Name: Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a extrair DNA genômico de Caenorhabditis elegans em pequena escala usando um kit comercial e termociclador. Este método rápido e econômico é ideal para aplicações de PCR em sala de aula e pesquisa.

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A cepa N2 e a bactéria E. coli OP50 foram obtidas do Centro genético de Caenorhabditis (CGC), que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). A cepa blmp-1(tm548) foi obtida do Projeto Nacional de Biorefonte, Japão. Os autores agradecem wormbase. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01GM097591 para t.L.G., financiamento interno da Texas Woman's University para t.L.G, e o Centro de Pesquisa estudantil da TWU para M.F.L.

1. C. elegans manutenção
NOTA: As cepas N2 (tipo selvagem) e blmp-1(tm548) C. elegans foram mantidas nas placas padrão de nematode growth media (NGM) a 20 °C.
<ol><li>Prepare as placas de NGM dissolvendo 23,005 g de pó NGM em 973 mL de água em um frasco de 2 L. Cubra a abertura do frasco com papel alumínio (ou tampa autoclavável que permita a ventilação) e fixe a cobertura com fita autoclave. Autoclave para dissolver o pó e esterilizar o conteúdo com um ciclo de esterilização de pelo menos 30 min.</li>
	<li>Esfrie o médio a 60 °C em banho-maria.</li>
	<li>Ao meio resfriado, adicione 25 mL de fosfato estéril de 1 M (KH2PO4), pH 6.0; 1 mL de solução de cloreto de cálcio de 1 M; e 1 mL de solução de sulfato de magnésio de 1 M.</li>
	<li>Mexa o meio em uma placa de mexida magnética para obter uma mistura homogênea e para evitar o resfriamento e a solidificação irregulares (~5 min). Certifique-se de que a barra de rebuliço gire rápido o suficiente para criar um vórtice, mas não tão rápido que as bolhas sejam introduzidas (~250-300 rpm).</li>
	<li>Despeje ~25 mL do meio em cada placa de Petri de 10 cm (~40 placas no total). Seque as placas à temperatura ambiente durante a noite (tipicamente 16-25 °C).</li>
	<li>Cresça uma colônia de Escherichia coli OP50 em 30-50 mL de caldo LB durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Semente cada placa com 500 μL de cultura E. coli OP50 e deixe-as secar em temperatura ambiente antes do uso (tipicamente 16-25 °C)8. Armazene as placas a 4 °C por até 3 semanas.</li>
	<li>Transfira C. elegans para placas semeadas usando uma picareta de arame ou outro método e deixe-os crescer para L4 ou estágio adulto na temperatura necessária para a cepa (tipicamente 16-25 °C, 1-2 dias se os animais foram banhados famintos como dauers, 3-4 dias se os animais foram banhados como embriões)8.</li>
</ol>2. Extração de DNA de um único verme
NOTA: Este método é útil para extrair DNA de um único verme (um verme em 1,8 μL de volume total). Uma mistura mestra pode ser feita se vários vermes serão lysed ao mesmo tempo.
<ol><li>Programe um termociclador para um ciclo a 55 °C por 10 min seguido de 95 °C para 3 min (programa de lise).</li>
	<li>Alíquota 0,8 μL da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mL no gelo. Adicione 0,2 μL da solução de preparação tecidual do kit à gota da solução de extração. Misture por pipetação.</li>
	<li>Identifique um L4 ou um animal adulto sob um microscópio dissecando9. Para identificar hermafroditas L4, procure uma vulva característica que seja visível como um meio-círculo pálido no meio do animal. Identifique hermafroditas adultas procurando os maiores animais na placa que podem ter embriões ovais visíveis em seu útero.</li>
	<li>Usando uma picareta de fio de platina, transfira o animal selecionado para a solução10.</li>
	<li>Centrifugar o tubo brevemente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g) à temperatura ambiente para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido na Etapa 2.1.</li>
	<li>Quando o programa estiver completo, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Adicione 0,8 μL da solução de neutralização do kit à mistura. Misture por pipetação.</li>
	<li>Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).</li>
	<li>Use diretamente o lise para PCR ou armazene-o a 4 °C ou −20 °C para uso futuro. NOTA: O DNA extraído é estável a 4 °C ou -20 °C por pelo menos 6 meses7.</li>
</ol>3. Extração de DNA de alguns indivíduos
