Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

Este protocolo descreve um método para visualização e quantificação in vivo e tridimensional das células marcadoras do nicho de células-tronco incisivas de camundongos. Esta técnica economiza tempo e é fácil de usar para novos alunos. As imagens 3D são adquiridas sem danificar o tecido.

A quantificação 3D torna os dados mais confiáveis e precisos. Para começar, disseque as mandíbulas. Fixar as amostras em paraformaldeído a 4% e mantê-las à temperatura ambiente durante a noite.

Após a incubação, remova os músculos das mandíbulas. Mergulhá-los em solução de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 molar para descalcificar por quatro dias com uma troca diária de meio em um agitador de 37 graus Celsius. Descolorir as mandíbulas em 15 mililitros de solução de 25% Quadrol em um agitador de 37 graus Celsius por um dia para remover o heme sanguíneo restante.

Para a coloração de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina, prepare um coquetel de rotulagem de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina, conforme mencionado no texto. Enxaguar as mandíbulas com um soro fisiológico tamponada com fosfato com Tween 20 ou PBST por 30 minutos em um agitador de 37 graus Celsius. Repetir o enxágue das mandíbulas com soro fisiológico tamponada com fosfato três vezes por três minutos cada, seguido de incubação em um coquetel recém-preparado com rotulagem de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina em uma coqueteleira durante a noite.

Repetir a lavagem com soro fisiológico tamponada com fosfato três vezes e realizar a deslipidação seriada colocando as mandíbulas nas soluções mencionadas no texto por seis horas cada em agitador de 37 graus Celsius. Desidratar as mandíbulas em solução de terc-butanol-polietilenoglicol, ou tB-PEG, por dois dias a 37 graus Celsius com a troca diária do meio. Após dois dias, limpar a mandíbula em meio de limpeza benzoato de benzila-polietilenoglicol contendo benzoato de benzila a 75%, metacrilato de polietilenoglicol-metil-éter médio de 500 ou PEG-MMA500 e quadro de 3% para obter correspondência do índice de refração e até que a transparência seja alcançada.

Monte a mandíbula inteira limpa de tecido em lâminas de cavidade de marca no meio de limpeza benzoato de benzila-polietilenoglicol e cubra-a com lâminas de cobertura de vidro. No software de imagem confocal, defina os parâmetros de aquisição de imagem desejados. No painel para excitação fluorescente, ative o laser necessário para excitar os fluoróforos de forma otimizada.

No painel para detecção de fluorescentes, mova o controle deslizante para selecionar os comprimentos de onda a serem medidos. Adicione uma gota de óleo de imersão com um índice de refração de 1,52 sobre a lamínula para corresponder ao índice de refração da tampa de vidro e da objetiva, e coloque a mandíbula montada no estágio do microscópio. Ligue as lâmpadas fluorescentes e escolha uma objetiva de ampliação apropriada para as regiões de interesse da imagem.

No modo live scan, identifique o campo de visão para visualizar toda a região da mandíbula nas dimensões X e Y. Defina os parâmetros de aquisição do estágio Z superior e inferior que cobrem com precisão o volume do nicho de células-tronco no incisivo de camundongos. Use um tamanho de passo Z de dois micrômetros ou conforme sua necessidade.

Adquira e salve arquivos de imagem Z-stack no formato lif. Use um conversor de arquivos de software de imagem para converter o arquivo de imagem Z-stack para o tipo de arquivo de formato nativo. No software de geração de imagens, clique no botão Arena e escolha Imagem.

Selecione o arquivo lif original e escolha o arquivo mesclado. As imagens serão importadas para o software de imagem. Clique duas vezes no arquivo importado para abrir o conjunto de dados da imagem.

No software de geração de imagens, visite o painel Ajuste de Vídeo. No painel Ajuste de Exibição, clique no nome do canal. Geralmente é rotulado como vermelho no modo padrão.

