Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

Este protocolo torna possível rotular proteínas de uma maneira específica do tipo celular. Esta é a primeira técnica que oferece tal possibilidade e pode ser feita in vitro ou in vivo. A principal vantagem da técnica é que as proteínas específicas do tipo celular marcadas podem ser purificadas não identificadas ou visualizadas in situ por imunofluorescência.

Para começar a preparar o lisado de tecido, adicionando tampão de lise a um volume de 12 a 15 vezes o peso úmido do tecido e triturar o tecido até que ele seja homogeneizado. Aqueça este homogeneizado por 15 minutos a 75 graus Celsius para desnaturar a proteína, em seguida, centrifugar a amostra e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Esta amostra pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius.

Em seguida, para alquilação, diluir a amostra homogeneizada duas a três vezes em tampão salino fosfato contendo um inibidor de protease livre de EDTA. Em seguida, adicione a iodoacetamida recém-preparada a uma concentração final de 20 milimoles. Deixe a amostra por uma a duas horas a 20 graus Celsius no escuro.

Repita as etapas de adição e incubação de iodoacetamida duas vezes. Prepare a coluna de acordo com as instruções do fabricante, primeiro vórtice as colunas. Em seguida, retire a tampa cortando a parte inferior e centrifugando-a.

Em seguida, execute uma troca de buffer primeiro equilibrando as colunas de troca de buffer usando o buffer de troca química de clique e, em seguida, trocando todas as amostras alquiladas. Para avaliar a incorporação de azidonorleucina pegue 40 microlitros da amostra aludida e adicione tampão salino fosfato a um volume final de 120 microlitros. Em seguida, configure a reação química do clique vortexing a reação por 20 segundos.

Depois de adicionar cada reagente na ordem indicada o mais rápido possível, incubar as amostras no escuro a quatro graus Celsius durante a noite com rotação contínua. No dia seguinte, centrifugar as amostras por cinco minutos a 17.000 vezes G após a centrifugação, um pellet ligeiramente turquesa será visível. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e armazene a amostra a menos 80 graus Celsius.

Para purificação de proteína marcada. Submeter todas as amostras a um procedimento de troca de tampão, conforme demonstrado para limpar as sobras de alquino livre usando o tampão de ligação de neutravidina como tampão de equilíbrio. Em seguida, lave as contas de alta capacidade de neutravitina três vezes, misturando as contas com o tampão de ligação.

Centrifugar a mistura, descartar o sobrenadante e repeti-lo três vezes. Em seguida, prepare uma pasta um-para-um, adicionando o mesmo volume de contas secas de neutravidina e tampão de ligação de neutravidina. Reserve 20 a 40 microlitros de cada amostra como lisado pré-purificado e armazene-o a menos 20 graus Celsius.

Após a medição da concentração de proteína da amostra, misture um miligrama de proteína com 40 microlitros da pasta de miçangas. Incubar a mistura durante a noite a quatro graus Celsius com rotação contínua, permitindo que as proteínas marcadas se liguem às contas. No dia seguinte, recolher o sobrenadante por centrifugação.

Separe uma alíquota de 20 a 40 microlitros do sobrenadante para análise posterior e congele o restante a menos 80 graus Celsius. Em seguida, lave as contas três vezes adicionando um tampão de lavagem de neutravidina refrigerado. Sedimentar as contas e descartar o sobrenadante.

Em seguida, adicione o mesmo tampão e incube as contas por 10 minutos sob rotação contínua a quatro graus Celsius antes de descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem com tampões de lavagem de neutravidina dois e três e eluir as proteínas clicadas incubando as contas por 30 minutos a 20 graus Celsius com um volume de tampão de eluição de neutravidina, correspondente a um volume das contas secas utilizadas. Durante a eluição, mantenha as contas em suspensão a 1000 rotações por minuto em um agitador de bloco térmico iludir duas vezes e combinar ambas as eluidas.

As reações de cliques foram analisadas por SDS page e Western immuno blot. Imagens representativas dos experimentos são mostradas para a administração de azidonorleucina por injeção intraperitoneal e para a administração de azidonorleucina via água potável. Um outro experimento fornece um exemplo para a determinação da concentração ideal de alcina clivável de biotina dissulfureto.

Neste exemplo, a mudança de dobra entre a amostra rotulada e o controle é maior na concentração de alquino micromolar 14. Um exemplo de um resultado de espectrometria de massa com um claro enriquecimento na amostra marcada com azidonorleucina em comparação com o controle é mostrado aqui. Essa diferença já era visível na coloração proteica total.

Além das mudanças na intensidade do peptídeo, há também proteínas únicas encontradas em ambas as amostras. Este é um protocolo tecnicamente complexo e é um passo que deve ser cuidadosamente seguido usando alquilação de controles negativos adequados, limpeza adequada (indistinta) e adequada do arquivo não clicado. Nossos principais passos neste protocolo, as proteínas purificadas podem ser identificadas por espectrometria de massa se o interesse dos pesquisadores é estudar proteínas ou carregá-las em um gel para estudar proteínas de interesse por western blot.

A capacidade deste método de marcar proteínas de uma origem celular específica tem muitas aplicações, como a tensão de proteínas ou o estudo da síntese proteica in vitro ou in vivo.