NOTA: Este método é útil para extrair DNA de alguns vermes. Uma mistura mestra pode ser preparada se várias cepas serão líssedas ao mesmo tempo.
<ol><li>Programe o termociclador para um ciclo a 55 °C por 10 min seguido de 95 °C para 3 min (programa de lise).</li>
	<li>Alíquota 2,0 μL da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mL no gelo. Adicione 0,5 μL da solução de preparação tecidual do kit à solução de gotícula de extração. Misture por pipetação.</li>
	<li>Identifique L4 ou animais adultos sob um microscópio de dissecação9. Hermafroditas L4 têm uma vulva característica que é visível como um meio-círculo pálido no meio do animal. Hermafroditas adultas são os maiores animais na placa e podem ter embriões ovais visíveis em seu útero.</li>
	<li>Usando uma picareta de fio de platina, transfira alguns animais para a solução: 9 animais produzem 1 animal equivalente ao DNA genômico por 0,5 μL de lise, e 16 animais produzem ~1 animal equivalente ao DNA genômico em 0,25 μL (3,5 nematoides/μL)10. NOTA: É difícil transferir mais de 16 animais para este volume.</li>
	<li>Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).</li>
	<li>Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido na Etapa 3.1.</li>
	<li>Quando o programa estiver completo, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Adicione 2 μL da solução de neutralização do kit à mistura. Misture por pipetação.</li>
	<li>Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).</li>
	<li>Use diretamente a lise para PCR ou armazene-a a 4 °C ou −20 °C para uso futuro. NOTA: O DNA extraído é estável a 4 °C ou -20 °C por pelo menos 6 meses7.</li>
</ol>4. Reação do PCR
NOTA: Uma aplicação a jusante desta técnica de lise de verme, detectando uma mutação de exclusão usando uma polimerase rápida, é descrita. A eficácia dos dois protocolos de lise de vermes na produção de DNA de modelo genômico para PCR bem sucedido em diluições a 1/50 de um worm por reação também é demonstrada.
<ol><li>Extrair DNA de um único verme e 16 vermes usando cepas de n2 e mutantes do tipo selvagem, como descrito acima no Passo 2 e Passo 3.</li>
	<li>Prepare diluições de 2, 10, 20 e 50 vezes de DNA de um único verme de animais N2 selvagens.</li>
	<li>Configure as reações do PCR seguindo o protocolo do fabricante usando primers específicos para a sequência de interesse e mix mestre pcr de início quente (Tabela 1 e Tabela 2). Use 1 μL de DNA não diluído ou 2 μL de DNA diluído como modelo em cada reação.</li>
	<li>Confirme os produtos PCR por eletroforese de gel e imagem11.</li>
</ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).</li>
<li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li>
<li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li>
<li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNPs%3A+introduction+and+two-point+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).</li>
<li>Biron, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiron%2C+D+%22C.+elegans%3A+Methods+and+Applications%22">C. elegans: Methods and Applications</a>. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).</li>
<li>Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).</li>
<li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SMA-10%2FLRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).</li>
<li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).</li>
<li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li>
<li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRE-1%2FFBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1%2FBLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li>
<li>Huang, T. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1%2FBlimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).</li>
<li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+the+DBL-1%2FBMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Determinar os genótipos de C. elegans é um passo importante ao realizar cruzes genéticas para criar novas cepas de C. elegans . Extração genômica de DNA usando um único ou pouco C. elegans é um passo crucial na genotipagem C. elegans. Este protocolo descreve a extração genômica de DNA de C. elegans usando um kit comercial. Este método é rápido e funciona de forma robusta. O DNA genômico extraído usando este método pode ser usado para aplicações a jusante, incluindo genotipagem...

