamental para o ruído laser. O RIN limitado de ruído de tiro é computado com <img alt="Decibéis por hertz (dB/Hz) mostrados em uma fração, conceito matemático para analisar a intensidade do sinal." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> o mostrado por Eq (3).
<img alt="Equação de ruído de disparo, RIN_shot = 10log10(2hv/P̅), fórmula para análise de ruído óptico." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> (3)
Onde h é constante de Planck, e não é a frequência óptica. Assim, o ruído de tiro fornece diretrizes úteis para o design eletrônico.
As figuras 11A e Figura 11C mostram dados exemplares de espectros equilibrados e desequilibrados. Naturalmente, os efeitos da detecção equilibrada impactam os resultados finais dos experimentos, ou seja, os mapas químicos. As figuras 11B e Figura 11D mostram imagens compostas nas condições desequilibrada e equilibrada, respectivamente. A implementação com sucesso do protocolo descrito ajudará a identificar e localizar os diferentes componentes químicos de uma amostra heterogênea e extrair seus espectros característicos de SRS. Submeter os dados hiperespectrais da Figura 12 à análise quimiotítrica dá a Figura 13. A Figura 13A mostra um composto dos mapas de concentração dos diferentes componentes químicos da amostra, enquanto a Figura 13B mostra seus espectros característicos de SRS. Observe que os dados mostrados na Figura 13A não só permitem que o usuário identifique facilmente os diferentes constituintes da amostra, mas também realize uma análise mais quantitativa. Por exemplo, usando os mapas de concentração, pudemos calcular a média da concentração fracionária de cada espécie química: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS e 22% azeite de oliva.
<img alt="Diagrama de configuração da espectroscopia a laser; oscilador paramétrico óptico, SHG, absorção transitória." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema do microscópio DE BANDA LARGA SRS empregado neste protocolo. Abreviaturas: PBSx = feixe polarizador; SHG = segundo módulo de geração harmônica; OPO = oscilador paramétrico óptico; AOM = modulador óptico acousto; FPS = filtro de passagem curta; M-LIA: Amplificador de travamento multicanal; DM = espelho dicrómico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama do espectro da cromatografia; bomba sintonizável e linhas Stokes; análise de comprimento de onda." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Espectros da bomba de banda larga tunable (azul) e dos feixes de Stokes de banda estreita (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Imagem microscópica da dispersão do polímero em gotículas; PS, PMMA, DMSO, óleo rotulado; análise de dispersão." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Imagem brightfield da amostra quimicamente heterogênea. Note que a microscopia convencional não permite que os diferentes constituintes sejam distinguidos. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: PS = poliestireno; PMMA = metacrilato de polimetila; DMSO = sulfoxida de dimetil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Transmitância vs. gráfico de tempo com configuração de espectroscopia AOM, indicando modulação de pulso óptico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Modulação da banda estreita Stokes pulsa. (A) O traço azul transparente mostra o feixe 0difrracado , enquanto o preto mostra a1ª ordem correspondente. (B) Configuração óptica para otimizar a eficiência de modulação do feixe difrroso de1ª ordem e ajuste fino do tamanho do feixe de Stokes antes de chegar ao objetivo de excitação. Abreviaturas: AOM = modulador óptico acousto; fx = distância focal da lente X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagramas SHG e DFG; configuração óptica com cristais LBO para conversão de frequência e geração de sinal." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Processos ópticos não lineares necessários para conduzir a Geometria OPO. (A) da interação SHG. Dois fótons fundamentais em ω1 levam o sistema material a um nível virtual de alta energia, de onde o sistema de material salta para o estado terrestre, emitindo um fóton a ωSHG. (B) Esquema do experimento SHG. (C) Um esquema das configurações SHG e OPO. (D) Geometria da interação DFG. Um fótonSHG ω é dividido em fótons de sinal (sinal ω) e fótons odler (ωIdler). Um ganho do feixe de sinal é obtido alimentando os fótons de sinal e fazendo-os ressoar na cavidade. (E) Esquema do experimento DFG. Abreviaturas: SMx = espelho esférico (R = 75 mm); OPO = oscilador paramétrico óptico; SHG = segundo módulo de geração harmônica; DFG = geração de frequência de diferença; LBO = triborate de lítio; OC = condensador de óleo; DM = espelho dicrómico; fx = distância focal da lente X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="diagrama de dispersão de prisma com ângulos, dois prismas, reflexão de espelho, análise de caminho óptico" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Geometria do compressor prisma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Configuração óptica para geração de soma-frequência (SFG); gráfico mostrando a amplitude do SFG vs. a posição da linha de atraso." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7: Geração de frequência de soma para otimizar a sobreposição espostetemporal. (A) SFG entre a bomba e Stokes e seus respectivos SHG impinging em uma tela. Aqui, uma lente concentrou a bomba e os feixes stokes no cristal, enquanto um filtro de baixa passagem os removeu. (B) Intensidade do SFG entre a bomba e Stokes em função do atraso de tempo. Defina o tempo zero da configuração SRS na posição que maximiza o SFG. A assimetria da correlação cruzada em B é devido ao perfil temporal causado pelo etalon no feixe de Stokes. Abreviaturas: SFG = geração de frequência de soma; SHG = segundo módulo de geração harmônica; SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de análise de ruído Stokes-Pump; RIN vs. frequência; largura de banda SRS ideal destacada; estudo espectroscópico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figura 8: Espectro rin. A banda destacada em verde mostra a melhor região espectral para os experimentos srs. Modular o feixe de Stokes em qualquer frequência dentro desta banda garante que os efeitos do ruído laser no sinal SRS serão os mais baixos possíveis. Abreviaturas: RIN = ruído de intensidade relativa; SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Configuração coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) mostrando bomba, Stokes e sinais combinados." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Figura 9: Perfis de feixe. (A) Bomba, (B) Stokes, e (C) bomba e Stokes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de grade de difração, alinhamento linear do detector, β angular, distância focal f, medição óptica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig10.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 10"> Figura 10: Geometria presumida para uma grade de dispersão e um detector de matriz de fotodiodo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig10large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Comparação de espectroscopia, análise de espectros SRS e imagens de microscopia, configuração balanceada versus desbalanceada." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig11.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 11"> Figura 11. Os efeitos da detecção equilibrada. Efeitos em espectros (A, C) e imagens químicas (B, D). Os compósitos mostrados nos painéis (B) e (D) são os resultados finais dos experimentos (ou seja, após a análise quimiotmétrica dos dados hiperespectrais. Consulte a seção de protocolo 4 para obter detalhes). Barras de escala = 10 μm. Abreviação: SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de imagem espectral 3D com análise de número de onda, mostrando picos de absorção em microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig12.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 12"> Figura 12: Um hipercubo SRS representativo adquirido com microscopia SRS de banda larga. O avião x-y armazena as coordenadas das posições digitalizadas, enquanto cada vetor ao longo de z registra um espectro SRS. Abreviação: SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Imagem microscópica de nanopartículas e gráfico de espectroscopia; análise de dados espectrais com picos de comprimento de onda." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig13.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 13"> Figura 13: Análise quimiotmétrica dos dados hiperespectrais de SRS. (A) Composto dos mapas de concentração dos diferentes constituintes da amostra. (B) Espectros característicos da espécie química. Em ambos os painéis, amarelo: azeite de oliva, azul: DMSO, ciano: PS e laranja: PMMA. Barra de escala = 20 μm (A). Abreviaturas: SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada; PS = poliestireno; PMMA = metacrilato de polimetila. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig13large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um protocolo para adquirir imagens químicas com microscopia de dispersão Raman estimulada por banda larga (SRS). Baseado em um microscópio SRS que opera com detecção diferencial de bloqueio multicanal, o protocolo descreve a preparação da amostra, o ajuste do aparelho SRS e a quimiometria para desembaraçar diferentes constituintes de amostras quimicamente heterogêneas.

