Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase
April 13th, 2022
Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.
Este protocolo torna possível rotular proteínas de uma maneira específica do tipo celular. Esta é a primeira técnica que oferece tal possibilidade e pode ser feita in vitro ou in vivo. A principal vantagem da técnica é que as proteínas específicas do tipo celular marcadas podem ser purificadas não identificadas ou visualizadas in situ por imunofluorescência.
Para começar a preparar o lisado de tecido, adicionando tampão de lise a um volume de 12 a 15 vezes o peso úmido do tecido e triturar o tecido até que ele seja homogeneizado. Aqueça este homogeneizado por 15 minutos a 75 graus Celsius para desnaturar a proteína, em seguida, centrifugar a amostra e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Esta amostra pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius.
Em seguida, para alquilação, diluir a amostra homogeneizada duas a três vezes em tampão salino fosfato contendo um inibidor de protease livre de EDTA. Em seguida, adicione a iodoacetamida recém-preparada a uma concentração final de 20 milimoles. Deixe a amostra por uma a duas horas a 20 graus Celsius no escuro.
Repita as etapas de adição e incubação de iodoacetamida duas vezes. Prepare a coluna de acordo com as instruções do fabricante, primeiro vórtice as colunas. Em seguida, retire a tampa cortando a parte inferior e centrifugando-a.
Em seguida, execute uma troca de buffer primeiro equilibrando as colunas de troca de buffer usando o buffer de troca química de clique e, em seguida, trocando todas as amostras alquiladas. Para avaliar a incorporação de azidonorleucina pegue 40 microlitros da amostra aludida e adicione tampão salino fosfato a um volume final de 120 microlitros. Em seguida, configure a reação química do clique vortexing a reação por 20 segundos.
Depois de adicionar cada reagente na ordem indicada o mais rápido possível, incubar as amostras no escuro a quatro graus Celsius durante a noite com rotação contínua. No dia seguinte, centrifugar as amostras por cinco minutos a 17.000 vezes G após a centrifugação, um pellet ligeiramente turquesa será visível. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e armazene a amostra a menos 80 graus Celsius.
Para purificação de proteína marcada. Submeter todas as amostras a um procedimento de troca de tampão, conforme demonstrado para limpar as sobras de alquino livre usando o tampão de ligação de neutravidina como tampão de equilíbrio. Em seguida, lave as contas de alta capacidade de neutravitina três vezes, misturando as contas com o tampão de ligação.
Centrifugar a mistura, descartar o sobrenadante e repeti-lo três vezes. Em seguida, prepare uma pasta um-para-um, adicionando o mesmo volume de contas secas de neutravidina e tampão de ligação de neutravidina. Reserve 20 a 40 microlitros de cada amostra como lisado pré-purificado e armazene-o a menos 20 graus Celsius.
Após a medição da concentração de proteína da amostra, misture um miligrama de proteína com 40 microlitros da pasta de miçangas. Incubar a mistura durante a noite a quatro graus Celsius com rotação contínua, permitindo que as proteínas marcadas se liguem às contas. No dia seguinte, recolher o sobrenadante por centrifugação.
Separe uma alíquota de 20 a 40 microlitros do sobrenadante para análise posterior e congele o restante a menos 80 graus Celsius. Em seguida, lave as contas três vezes adicionando um tampão de lavagem de neutravidina refrigerado. Sedimentar as contas e descartar o sobrenadante.
Em seguida, adicione o mesmo tampão e incube as contas por 10 minutos sob rotação contínua a quatro graus Celsius antes de descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem com tampões de lavagem de neutravidina dois e três e eluir as proteínas clicadas incubando as contas por 30 minutos a 20 graus Celsius com um volume de tampão de eluição de neutravidina, correspondente a um volume das contas secas utilizadas. Durante a eluição, mantenha as contas em suspensão a 1000 rotações por minuto em um agitador de bloco térmico iludir duas vezes e combinar ambas as eluidas.
As reações de cliques foram analisadas por SDS page e Western immuno blot. Imagens representativas dos experimentos são mostradas para a administração de azidonorleucina por injeção intraperitoneal e para a administração de azidonorleucina via água potável. Um outro experimento fornece um exemplo para a determinação da concentração ideal de alcina clivável de biotina dissulfureto.
Neste exemplo, a mudança de dobra entre a amostra rotulada e o controle é maior na concentração de alquino micromolar 14. Um exemplo de um resultado de espectrometria de massa com um claro enriquecimento na amostra marcada com azidonorleucina em comparação com o controle é mostrado aqui. Essa diferença já era visível na coloração proteica total.
