Name: Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a caracterizar fragmentos de RNA resultantes de degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Este método versátil permite análises com pequenas amostras e treinamento mínimo.

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É importante ressaltar que este trabalho foi um esforço colaborativo entre três instituições, dois grupos de pesquisa e uma instalação central. A distribuição e a carga de trabalho foram realizadas da seguinte forma: Expressão proteica (Xrn-1) foi realizada na Universidade de Denver (Denver, CO). A síntese de oligonucleotídeos, quantificação e experimentação (principalmente degradação enzimática) foram conduzidas na Universidade do Colorado Denver (Denver, CO). Também foi realizada otimização lá. As manchas, aquisições e análises maldi-TOF foram realizadas no Centro de Recursos Analíticos da Universidade estadual do Colorado. (Fort Collins, CO). A SS gostaria de reconhecer um prêmio UROP Award (CU Denver) e bolsas Eureca (CU Denver) para apoio. E. G.C. reconhece o suporte da NIGMS, via R00GM115757. A MJER reconhece o suporte da NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. reconhece iD de recursos: SCR_021758. O trabalho também foi apoiado por um Prêmio Professor-Acadêmico (MJER), TH-21-028, da Fundação Henry Dreyfus.

A água ultra pura sem rnase (Tabela 1) foi utilizada para o presente estudo.
1. Determinação de concentração da solução RNA
<ol><li>Prepare a amostra de RNA seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Use um tubo de microcentrifuge (0,6 mL) para preparar uma solução de RNA diluindo 1 μL de solução de estoque (obtida através de síntese em fase sólida)19 em 159 μL de H2O. Livre de RNase misture a solução pipetando a mistura para cima e para baixo repetidamente (10x). NOTA: Uma vez que uma ampla gama de cuvetas estão disponíveis comercialmente, os volumes necessários podem diferir. Foram utilizadas cuvetas com comprimento de 1 cm e volume reduzido (150 μL).</li>
		<li>Enxágüe o cuvette UV-vis com metanol (2x), seguido de água (ultrapure H2O, 3x, ver Tabela de Materiais). Use um fluxo de gás nitrogênio para secar completamente a cuvette.</li>
		<li>Use uma pipeta para transferir a solução (passo 1.1.1) para o cuvette, garantindo que não haja bolhas de ar. Tampe a cuvette e coloque-a para o lado até que seja necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Determine a concentração da solução RNA preparada usando UV-vis Spectrophotometer.<ol>
<li>Ligue o espectrômetro UV-Vis invertendo o interruptor localizado na parte de trás do instrumento. Permita que o instrumento complete o procedimento de inicialização e clique no ícone UV WinLab para abrir a janela de operação/controle do instrumento.</li>
		<li>Ligue o espectrômetro do Controlador de Temperatura Peltier usando o interruptor localizado à direita do instrumento.</li>
		<li>Em Métodos Básicos, clique em Scan - Lambda 365. Outra tela abrirá e solicitará ao usuário que garanta que os suportes de celular estejam vazios. Clique em OK e permita que o instrumento realize suas verificações de sistema. Em seguida, o sistema exibirá uma lista de verificações, garantirá que todos "Passe" e clique em OK. NOTA: Recomenda-se seguir as etapas 1.2.1-1.2.3 na ordem fornecida; alterar essa sequência de eventos pode levar ao mau funcionamento do software.</li>
		<li>Ajuste os parâmetros de digitalização selecionando a Coleta de Dados. Na nova janela em Configurações de varredura , altere o Iniciar para 350 nm e o Final para 215 nm.</li>
		<li>Ative o Peltier selecionando o + à esquerda do Acessório. Clique em Multiple Cell Peltier, altere a temperatura °C para 25 e clique em Peltier On.</li>
		<li>Navegue até a guia Informações de amostra e digite o número de amostras, nomes e posição celular conforme desejado.</li>
		<li>Clique em Autozero e insira a cuvette contendo a solução de fundo. Certifique-se de posicionar esta cuvette no mesmo slot onde as medidas serão realizadas.</li>
		<li>Clique em Iniciar e insira o cuvette (passo 1.1.3) na célula desejada. Certifique-se de que a janela cuvette esteja orientada paralelamente à face frontal do instrumento. Clique em OK para iniciar a primeira varredura a 25 °C.</li>
		<li>Para medições em temperaturas mais altas, repita as etapas 1.2.5-1.2.8 e altere a temperatura para a temperatura amostral desejada (90 °C no presente caso).</li>
		<li>Clique em Arquivo > Exportar e escolha o local do arquivo desejado. Selecione XY Data para obter um arquivo .txt. NOTA: Um auxílio ilustrativo da etapa 1.2 pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 1 (S1-S7).</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar aquisição de dados para determinar a concentração de RNA.<ol>
<li>Encontre o arquivo de cada espectro na guia Resultados . Para obter a absorvância, passe o mouse sobre a linha, navegue até 260 nm e regisse as absorvâncias exibidas. Alternativamente, através da cascata de > de arquivos export , exporte os dados como um arquivo .txt para análises gráficas adicionais usando outro software de plotagem. NOTA: Se 0,1 < A ≥ 1, será necessário diluir ou aumentar a concentração da amostra de RNA preparada na etapa 1.1.1.</li>
		<li>Use a lei Beer-Lambert para calcular a concentração da solução. NOTA: Lei da Cerveja: A = εcl, onde: R: Absorvância (a 260 nm neste caso, a partir da etapa 1.3.1) ε: Coeficiente de extinção. Para a sequência utilizada aqui, 208.000 L mol-1 cm-1 é o valor obtido a partir de uma ferramenta OligoAnalyzer. l: Comprimento do caminho, 1 cm c: concentração da amostra</li>
		<li>Use esses cálculos para preparar a solução desejada do RNA para ser usado para experimentos subsequentes. Foram utilizadas soluções com [RNA] = 200 μM no presente estudo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hidrólise de oligonucleotídeos de RNA por Xrn-1
<ol><li>Realize a fosforilação de 5' do RNA seguindo as etapas abaixo.<ol>
<li>Use um tubo de microcentrifuge de 0,6 mL para preparar a seguinte solução (volume total de 50 μL).<ol>
<li>Adicionar H2O sem RNase (33,5 μL); os volumes podem variar dependendo do [RNA].</li>
			<li>Em seguida, adicione a solução A (5 L, Tabela 1).</li>
			<li>Adicione uma solução aquosa de triptofato de adenosina (ATP, ver Tabela de Materiais) (6 L, 10 mM, 60 nmol).</li>
			<li>Adicionar solução aquosa RNA (1 μL, 200 μM, 200 pmol).</li>
			<li>Adicione a solução de quinase de polinucleotídeo (enzima PNK, ver Tabela de Materiais) (4,5 L, 45 unidades). Misture suavemente ao pipetar a mistura para cima e para baixo (10x).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubar a mistura de reação a 37 °C por 45 min colocando-a em um banho de água.</li>