Aqui, dois protocolos relacionados são apresentados para a lise de caenorhabditis elegans para tornar o DNA acessível para aplicações baseadas em PCR. PCR é uma técnica molecular comumente usada para muitas aplicações, incluindo genotipagem e amplificação de fragmentos de DNA para clonagem e sequenciamento, entre outras. A pequena (1 mm), lombriga de vida livre C. elegans é um sistema animal popular para pesquisa biológica. Obter DNA genômico adequado de um único animal ou alguns animais é suficiente para amplificar a sequência por PCR. Larvas L4 tardias e adultos contêm apenas ~1.000 células somáticas (incluindo algumas células multinucleares, poliploides), células germinativas, e (se o animal é uma hermafrodita gravid) prole no útero1. No entanto, esses animais são protegidos por uma cutícula que deve ser interrompida para extrair o DNA genômico2. Os métodos padrão para preparar o modelo de DNA genômico nematode para PCR envolvem múltiplas etapas e levam várias horas. Os animais são primeiro congelados em tampão de lise de verme contendo proteinase K (−70 °C ou abaixo) por pelo menos 15-45 min (mais tempo é recomendado por alguns protocolos)3,4,5,6. Este passo abre os animais.
Após o congelamento, os animais são incubados por 1h a 60-65 °C para o proteinase K funcionar, em seguida, a enzima é inativada por 15-30 min a 95 °C. O proteinase K destrói os núcleos que degradam o DNA. A inativação da proteinase K antes do PCR é importante para evitar que a proteinase K degrade a polimerase do DNA. Os dois protocolos baseados em kits descritos aqui são métodos rápidos, confiáveis e econômicos para extrair DNA genômico de um único animal ou alguns nematoides para pesquisas diárias e aplicações laboratoriais de ensino. O kit utilizado foi originalmente otimizado pelo fabricante para extrair DNA de tecido animal, saliva e cabelo7. Ele usa uma solução proprietária de preparação de tecidos e solução de extração para células de lise e torna o DNA genômico acessível. Uma solução proprietária de neutralização neutraliza então os componentes que podem inibir o PCR (por exemplo, sais, íons e moléculas de ligação Mg2+).
Ao genotipar, um único animal pode ser testado. Ao determinar se uma cepa é homozigosa, testar seis ou mais descendentes de um único animal dá alta confiança de que uma linha é homozigosa ou não (há uma chance de 0,02% de escolher aleatoriamente seis descendentes mutantes homozigos de um pai heterozigoso [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Este método 1) é simples, com menos passos do que o método proteinase K, e 2) diminui o tempo de preparação do modelo para 15 min. Os resultados deste trabalho demonstram que o protocolo desenvolvido funciona robustamente na extração de DNA genômico de um único ou poucos worms, que podem ser usados de forma confiável para aplicações a jusante que não requerem DNA altamente purificado, incluindo PCR.