Além das mudanças na intensidade do peptídeo, há também proteínas únicas encontradas em ambas as amostras. Este é um protocolo tecnicamente complexo e é um passo que deve ser cuidadosamente seguido usando alquilação de controles negativos adequados, limpeza adequada (indistinta) e adequada do arquivo não clicado. Nossos principais passos neste protocolo, as proteínas purificadas podem ser identificadas por espectrometria de massa se o interesse dos pesquisadores é estudar proteínas ou carregá-las em um gel para estudar proteínas de interesse por western blot.
A capacidade deste método de marcar proteínas de uma origem celular específica tem muitas aplicações, como a tensão de proteínas ou o estudo da síntese proteica in vitro ou in vivo.
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Visão Geral
Este protocolo descreve uma abordagem inovadora para a marcação de proteínas específicas de tipos celulares usando azidonorleucina (ANL) com um modelo de camundongo que expressa uma sintetase de tRNA de Metionina mutante L274G (MetRS*). A técnica permite a marcação, purificação e visualização de proteínas in vitro e in vivo, facilitando o estudo da síntese de proteínas e função celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Química de Proteínas
Contexto
- Este protocolo permite a marcação seletiva de proteínas específicas de certos tipos celulares.
- Demonstra inclui aplicações tanto in vitro quanto in vivo.
- O uso de azidonorleucina representa um avanço nas técnicas de marcação de proteínas.
- A imunofluorescência pode ser usada para visualizar proteínas marcadas.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método para isolar proteínas específicas de tipos celulares.
- Fornecer passos detalhados para a marcação e purificação de proteínas.
- Aprimoramento da análise da síntese de proteínas em vários contextos celulares.
Métodos Utilizados
- O estudo envolve um modelo de camundongo que expressa MetRS* para a marcação de proteínas.
- Passos detalhados incluem preparação de lisado de tecido, alquilação e procedimentos de purificação usando contas de neutravidina.
- Reações de química click são empregadas para avaliar a incorporação de azidonorleucina.
- Protocolos para rotas de administração de ANL tanto pela água de bebida quanto intraperitonealmente são descritos.
Principais Resultados
- A marcação bem-sucedida de proteínas foi demonstrada através de várias técnicas de purificação.
- Uma clara distinção nas amostras marcadas foi observada, indicando incorporação efetiva de azidonorleucina.
- As principais descobertas incluem a identificação de proteínas únicas possivelmente ligadas aos processos biológicos sob estudo.
- O protocolo enfatiza controles rigorosos e execução cuidadosa para garantir confiabilidade.
Conclusões
- Este estudo fornece um protocolo único e complexo para estudar proteínas específicas de tipos celulares.
- A capacidade de marcar proteínas oferece insights valiosos sobre mecanismos celulares e síntese de proteínas.
- As descobertas podem avançar nossa compreensão de várias funções biológicas e modelos de doenças.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific protein labeling and purification using the MetRS* mouse line enables precise interrogation of proteomic changes within complex tissues, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This approach reduces sample complexity, allowing for the identification of subtle proteomic shifts relevant to disease and therapeutic intervention. The method enhances predictive confidence at critical inflection points in the discovery pipeline by enabling direct measurement of newly synthesized proteins in defined cellular populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of protein synthesis dynamics in specific cell types within heterogeneous tissues.
- Supports functional target validation by isolating proteomic changes linked to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying cell-type contributions to disease-relevant pathways.
- Improves predictive confidence for target engagement and downstream biological effects.
Screening & Assay Development
- Provides validated, cell-type-specific proteomes for downstream assay development and screening workflows.
- Enables quantitative and reproducible measurement of newly synthesized proteins for assay standardization.
- Supports scalability and platform reuse by allowing both in vitro and in vivo applications.
- Improves reliability of compound evaluation by reducing background from non-target cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns proteomic outputs with disease-relevant cellular populations for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking protein synthesis in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing cell-type-resolved proteomic data.
- Enhances predictive de-risking for translational research by clarifying cellular mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for cell-type-specific proteomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective protein labeling in defined cell populations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative proteomic outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry and immunoblot readouts to compare proteomic profiles across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage findings to preclinical models by enabling in vivo protein synthesis tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for repeated use across diverse research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable proteomic workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cell-type-specific effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, mouse genetics, and click chemistry techniques.
- Demands access to mass spectrometry, immunoblotting, and specialized labeling reagents.
- Necessitates rigorous cross-team standardization and negative controls to ensure data reliability.
- May require adaptation for different tissue types or model systems based on cellular complexity.
- Technical complexity and need for careful execution are critical for reproducible results.