		<li>Inativar a enzima colocando o tubo de reação em um bloco de calor pré-aquecido (65 °C) e incubando a solução por 10 minutos.</li>
		<li>Permitir que a solução esfrie à temperatura ambiente (a fosforilação do RNA foi caracterizada através da análise MALDI-TOF, ver Resultados Representativos) para produzir uma solução final de RNA de 5'-fosforilado (4 μM, 50 μL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute a hidrólise de RNA por Xrn-1 seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Utilizando a solução (50 μL) a partir da etapa 2.1.4, realize as seguintes etapas.<ol>
<li>Adicionar a solução B (5 L, Tabela 1).</li>
			<li>Adicione uma solução de Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol). Misture a solução gentilmente tubondo para cima e para baixo (10x).</li>
			<li>Incubar o tubo de reação à temperatura ambiente por 2 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transfira a mistura de reação (passo 2.2.1.3) em um dispositivo centrífugo do tamanho de um poro de 10 kDa (ver Tabela de Materiais) e filtre as enzimas por centrifugação (700 x g por 10 min a temperatura ambiente).</li>
		<li>Transfira o filtrado para um tubo centrífuga de 0,6 mL.</li>
		<li>Lave o RNA residual no tubo centrífugo (passo 2.2.2.2.) adicionando H 2 O (20L) livre de RNase, seguido de centrifugação (700 x g por 10 min a temperatura ambiente).</li>
		<li>Combine o filtrado com o obtido a partir da etapa 2.2.3.</li>
		<li>Armazene o tubo contendo a solução resultante em um congelador (0 °C) ou navio para análise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Desalting da solução RNA, mancha de placa MALDI-TOF
<ol><li>Desaltar e concentrar a amostra usando dicas de pipeta C18 de troca de cás disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>Posicione uma ponta de pipeta 10 L C18 (ponta de pipeta carregada com uma cama de mídia cromatografia C18 fixada no final) em uma pipeta de 10 μL e, em seguida, continue com o seguinte:<ol>
<li>Lave a ponta C18 com 50% de acetonitrila aquosa (10 μL) solução duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.</li>
			<li>Equilibre a ponta C18 com uma solução aquosa de ácido trifluoroacético (0,1% TFA, 10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.</li>
			<li>Remova manualmente a ponta C18 da pipeta e fixe-a em uma pipeta de 200 μL contendo uma ponta de pipeta P200 (a ponta C18 agora será anexada à ponta da pipeta P200).</li>
			<li>Mergulhe a ponta C18 na solução (passo 2.2.6), e aplaque a solução através da ponta C18 dez vezes. NOTA: A amostra de RNA fica ligada à resina de troca de cation dentro da ponta.</li>
			<li>Retire a ponta C18 da pipeta P200 e posicione-a sobre uma pipeta de 10 μL.</li>
			<li>Lave a ponta C18 usando uma solução aquosa de 0,1% TFA (10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.</li>
			<li>Lave a ponta C18 com água sem RNase (10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque na placa MALDI seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Elute o oligonucleotídeo RNA da ponta C18 (passo 3.1.1.7) imergindo a amostra na matriz desejada (10 μL, solução 1:1 de C e D, Tabela 1), seguido pela distribuição da solução de volta para o tubo. Repita este processo dez vezes.</li>
		<li>Pipeta a solução de 3.2.1 em dois pontos separados na placa (1 μL cada, 20 pmol). Deixe as manchas secarem o ar (Figura 1A e Vídeo 1). NOTA: Este processo pode ser repetido no mesmo local para aumentar a concentração amostral em cada ponto.</li>
		<li>Pipeta desejava calibrante (1 L) em dois pontos separados fisicamente perto do local da amostra e permitia secar o ar. NOTA: O padrão de teste utilizado no presente estudo foi obtido a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Sobre-coloque o calibrante [totalmente seco] com a matriz desejada (1 L). Deixe secar o ar. NOTA: É importante rastrear a posição onde as amostras e calibrantes são detectados antes da inserção no instrumento. Anote isso usando o sistema de coordenadas da placa, por exemplo, a amostra 1 está localizada na posição (C,3)</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Aquisição e processamento de dados
NOTA: Em geral, o THAP requer maior potência laser para alcançar a ionização. Além disso, os oligos podem ser difíceis de ionizar sem fragmentar. Assim, geralmente é necessário usar o menor poder laser possível e aumentar os ganhos do detector e/ou menor frequência de laser para maximizar a detecção e minimizar a fragmentação.
<ol><li>Realize a aquisição de dados seguindo as etapas abaixo. NOTA: As medidas de peso molecular foram realizadas utilizando-se um espectrômetro de massa (ver Tabela de Materiais), em íon positivo, modo linear com tensão de origem íon de 20 kV, ganho de detector de ~2,8 kV, e uma frequência laser de 20 Hz. As faixas de varredura foram definidas com base no peso molecular esperado( s). Estes foram calculados e expressos em massa sobre carga (m/z), onde a carga foi de 1. A calibração externa foi realizada usando uma mistura de calibração proteica (Padrão de Teste Bacteriano, veja Tabela de Materiais), em um local adjacente à amostra. Os dados brutos foram então processados no software flexAnalysis (ver Tabela de materiais).<ol><li>Abra o "software Flexcontrol" para operação. Pressione o botão verde de dentro/para fora do instrumento, aguarde que o estágio alvo se mova e aspire para ventilar. Abra a tampa, coloque a placa alvo totalmente seca no instrumento. Certifique-se de alinhar na orientação certa (Figura 1B).</li>
		<li>Abaixe suavemente a tampa e pressione o botão verde de dentro/para fora . Aguarde que a placa seja retraída e o instrumento volte a bombear para baixo. Uma vez que a barra de status (canto inferior direito da janela de software) reflita 'Pronto', proceda com calibração.</li>
		<li>Para calibrar os instrumentos usando o software, realize o seguinte.<ol>
<li>Selecione o método desejado clicando no Método de seleção de arquivos > ou pressionando o botão Selecionar adjacente ao método carregado. Clique na Coordenada para o ponto calibrante. Navegue até a guia Calibração e confirme se o calibrador correto está selecionado. Certifique-se de que a caminhada aleatória está desatrada (na guia Portadora de amostras ).</li>
			<li>Pressione Start e direcione manualmente o laser ao longo de um cristal (clicando na seta do mouse no local desejado na visão da câmera). Ajuste a potência do laser, se necessário. Uma vez satisfeito com as configurações, pressione Comece a coletar espectros e adicione-os ao buffer de soma.</li>
