Name: Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda a integrar organoides intestinais derivados de biópsia com tecnologia organ-on-a-chip para criar uma plataforma microfisiológica que emula a funcionalidade do intestino humano.

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Agradecemos ao Professor Mark Donowitz por fornecer os organoides derivados da biópsia intestinal e Brett Clair por projetar as ilustrações científicas do chip, módulo portátil e cultural. Todas as outras ilustrações científicas foram geradas usando o BioRender.

<ol><li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors%3A+An+intra-subject+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li>
<li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+Differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caco-2+cell+monolayer%3A+Usefulness+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%E2%80%99s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology+%28Australia%29%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li>
<li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761(2013).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135(2020).</li>
<li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li>
<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li>
<li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43(2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li>
<li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+motility%3A+From+bench+side+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Morgan+%26+Claypool+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).</li>
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<li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106(2021).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li>
</ol>

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi e Magdalena Kasendra são atuais ou ex-funcionários da Emulate Inc. e podem deter capital próprio. A Emulate Inc. é a empresa que fabrica os dispositivos de chip de órgão e publicou patentes relevantes para o trabalho declarado neste artigo.

A combinação de tecnologia organ-on-a-chip e organoides intestinais promete modelagem precisa da fisiologia intestinal humana e da fisiopatologia. Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo simples e robusto (delineado na Figura 1) para o estabelecimento do chip intestinal contendo epitélio intestinal pequeno ou colonico derivado da biópsia e células endoteliais microvasculares intestinais co-cultivadas em um dispositivo microfluido. Esta simulação baseada em chip do intestino humano incorp...