Na janela Propriedades da imagem, clique na guia Cor mapeada. Na opção Arquivo da guia Cor, escolha Fluxo de Fogo e clique em OK. Selecione a cor da tela para distinguir a fluorescência de fundo e a fluorescência positiva da amostra. No lado superior esquerdo da tela, no painel Propriedades da cena, clique no ícone azul denominado Adicionar nova superfície.

Desmarque o ícone Volume para remover a maior parte da fluorescência de fundo, resultando na fluorescência positiva nitidamente visível durante a segmentação manual. Em seguida, inicie a segmentação manual da região de interesse, ou ROI, clicando na guia Criar e selecionando a guia Ignorar criação automática, editar manualmente. No assistente de criação manual de superfície, clique na guia Contorno para escolher a orientação com base nas amostras para contornar o ROI facilmente.

Em seguida, verifique se o menu de ponteiro no canto direito está no modo Selecionar. Ajuste a posição do corte para localizar a ROI no tecido. Como mencionado anteriormente, a maioria das fluorescências de fundo já foi removida.

Clique no botão Desenhar e desenhe uma região de interesse provisória. Selecione a opção Visibilidade como Nenhum para evitar interferência de outras áreas além do ROI, seguido de segmentar a região de interesse fatia por fatia. Depois que o desenho do ROI for concluído, clique em Criar superfície para obter uma geometria 3D do ROI.

Clique no botão Editar no assistente de criação de superfície manual e selecione Mascarar tudo. Na janela pop-out Canal de máscara, selecione Canal 1 nas opções de Seleção de canal. Depois, selecione Canal duplicado antes de aplicar a máscara.

Nas configurações da máscara, selecione Constante dentro/fora e defina a superfície externa do voxel como zero. No painel Propriedades da cena, desmarque o objeto Surface e selecione o objeto Volume. No Ajuste de Vídeo, desmarque o canal vermelho original e selecione o canal vermelho mascarado.

E ajuste as intensidades de cor para obter o ROI de fluorescência renderizado em 3D e rotulado positivamente desejado. Crie um novo objeto spot clicando no ícone Pontos para quantificar as células de retenção de rótulo renderizadas em 3D, criando pontos 3D que se sobrepõem comparativamente às células de retenção de rótulo renderizadas em 3D. Use as setas inferiores para mover-se entre as etapas no assistente de criação de ponto.

Clique no botão Concluir e selecione o botão Estatística. Em seguida, selecione a guia Geral para localizar o valor do número total de pontos na imagem. Após marcação com 5-etinil-2-prime-desoxiuridina e o processo de limpeza tecidual do sistema solvente associado ao polietilenoglicol, obteve-se a mandíbula transparente.

A amostra modificada foi comparada com uma mandíbula normal sem processo de limpeza tecidual, e uma mandíbula transparente com marcação com 5-etinil-2-prime-desoxiuridina foi submetida a imagens confocais. A seção óptica do incisivo mostrou células retentoras de marcação no nicho de células-tronco do ápice do incisivo no plano XY. A construção da imagem 3D de um ápice incisivo mostrou células-tronco quiescentes com retenção de marcação positiva para 5-etinil-2-prime-desoxiuridina tanto no nicho de células-tronco epiteliais quanto mesenquimais.

As células positivas para 5-etinil-2-prime-desoxiuridina foram transferidas para pontos para quantificação que se sobrepunham comparativamente às células mesenquimais retentoras de marcação. As manchas criadas apenas para células retentoras de marcação mesenquimal e apenas para células retentoras de marcação epitelial são visíveis na imagem. A quantificação das células epitélias e mesenquimais retentoras também foi realizada.

As propriedades de processamento e clareamento são as etapas mais importantes e devem ser otimizadas de acordo com o uso do tecido para obtenção de resultados satisfatórios. Este método também pode ser modificado para visualizar LRCs em nível de S2VGFP e no rastreamento de linhagens celulares para obter detalhes sobre a localização da progênie e sua quantificação ou contribuições.