			<li>Adicione espectros à soma até que a intensidade suficiente seja alcançada. Alterne para ver apenas o buffer de soma, subtraia a linha de base e suave. Em seguida, clique em Atribuir Automático. Verifique cada pico atribuído e observe o erro ppm. Se estiver satisfeito com atribuições e erros, clique em Aplicar.</li>
			<li>Limpe o buffer de soma e navegue até a posição da primeira amostra.</li>
			<li>Confirme o intervalo de varredura desejado (guia 'Detecção'). Ajuste as barras na "Faixa de Massa" para que a região verde represente a massa esperada(es).</li>
			<li>Clique diretamente na janela de ampliação para que as miras sejam orientadas para o fragmento cristalizado desejado (cristais maiores geralmente produzem os melhores resultados, Figura 2).</li>
			<li>Colete alguns espectros ao longo dos cristais grandes, ajustando a potência do laser conforme necessário. A configuração adequada é 5%-10% acima da potência em que os picos aparecem.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para obter espectros, realize o seguinte.<ol>
<li>Clique em Iniciar para observar o flash laser em conjunto com o aumento da intensidade espectral (mostrada na janela no canto superior direito). Mova o laser ao longo do comprimento do cristal clicando na seta do mouse para cima e para baixo do cristal (Vídeo 2).</li>
			<li>Clique em Adicionar diretamente abaixo Iniciar.</li>
			<li>Repita isso várias vezes até que a intensidade/número de tiros desejados seja atingida (refletida no eixo y da janela espectral)</li>
			<li>Ajuste a potência do laser e/ou velocidade e/ou detector ganhos se as varreduras iniciais forem insatisfatórias. Repetição de passos 4.1.4.1-4.1.4.3 conforme necessário.</li>
			<li>Se estiver satisfeito com o espectro, clique em Salvar Como salvar o espectro sob um nome especificado. Em seguida, se forem necessárias outras amostras, clique em Clear Sum e repita etapas sob a etapa 4.1.4.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Executar o processamento de dados. NOTA: O passo 4.2 descreve uma maneira de analisar os dados usando o software flexAnalysis.<ol>
<li>Abra o software desejado. Em seguida, abra espectro (a) selecionando Arquivo. No menu suspenso, selecione Abrir.</li>
		<li>Uma nova janela será exibida. Clique em Procurar para localizar os arquivos salvos da etapa 4.1.4. Verifique as caixas para os arquivos desejados e clique em Abrir à esquerda. Se apenas um único espectro exigir análise, basta arrastar e soltar o arquivo na janela do software.</li>
		<li>Destaque o arquivo carregado para análise em massa. Navegue até a guia Processo na barra de ferramentas. Na linha de base do espectro de massa subtraída. NOTA: O algoritmo utilizado para a subtração será determinado pelo método selecionado na etapa 4.1.3.</li>
		<li>Navegue até a guia Processo na barra de ferramentas. No dropdown, selecione Smooth Mass Spectrum. NOTA: O algoritmo utilizado para a suavização será determinado pelo método selecionado na etapa 4.1.3.</li>
		<li>Clique na guia Lista de massas ; no dropdown, selecione Encontrar. Este comando rotula automaticamente picos com suas massas; uma lista das massas será exibida na tela à direita.</li>
		<li>Para adicionar ou excluir picos, prossiga para a guia Lista de massa . No dropdown, clique em Editar.</li>
		<li>Paire sobre o eixo x do espectro; uma linha vertical representa a localização do espectro onde o cursor está ligado. NOTA: Um ícone com um gráfico e um cursor aparecerá quando uma nova massa pode ser adicionada clicando. Este ícone aparecerá ao pairar sobre picos que podem ser excluídos clicando (ver etapa 4.2.7 em Arquivo Suplementar 1).</li>
		<li>Repetir as etapas 4.1.3-4.1.7 para espectros adicionais. Exporte a lista de massa para todos os espectros clicando e arrastando para destacar os arquivos à esquerda e execute a seguinte cascata de arquivos > exporte > lista de massa para Excel.</li>
		<li>Para exportar espectros como mostrado na tela, faça uma captura de tela ou exporte-a como um relatório. Para este último, navegue até o menu Relatório . No dropdown, selecione Salvar como PDF. NOTA: Pode-se alterar a forma como os espectros são exibidos usando as três guias abaixo do espectro e/ou variando os arquivos destacados. Uma tela vai aparecer. Nomeie o documento PDF conforme desejado, ajuste as configurações/layout e clique em Salvar para gerar uma imagem do espectro.</li>
		<li>A imagem gerada refletirá a visão espectral no programa de software. Para manipular a visão, execute o seguinte.<ol>
<li>Ampliação: Clique no botão Zoom In na barra de ferramentas.</li>
			<li>Passe o mouse sobre o eixo x e clique até que a faixa desejada seja alcançada.</li>
			<li>Zoom out/desfaz: Clique no botão Zoom Out e clique em qualquer lugar do espectro para retornar à visão completa. NOTA: Um auxílio ilustrativo para as etapas 4.1 e 4.2 pode ser encontrado nos Arquivos Suplementares 1 (pp S8-S23 e S24-S30, respectivamente).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS%2FMS+and+Top-Down+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).</li>
<li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+%288-oxoG%29+by+the+exoribonuclease+Xrn-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).</li>
<li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2%27-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).</li>
<li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li>
<li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5%27-mononucleotides+by+a+5%27+leads+to+3%27+mode+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li>
<li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).</li>
<li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li>
<li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).</li>
<li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li>
<li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule%2Fpeptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li>
<li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521(2022).</li>
<li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O principal desafio nesse fluxo de trabalho surgiu entre finalizar os experimentos e realizar as análises espectrométricas em massa. Experimentos foram realizados e concluídos na Universidade do Colorado Denver e enviados (durante a noite) para as instalações da Universidade estadual do Colorado. A aquisição de dados foi realizada mediante recebimento, conforme conveniência. Várias circunstâncias inesperadas levaram a atrasos de tempo no processo. Em um caso, defeitos inesperados de instrumentos exigiram que as amostras ...