Multiplex Imagem química baseada em banda larga estimulada raman dispersão microscopia

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a nonlinear optical technique for label-free chemical imaging. This analytical tool delivers chemical maps ...

Nosso protocolo descreve como construir uma estimulada Microscopia de Dispersão raman, que permite a medição do espectro vibracional das moléculas dentro de microssegundos. E quando aplicado à imagem, pode fornecer microscopia hiperespectral para localizar e quantificar os componentes químicos da matéria de forma livre de rótulos e não invasivas. Existem várias aplicações desse protocolo, principalmente nas ciências biológicas e biomédicas.Por exemplo, para células de imagem, ou tecidos. Há dois desafios importantes para nossa abordagem, a fonte óptica de banda larga e a cadeia de detecção. Para abordar o primeiro, pode-se comprar um OPR ou construir um você mesmo.Alternativamente, pode-se usar o supercontinuo de luz branca gerado em cristais a granel ou em fibras ópticas não lineares. Este último desafio pode ser resolvido escaneando seqüentemente cada componente espectral com um fotodiodo comercial e um scanner galvo Para começar, extrair dois microlitros de uma suspensão aquosa de metacrilato de polimetila, ou microesferas PMMA, e despeje a suspensão em um deslizamento de tampa de microscópio. Em seguida, extraia dois microlitadores de uma suspensão aquosa de microesferas de poliestireno e combine-o com a suspensão pmma no deslizamento de tampa.Misture delicadamente a suspensão com uma ponta de pipeta e deixe secar por 24 horas. Uma camada branca de contas aparecerá em cima do deslizamento da tampa quando a água se desligar. Adicione 20 microliters de sulfóxido de dimetila e 20 microliters de azeite puro em cima do deslizamento de cobertura.E aplique esmalte nas bordas do segundo deslizamento de tampa do microscópio. Coloque o deslizamento da tampa sobre a mistura, com o esmalte voltado para baixo, e aplique pressão suficiente para selá-la. Deixe secar.Para otimizar a eficiência de modulação do feixe stokes de banda estreita. Altere a distância entre as lentes F1 e F2, e meça o feixe modulado com um fotodiodo. Então, regissou seu perfil com um osciloscópio.Ajuste o comprimento da cavidade do oscilador óptico paramétrico de tal forma que o espectro de bomba de banda larga resultante, juntamente com o Stokes de banda estreita a 1040 nanômetros, pode produzir uma desafinação de frequência dentro de 2.800 a 3.100 centímetros inversos. Esta faixa espectral cobre as vibrações da região de alongamento do CH. Envie a bomba de banda larga para um compressor prisma para compensar os efeitos de dispersão incluídos pelo objetivo do microscópio de excitação.Digite a bomba em prisma A, através de seu ápice, e guie a bomba dispersa em direção ao ápice do prisma B.Defina a quantidade de dispersão negativa necessária e ajuste a distância entre os prismas em conformidade. Use prismas cortados brewster, e certifique-se de que a polarização do feixe da bomba está dentro dos planos triangulares dos prismas. Para otimizar o esquema de detecção em linha balanceada, defina o eixo rápido desta vertical de cristal de birefringent e guie a bomba polarizada para uma placa YV04 com um comprimento de 13,3 milímetros.Em seguida, use uma placa de meia onda para definir a polarização do feixe da bomba para 45 graus. Combine a bomba e os feixes de Stokes com um espelhodicróico e alinhe-os cuidadosamente com um par de pinros fluorescentes. Certifique-se de que ambos os feixes estão se propagando co-linearmente.Atenuar as vigas e guiá-las para um fotodiodo rápido para sobrepor temporariamente. Depois disso, remova o fotodiodo. Em seguida, meça os perfis do feixe com uma câmera calibrada e use uma placa infravermelha para estimar os diâmetros por olho.Use dois telescópios. Um para a bomba e outro para o feixe de Stokes, e tente combinar os diâmetros do feixe com a abertura traseira do objetivo de excitação. Uma vez que a dispersão de Raman estimulada, ou sinal SRS, é obtida, use o telescópio no feixe da bomba para ajustar seu diâmetro, variando sua faixa de Rayleigh e, consequentemente, o volume de interação no foco do microscópio.Pare quando o SRS máximo for alcançado. Use um fotodiodo para medir a intensidade do feixe da bomba, e com a responsabilidade do fotodiodo, calcule a potência média que afeta a área ativa do detector. Para medir o ruído de intensidade relativa do laser, desconecte o filtro de baixa passagem e conecte a saída de um fotodiodo de alta largura de banda à entrada de um amplificador de travamento.Armazene a saída de lock-in em volts sobre a raiz quadrada