<table><tbody><tr><td>fita de autoclave</td><td>Defend</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>folha de alumínio,</td><td>Reynolds Wrap</td><td>2182934</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio</td><td>Millipore Sigma</td><td>102382 (CAS 10035-04-8)</td><td></td></tr><tr><td>Kit Extract-N-Amp (inclui Solução de Preparação de Tecidos, Solução de Extração e Solução de Neutralização)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>XNAT2-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento/agitador Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-495H</td><td></td></tr><tr><td>LB media, Lennox,</td><td>cápsulas MP Biomedicals, LLC</td><td>3002-131</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnésio, 97% puro, anidro</td><td>Microcentrífuga Thermo Scientific</td><td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td><td></td></tr> <tr><td>Labnet</td><td>International, Inc.</td><td>PrismR, C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>NEB Q5U DNA polimerase de alta fidelidade de partida a quente</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0515S</td> <td>"Pol E" usado na Figura Suplementar S1, uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade (20&ndash; 30 s/kb)</td></tr> <tr><td>Pó de mídia NGM</td><td>US Biological Life Sciences</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix com HF Buffer</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0531S</td> <td>"Pol D" na Figura 1B, uma polimerase de alta velocidade e alta fidelidade (15&ndash; 30 s/kb)</td></tr> <tr><td>primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>oligos</td><td></td>de DNA personalizados</tr><tr><td>PrimeSTAR GXL polimerase</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>R050B</td> <td>"Pol C" na Figura 1B, uma polimerase de alta fidelidade (1 min/kb) para modelos ricos em GC e modelos de até 30 kb</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0,1&ndash; 10.0 kb)</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR350A</td><td>"Pol A" na Figura 1B, polimerase usada na Figura 1A, C, D, uma polimerase de alta velocidade (10 s/kb) para alvos de até 5 kb</td></tr><tr><td>Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>P4600</td><td>"Pol B" na Figura 1B, uma polimerase (1 min/kb) para alvos de até 7 kb</td></tr><tr><td>Termociclador SimpliAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24812</td><td></td></tr><tr><td>barra de agitação</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-126</td><td></td></tr><tr><td>misturador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>picareta de minhoca</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

extração em pequena escala de caenorhabditis elegans dna genômico

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

A extração de DNA genômico de um único ou alguns elegans de Caenorhabditis tem muitas aplicações a jusante, incluindo PCR para linhas de genotipagem, clonagem e sequenciamento. Os métodos tradicionais à base de proteínas à base de K para extração genômica de DNA de C. elegans levam várias horas. Kits de extração comercial que efetivamente quebram a cutícula C. elegans e extraem DNA genômico são limitados. Um método fácil, mais rápido (~15 min), e econômico de extrair DNA genômico C. elegans que funciona bem para aplicações em sala de aula e pesquisa é relatado aqui. Este método de extração de DNA é otimizado para usar nematoides únicos ou algumas larvas tardias (L4) ou nematoides adultos como material inicial para a obtenção de um modelo confiável para executar PCR. Os resultados indicam que a qualidade do DNA é adequada para amplificar alvos genéticos de diferentes tamanhos por PCR, permitindo genotipagem de animais únicos ou alguns, mesmo em diluições a um cinquenta do DNA genômico de um único adulto por reação. Os protocolos relatados podem ser usados de forma confiável para produzir rapidamente o modelo de DNA a partir de uma única ou uma pequena amostra de C. elegans para aplicações baseadas em PCR.

O DNA genômico de um único ou alguns adultos do tipo selvagem foi extraído usando o kit comercial ou o protocolo tradicional de lise para comparar a eficácia desses dois métodos. Esses lises foram então usados como modelos para PCR para amplificar um alvo maior de ~2.100 bp (codificação blmp-1) ou um alvo menor de ~500 bp (codificando uma parte do sma-10). Ambos os métodos produziram com sucesso produtos PCR apropriados (Figura 1A).
Em seguida, f...

Apresentado aqui é uma descrição do isolamento simples e relativamente rápido de Caenorhabditis elegans DNA genômico de um ou poucos animais usando um kit de tecido comercialmente disponível. A preparação gDNA resultante é um modelo adequado para PCR.

Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Desenvolvemos um método fácil, rápido e econômico de extrair DNA genômico de C.elegans que funciona muito bem para aplicações em sala de aula e pesquisa. Esses protocolos podem ser usados de forma confiável para produzir rapidamente modelos de DNA a partir de uma única ou uma pequena amostra de elegância c.para aplicações baseadas em PCR. Usuários que não têm experiência em escolher worms ou usar um micropipetter podem ter dificuldades com etapas que requerem essas habilidades.Observar um praticante qualificado e praticar pode ajudar. Demonstrando o procedimento estará Farhan Lakdawala, um estudante de pós-graduação sênior do meu laboratório. Para extrair DNA de um único verme de Caenorhabditis elegans, primeiro, defina o programa de lise consistindo de um ciclo a 55 graus Celsius por 10 minutos seguido de 95 graus Celsius por três minutos em um termociclador.Para preparar a solução de lise, primeiro, adicione 0,8 microliters de solução de extração do kit à parede interna de um tubo PCR de 0,2 mililitro no gelo. Em seguida, adicione 0,2 microliters de solução de preparação tecidual do kit à gota da solução de extração e misture por acariciar. Com a seleção de um verme para extração de DNA, primeiro, identifique um L4 ou um animal adulto sob um microscópio dissecando.Uma hermafrodita L4 pode ser identificada por uma vulva característica que é visível como um meio círculo pálido no meio do animal. Para identificar uma hermafrodita adulta, selecione um dos maiores animais na placa que pode ter embriões ovais visíveis em seu útero. Em seguida, usando uma picareta de fio de platina, transfira o animal selecionado para a solução.Para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo, centrifugar o tubo por dois a três segundos a 2000 x g em temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido mais cedo. Depois que este programa de lise acabar, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo.Em seguida, adicione 0,8 microliters de solução de neutralização do kit e misture por pipetação. Novamente, centrifufique o tubo por dois a três segundos a 2000 x g à temperatura ambiente. Se o liseto não for usado imediatamente, armazene o tubo a quatro graus Celsius para uso futuro.Extrair DNA de um verme individual também, primeiro, defina o programa de lise de um ciclo a 55 graus Celsius por 10 minutos seguido de 95 graus Celsius por três minutos em um termociclador. Em seguida, prepare a solução de lise adicionando primeiro dois microliters da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mililitro no gelo, seguido pela adição de 0,5 microliters da solução de preparação tecidual do kit à gota da solução de extração, em seguida, misture o conteúdo por pipetação. Depois de identificar L4 ou animais adultos, use uma picareta de fio de platina para transferir um número adequado de animais para a solução.Em seguida, centrifugar o tubo por dois a três segundos a 2000 x g em temperatura ambiente, em seguida, coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise previamente definido. Após a conclusão do programa, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Em seguida, adicione dois microliters da solução de neutralização do kit ao tubo e misturado por pipetação.Novamente, centrifufique o tubo por dois a três segundos a 2000 x g à temperatura ambiente. Se não for usado imediatamente, armazene o lysate a quatro graus Celsius para uso futuro. O DNA genômico extraído pelo protocolo poderia ser usado com sucesso como modelo PCR, tanto o kit comercial quanto o método tradicional proteinase K produziram DNA com níveis semelhantes de amplificação PCR de um produto de par base de 2100 e um produto de par de base de 500.O método do kit para lise de DNA também forneceu modelos pcr eficazes para uma variedade de enzimas de polimerase de DNA. Mesmo em diferentes diluições, o DNA extraído de um único animal pelo kit comercial apoiou a amplificação pcr de um fragmento de DNA de par de base de 2100 com eficiência equivalente. No entanto, a amplificação de um fragmento de DNA de par de 500 bases variou com a concentração do modelo.A adequação do DNA extraído de um único animal ou de vários animais como modelo pcr para determinar o genótipo foi ainda demonstrado pela amplificação bem sucedida de um gene e sua variante mutada. Como este protocolo envolve a pipetação de pequeno volume de reagentes, para garantir a consistência, use uma mistura mestre para múltiplas reações, boa técnica de tubulação e pipetas bem calibradas. Além disso, girar o conteúdo do tubo garante a lise adequada.Este método poderia ser ampliado, adaptado para extrair DNA genômico de C.elegans para outras aplicações a jusante, e poderia ser usado para extrair DNA de outras espécies de nematoides. Dada a simplicidade, velocidade, robustez e baixo custo do protocolo, ele é adequado tanto para pesquisas quanto para aplicações em sala de aula, onde o tempo e os recursos são limitados.

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Biologia

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Aprenda a extrair DNA genômico de Caenorhabditis elegans em pequena escala usando um kit comercial e termociclador. Este método rápido e econômico é ideal para aplicações de PCR em sala de aula e pesquisa.

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