MALDI-TOF 1,2,3 é uma técnica amplamente utilizada para a caracterização e/ou detecção de moléculas de tamanhos e características variados. Alguns de seus usos incluem diversas aplicações como a detecção de taninos a partir de recursos naturais4, metabólitos por imagem em alimentos5, descoberta ou monitoramento de alvos ou marcadores de drogas celulares6, e diagnóstico clínico7, para citar alguns. De relevância para o presente trabalho é o uso de MALDI-TOF com DNA ou RNA, com seu uso em oligonucleotídeos datando de mais de três décadas8, onde várias limitações foram observadas. Esta técnica evoluiu agora para um meio confiável e comumente utilizado para caracterizar tanto biopolímeros9 quanto identificar/entender reações químicas e bioquímicas, por exemplo, caracterização de locais platinados no RNA10, identificação de fragmentos de RNA após o decotedo fio 11,12, ou formação de ligações cruzadas proteína-DNA13 . Assim, é valioso ilustrar e destacar aspectos importantes do uso dessa técnica. Os fundamentos do MALDI-TOF foram descritos em formato de vídeo, bem como14 e não serão mais elaborados aqui. Além disso, sua aplicação em um contexto de DNA ou proteína foi previamente descrita e ilustrada no referido formato 15,16,17.
O protocolo de detecção de fragmentos de RNA formados após hidrólise enzimática é relatado aqui. O modelo experimental foi escolhido com base em um achado recente publicado pelo nosso grupo18, onde o MALDI-TOF foi usado para determinar a reatividade única entre o exoribonuclease Xrn-1 e os oligonucleotídeos do RNA contendo a lesão oxidativa 8-oxoG. Os fios longos de 20 nucleotídeos foram obtidos através da síntese em fase sólida19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], enquanto Xrn-1 foi expresso e purificado após o relatório descrito anteriormente20. Resumindo, Xrn-121 é uma exorapenasnucleação de 5'3' com vários papéis biológicos importantes que degradam vários tipos de RNA, incluindo RNAoxidado 22. Verificou-se que a processividade da enzima para ao encontrar 8-oxoG, o que levou a fragmentos de RNA contendo extremidades fosfoiladas de 5'-phosphoiladas [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Por fim, é importante notar que a espectrometria de massa é um método poderoso que, através de várias metodologias, pode ser adaptado para outros propósitos23,24; assim, escolher o método de ionização certo, bem como outras configurações experimentais é de extrema importância.