de Hertz em diferentes frequências de desmodulação e use a responsabilidade de diodos fotográficos para converter volts em Watts. Guie a bomba e os feixes de Stokes até o microscópio. Coloque a amostra e encontre uma região sem contas para ajudar a alinhar o feixe da bomba.Em seguida, faça confocal os objetivos de excitação e coleta. Coloque um filtro de curto-tempo para remover os Stokes modulados e guie o feixe da bomba até a classificação. Coloque uma lente após a classificação para concentrar o feixe disperso nos detectores.Para detecção equilibrada, meça o espectro da referência e as réplicas de sinal que se propagam ao longo do feixe da bomba. Coloque uma pequena fenda, ou uma íris, entre a classificação e um divisor de feixe polarizador, para garantir a correspondência espectral entre as duas matrizes de fotodiodo e filtrar a bomba dispersa espacialmente. Clipe todos, exceto um componente espectral das réplicas da bomba para centralizar os raios transmitidos no detector Nth das matrizes de referência e fotodiodo de sinal.Use os espelhos de direção para ajustar a correlação dos diferentes canais de detecção. Para iniciar a microscopia SRS:modular os Stokes, escaneie a amostra e adquira a transferência de modulação no espectro da bomba com seu espectro DC correspondente para obter o espectro SRS normalizado de cada pixel. Produzir matrizes tridimensionais, cujas linhas e colunas contêm as posições digitalizadas da amostra.Em cada ortogonal vetorial para o plano XY, armazene um espectro SRS. Traçar a concentração e os perfis espectrais para adquirir as imagens químicas e os espectros característicos dos componentes químicos da amostra. A imagem representativa mostra o espectro de ruído de intensidade relativa das fontes ópticas utilizadas neste protocolo.Mostrada aqui é a melhor região espectral para os experimentos srs. Modular o feixe de Stokes em qualquer frequência dentro desta banda garante que os efeitos do ruído laser no sinal SRS serão os mais baixos possíveis. Um dado exemplar dos espectros desequilibrados e equilibrados são mostrados aqui.Os efeitos da detecção equilibrada impactam os resultados finais dos experimentos. Ou seja, os mapas químicos. As imagens compostas nas condições desequilibradas e equilibradas são mostradas aqui.As imagens representativas mostram uma análise quimiotítrica dos dados hiperespectrais da SRS. Um composto dos mapas de concentração dos diferentes componentes químicos da amostra e seus espectros característicos de SRS são mostrados aqui. A partir desses dados, os diferentes constituintes da amostra, por exemplo, azeite de oliva, poliestireno DMSO e metacrilato de polimetilo podem ser facilmente identificados.Atualmente, nossa técnica só pode sondar o alongamento de vibração CH. No entanto, ao otimizar a fonte óptica, a mesma cadeia de detecção nos permitirá explorar a região de impressão digital mais informativa detectando vários modos ao mesmo tempo. Nossa cadeia de detecção abre caminho para a integração da SRS banda larga nas clínicas, introduzindo uma tecnologia que complementará e melhorará o fluxo de trabalho tradicional da histopatologia para o diagnóstico tecidual.

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Research

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Engineering

Engenharia

Fonte: Espinoza, R., et al. Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores em tempo real do cérebro de camundongos para diagnóstico de tecidos. J. Vis. Exp. (2022).  O vídeo demonstra imagens de espalhamento Raman estimulado (SRS) de duas cores de seções de tecido cerebral de camundongos. Dois feixes de laser sincronizados são direcionados para a seção de tecido para excitar vibrações moleculares, resultando em uma mudança de intensidade relativa nos feixes. Lipídios e proteínas no...

Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores do tecido cerebral de camundongos

Neste manuscrito, é descrita a implementação de um microscópio de espalhamento Raman (SRS) estimulado, obtido pela integração de um conjunto experimental de SRS com um microscópio de varredura a laser. O microscópio de SRS é baseado em duas fontes do laser do femtossegundo (FS), em um ti-safira (ti: SA) e em oscilador paramétrico ótico sincronizado (OPO).

Implementação de um microscópio não-linear baseado em espalhamento Raman estimulado

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

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A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

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A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

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