<table><tbody><tr><td>0,6 mL MCT Graduado Violet Fisher</td><td>Scientific</td><td>05-408-127</td><td></td></tr><tr><td>6'-Trihidroxiacetofenona monohidratado 98%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila 99,9%, grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina, 10</td><td>mM New Englang Bioscience</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amônio, dibásico 98% </td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de amônio 98,0%, grau ACS</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de teste bacteriano Bruker</td><td>Daltonics</td><td>8255343</td><td></td></tr><tr><td>Fonte comercial de Xrn-1</td><td>New England BioLabs</td><td>M0338S</td><td></td></tr><tr><td>Dietil pirocarbonato, 97%</td> <td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>análise Flex software</td><td>Bruker daltonics</td><td></td><td>FlexAnalysis software versão 3.4, Bruker Daltonics</td></tr><tr><td>Lambda 365 UV-vis espectrofotômetro</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa MALDI: MSP 96 alvo de aço retificado</td><td>Bruker Daltonics</td><td>280799</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex LRFTOF espectrômetro de massa (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td></tr><tr><td>Mili-Q IQ 7000</td><td>Milipore Sigma</td><td></td><td>Um sistema Mili-Q foi usado para purificar toda a água usada neste trabalho</td></tr><tr><td>Dispositivos centrífugos Nanosep com membrana OmegaTM 10 K, meio filtrante azul (24/pkg)</td><td>Pall Corporation</td><td>OD010C33</td>, <td>tamanho de poro Omega (polietersulfona modificada) 10 K</td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>B7003S</td><td>Esta é a solução B</td></tr><tr><td>Ferramenta de analisador de oligo</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta P10</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-441</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta P200</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-419</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo quinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo quinase Reação Buffer</td><td>Novo Inglaterra BioLabs</td><td>B0201S</td><td>Esta é a solução A</td></tr><tr><td>Ácido Triflouroacético</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Xrn-1 exoribonuclease</td><td>Expresso em casa</td><td>Veja ref. 20</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta ZipTip para preparação de amostras</td><td>Millipore</td><td>ZTC 18S 096</td><td>10 &micro; L carregadas com um padrão C18 0,6 &micro; Cama em L</td></tr></tbody></table>

identificação de fragmentos de rna resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa maldi-tof

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

O RNA é um biopolímero presente em todos os domínios da vida, e suas interações com outras moléculas e/ou espécies reativas, por exemplo, DNA, proteínas, íons, drogas e radicais livres, são onipresentes. Como resultado, o RNA sofre várias reações que incluem seu decote, degradação ou modificação, levando a espécies biologicamente relevantes com funções e implicações distintas. Um exemplo é a oxidação da guanina para 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que pode ocorrer na presença de espécies reativas de oxigênio (ROS). No geral, procedimentos que caracterizam tais produtos e transformações são em grande parte valiosos para a comunidade científica. Para isso, a espectrometria de massa de desorpização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) é um método amplamente utilizado. O presente protocolo descreve como caracterizar fragmentos de RNA formados após o tratamento enzimático. O modelo escolhido usa uma reação entre o RNA e o exoribonuclease Xrn-1, onde a digestão enzimática é interrompida em locais oxidados. Duas sequências de RNA longa de 20 nucleotídeos [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] foram obtidas através de síntese de fase sólida, quantificado por espectroscopia UV-vis, e caracterizado via MALDI-TOF. Os fios obtidos foram então (1) 5'-fosforilados e caracterizados via MALDI-TOF; (2) tratado com Xrn-1; (3) filtrado e desálhado; (4) analisado via MALDI-TOF. Esta configuração experimental levou à identificação inequívoca dos fragmentos associados à paralisação de Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Os experimentos descritos foram realizados com 200 picomols de RNA (20 pmol utilizados para análises MALDI); no entanto, quantidades mais baixas podem resultar em picos detectáveis com espectrômetros usando fontes laser com mais potência do que a usada neste trabalho. É importante ressaltar que a metodologia descrita pode ser generalizada e potencialmente estendida à identificação do produto para outros processos envolvendo RNA e DNA, podendo auxiliar na caracterização/elucidação de outras vias bioquímicas.

Os oligonucleotídeos utilizados neste trabalho foram sintetizados, caracterizados e quantificados antes do uso. A concentração de todos os oligonucleotídeos foi determinada através de espectroscopia UV-vis registrada a 90 °C para evitar leituras errôneas decorrentes da formação potencial das estruturas secundárias. A Figura 3 exibe os espectros do modelo oligonucleotídeos de RNA utilizados neste trabalho, tomados à temperatura ambiente e após a aplicação do calor.
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MALDI-TOF foi utilizado para caracterizar fragmentos obtidos a partir da reatividade entre o RNA oxidado e o exoribonuclease Xrn-1. O presente protocolo descreve uma metodologia que pode ser aplicada a outros processos envolvendo RNA e/ou DNA.

Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

A espectrometria de massa tem sido amplamente adotada para várias aplicações. A metodologia deste artigo fornece a caracterização inequívoca dos fragmentos de RNA obtidos a partir de um processo enzimático in vitro. As vantagens dessa técnica incluem que o pico de ferro da molécula é obtido, que os experimentos podem ser realizados com pequenas quantidades de material para aplicações in vitro, e que o protocolo pode ser realizado com treinamento mínimo.A metodologia descrita pode ser amplamente aplicada aos processos de estudo envolvendo DNA, RNA ou proteínas. Exemplos incluem transformações bioquímicas, como informações cruzadas, identificação de modificações químicas ou outras interações biopolímeras e reatividade. Uma dificuldade pode ocorrer desde a acessibilidade até um espectrômetro MALDI ou instalações principais que oferecem este serviço.Outro aspecto é o estabelecimento do limite de detecção que pode ser maior ou menor dependendo do instrumento. Para começar, ligue o espectrofotômetro UV-Vis e clique no ícone Dolhá-winlab perkinelmer UV para abrir a janela de controle de operação do instrumento. Ligue o espectrômetro do controlador de temperatura Peltier usando o interruptor localizado à direita do instrumento e clique em Scan-Lambda 365, presente em Métodos básicos.Outra tela abrirá e solicitará ao usuário que garanta que os suportes de celular estejam vazios. Clique em OK e permita que o instrumento realize suas verificações de sistema. Agora, ajuste os parâmetros de digitalização selecionando a Coleta de Dados.Na nova janela em Configurações de varredura, altere a partida para 350 nanômetros e o final para 215 nanômetros. Ative o Peltier selecionando a vantagem à esquerda do acessório. Em seguida, clique em Multiple Cell Peltier, altere os graus de temperatura Celsius para 25 e clique em Peltier On.Navegue até a guia de informações da amostra e digite o número de amostras, nomes e posição celular desejadas.Clique em Autozero e insira a cuvette contendo a solução de fundo. Clique em Iniciar e inserir o cuvette na célula desejada e certifique-se de que a janela cuvette seja orientada paralelamente à face frontal do instrumento. Agora, clique em OK para começar a primeira varredura a 25 graus Celsius.Para medições a temperaturas mais altas, clique em Multiple Cell Peltier, altere a temperatura para a temperatura da amostra desejada e repita a varredura. Clique em Arquivo, Exporte e escolha o local do arquivo desejado e selecione XY Data para obter um arquivo de texto. Para realizar a fosforilação de 1,80 m de RNA, prepare uma solução em um tubo de microclamação de 0,6 microliters adicionando 33,5 microlitradores de água sem RNase, cinco microliters de solução A, seis microlitos de triphosfato de adenosina mililitro, um microlite de 200 micromolar RNA solução aquosa, e 4,5 microliters de polinucleotídeo quinase e misturar a solução suavemente.Incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius por 45 minutos colocando-a em um banho de água. Em seguida, inativando a enzima colocando o tubo de reação em um bloco de calor, pré-aquecido a 65 graus Celsius por 10 minutos. Permita que a solução esfrie até a temperatura ambiente para produzir uma solução final de RNA de 1,80m.Após a incubação, use 50 microliters desta solução, adicione cinco microliters de solução B e cinco microlitres de solução 1-femtomole de Xrn-1 para realizar hidrólise de RNA. Incubar o tubo de reação à temperatura ambiente por duas horas. Transfira essa mistura de reação para um dispositivo centrífugo do tamanho de um poro de 10 kilodalton e filtre as enzimas por centrifugação por 10 minutos a 700 vezes G.Transfira o filtrado em um tubo de centrífuga de 0,6 mililitro.Em seguida, adicione 20 microliters de água livre de RNase para lavar o RNA residual no tubo centrífugo, seguido de centrifugação. Por fim, combine este filtrado com o filtrado resultante obtido anteriormente por centrifugação em 10 kilodaltons pore-size centrífuga dispositivo, e congele a solução a zero graus Celsius ou navio para análise. Para desalar e concentrar a amostra, use dicas de pipeta C18 disponíveis comercialmente carregadas com uma cama de mídia cromatografia C18 no final.Para isso, posicione a ponta de pipeta de 10 microliter em uma pipeta de 10 microliter e lave essa ponta duas vezes com solução de nitrilho acetil aquoso de 50%. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado cada vez e equilibre a ponta C18 com 10 microliters de 0,1% de solução de ácido trifluoroacético aquoso duas vezes. Remova manualmente a ponta C18 da pipeta e fixe-a em uma pipeta de 200 microliter contendo uma ponta de pipeta P200.Em seguida, mergulhe a ponta C18 na solução resultante preparada durante a hidrólise de oligonucleotídeos de RNA pela Xrn-1 e aspire solte a solução através da ponta C18 10 vezes. Agora, retire a ponta C18 da pipeta P200, posicione-a até uma pipeta de 10 microliter e lave a ponta C18 usando uma solução aquosa de solução de ácido trifluoroacético de 0,1%. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.Lave a ponta C18 com 10 microliters água sem RNase duas vezes. Para detectar na placa MALDI, elute o oligonucleotídeo RNA da ponta C18, imergindo a amostra na matriz desejada e distribuindo a solução de volta para o tubo 10 vezes. Pipeta esta solução em dois pontos separados de um microliter cada um na placa e permitir que as manchas sequem.A concentração de RNA utilizada neste trabalho foi determinada através de espectroscopia UV-Visível registrada a 90 graus Celsius para evitar leituras errôneas decorrentes da formação potencial das estruturas secundárias. A sequência geral de eventos incluiu duas partes. Um, a eficiente fosforilação de 1,80m de RNA, evidenciada pelo aparecimento de apenas um pico correspondente ao produto esperado.E segundo, o fragmento de enrolação decorrente do tratamento da mistura amostral com Xrn-1. Os mesmos resultados foram obtidos por meio de uma sequência diferente que continha duas lesões oxidativas. As possíveis alterações a considerar incluem a eliminação do uso do dispositivo de filtragem ou a consideração de diferentes matrizes para a localização de MALDI.Por exemplo, ácido sinapéico ou ácido picolínico. Os fragmentos de RNA foram obtidos a partir de um processo enzimático. Este processo foi estabelecido por acoplamento MALDI, análise eletroforética, síntese em fase sólida e dicromaísmo circular.O protocolo descrito tem potencial para ser utilizado em diversas áreas, desde pesquisas nas ciências químicas até aplicações no campo biomédico.

identification-rna-fragments-resulting-from-enzymatic-degradation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve como quantificar o Mg (II) dependente da formação de RNA estrutura terciária através de dois métodos de pegada radical hidroxila.

Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por &quot;peroxidativo&quot; e &quot;oxidativo&quot; Footprinting Radical Hidroxila

Fluxos de trabalho de isótopos estáveis ​​de rotulagem...

Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando<sup&gt; 18</sup&gt; O-enriquecido Água

Medição de massa exata representa um passo importante durante a investigação de proteínas. De matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI) Espectrometria de massa (MS) pode ser utilizado para tal determinação e a sua principal vantagem é a tolerância para os sais, detergentes e contaminantes. Aqui, ilustramos uma abordagem acessível para a análise de proteínas maiores do que 100 kDa, por MALDI-MS.

Matrix-assisted laser dessorção / ionização Time of Flight (MALDI-TOF) espectrometria de massa Análise de proteínas intactas maior que 100 kDa

A espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) e as técnicas moleculares (sequenciamento do gene 16S rRNA) permitem a identificação de patógenos bacterianos raros em diagnósticos de rotina. O objetivo deste protocolo reside na combinação de ambas as técnicas, o que leva a dados mais precisos e confiáveis.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

Este artigo fornece um procedimento detalhado sobre a síntese em fase sólida, a purificação e a caracterização de dodecamers de ARN modificados na posição C2'- O . As análises fotométricas UV-vis e dicroísmo circular são usadas para quantificar e caracterizar aspectos estruturais, ou seja , de uma única linha ou de duas vertentes.

Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -tiofenilmetilo Modificação e Caracterização através do Dicroísmo Circular

Aqui nós apresentamos um protocolo para o clivagem dnazyme-dependente do RNA. Isto permite a análise rápida e local-dependente do RNA 2 '-O-methylation. Esta aproximação pode ser usada para a avaliação preliminar ou principal da atividade do snoRNA.

Análise DNAzyme-dependente de rRNA 2 '-O-methylation

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um método de sequenciamento baseado em LC-MS que pode ser usado como um método direto para sequenciar RNA curto (&lt;35 nt por execução) sem um intermediário de cDNA e como um método geral para sequenciar diferentes modificações de nucleotídeos em um único estudo com precisão de base única.

2D-HELS MS Seq: Um método geral baseado em LC-MS para sequenciamento direto e de novo de misturas de RNA com diferentes modificações de nucleotídeos

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

O protocolo fornece instruções para modificar o RNA com sulfato de dimetilo para experimentos de perfil mutacional. Inclui sondagem in vitro e in vivo com dois métodos alternativos de preparação de bibliotecas.

Sondando a estrutura do RNA com perfil mutacional de sulfato de dimetilo com sequenciamento in vitro e em células

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Aprenda a caracterizar fragmentos de RNA resultantes de degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Este método versátil permite análises com pequenas amostras e treinamento mínimo.

Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF

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