O intestino humano é um órgão complexo e multitarefa capaz de auto-regeneração. É dividido em intestino delgado e grande. A função primária do intestino delgado é digerir ainda mais os alimentos provenientes do estômago, absorver todos os nutrientes e passar o resíduo para o intestino grosso, que recupera a água e os eletrólitos. O intestino delgado é ainda dividido em múltiplas regiões anatomicamente distintas: o duodeno, jejunum e íleo, cada um dos quais é adaptado para executar funções específicas. Por exemplo, o duodeno ajuda a quebrar o chyme (conteúdo estomacal) para permitir a absorção adequada de nutrientes envolvendo proteínas, carboidratos, vitaminas e minerais no jejunum. Esta parte proximal do intestino delgado também é o principal local de absorção e metabolismo de drogas intestinais, e é caracterizada pela maior expressão de enzimas metabolizadoras de drogas (por exemplo, CYP3A4) em comparação com sua expressão no íleo e cólon1. Além de seu papel principal na digestão e absorção de nutrientes, o intestino também é uma barreira eficaz contra conteúdos luminosos potencialmente prejudiciais, como microrganismos patogênicos, metabólitos microbianos, antígenos dietéticos e toxinas 2,3. Vale ressaltar que o cólon humano é habitado por um grande número de microrganismos, muito superior ao total de células do corpo humano, que proporcionam muitos benefícios à nutrição, metabolismo e imunidade. Portanto, a manutenção da integridade da barreira mucosa formada pelas células epiteliais intestinais é fundamental para permitir a relação simbiótica entre a microbiota intestinal e as células hospedeiras, separando-as fisicamente para evitar a ativação desnecessária das células imunes2. Além disso, a morte celular intestinal programada desempenha um papel essencial como um mecanismo de autoproteção que impede que as células infectadas persistam ou se proliferem — assim, disseminando potenciais patógenos3 — enquanto a auto-renovação contínua do epitélio intestinal a cada quatro ou sete dias compensa a perda celular que garante a integridade da barreira e a homeostase tecidual. Os prejuízos das funções intestinais descritas, incluindo absorção de nutrientes, integridade da barreira ou desequilíbrio na morte celular intestinal e autocon renovação, podem resultar no desenvolvimento de uma série de distúrbios gastrointestinais, incluindo desnutrição e doença inflamatória intestinal (DII)2,3.
Anteriormente, modelos animais e linhas de células intestinais derivadas do câncer foram utilizadas para estudar as funções fisiológicas e fisiodicosiológicas do tecido intestinal humano. No entanto, preocupações cada vez mais proeminentes sobre a tradução da pesquisa animal para os seres humanos, causada pela presença de disparidades significativas entre as duas espécies, destacaram a necessidade de métodos alternativos relevantes para o serhumano 4. As linhas de células intestinais in vitro comumente usadas incluem células T84, Caco-2 e HT29. Enquanto imitam certos aspectos da função da barreira intestinal e do transporte de membranas, eles são caracterizados por uma expressão alterada de enzimas metabolizantes de drogas5, receptores superficiais e transportadores4. Além disso, não possuem especificidade do segmento intestinal e não conseguem recapitular a complexidade do epitélio intestinal, com cada modelo contendo apenas um dos cinco tipos de células epiteliais presentes no intestino6.
Recentemente, culturas organoides intestinais humanas estabelecidas a partir de biópsias frescas do intestino delgado e do cólon 7,8 ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)9 foram introduzidas como modelos experimentais alternativos com potencial para complementar, reduzir e talvez substituir a experimentação animal no futuro. Embora os iPSCs possam ser obtidos de forma não invasiva, estabelecer organoides a partir de iPSCs requer o uso de protocolos complexos e demorados (com várias etapas experimentais) e gera culturas semelhantes ao tecido fetal humano. Em contraste, organoides derivados da biópsia são altamente escaláveis, pois podem aproveitar a capacidade de renovação inerente do tecido intestinal e podem ser indefinidamente passagemdos e propagados in vitro. É importante ressaltar que os organoides derivados da biópsia mantêm a doença e as características específicas da região intestinal do tecido primário do qual foram desenvolvidos e emulam a diversidade celular do epitélio intestinal. Organoides podem ser usados como avatares específicos do paciente in vitro para desvendar a biologia e a patogênese de vários distúrbios gastrointestinais e melhorar seu manejo terapêutico. Embora os organoides intestinais tenham alcançado um grau impressionante de funcionalidade fisiológica, eles ainda não conseguem reproduzir a complexidade dos órgãos nativos devido à falta de componentes estrômicos críticos — incluindo vasos sanguíneos, tecido conjuntivo, nervos periféricos e células imunes — bem como estimulação mecânica. Parâmetros mecânicos, como fluxo, estresse de cisalhamento, estiramento e pressão, são conhecidos por influenciar morfênese tecidual e homeostase in vivo e foram previamente mostrados para melhorar a maturação de células in vitro 10,11,12,13. Uma desvantagem importante adicional dos sistemas organoides é a inacessibilidade do lúmen e, portanto, para o lado apical do epitélio. Isso representa um desafio para investigar vários mecanismos associados à expressão polarizada de transportadores de íons e medicamentos, interações hospedeiro-microbioma e testes de toxicidade farmacêutica. Por fim, as culturas organoides sofrem de considerável variabilidade no tamanho, morfologia e função, devido à natureza estocástica do processo de auto-organização in vitro e escolhas de destino celular. Portanto, para perceber todo o potencial dos organoides intestinais na modelagem da doença, rastreamento de medicamentos e medicina regenerativa, é necessário explorar novas estratégias que reduzam a variabilidade no desenvolvimento organoide, melhorem o acesso ao compartimento luminal e incorporem interações células-células ausentes.
A tecnologia Organ-on-a-Chip introduziu muitas técnicas para a incorporação de forças mecânicas e fluxo de fluidos para culturas de células intestinais in vitro. No entanto, como a maioria dos estudos iniciais de prova de conceito tem usado linhas celulares derivadas do câncer que não apresentaram diversidade celular suficiente, a relevância desses sistemas tem sido questionada. Recentemente, combinamos sinergicamente organoides intestinais e tecnologia organ-on-a-chip para incorporar as melhores características de cada abordagem em um sistema in vitro 14,15,16. O intestino-chip resultante recapitula a arquitetura multicelular do epitélio intestinal, a presença da interface do tecido epitelial-endotelial, e as forças mecânicas de fluxo e estiramento de fluidos, permitindo a emulação das funções de nível de órgão in vitro. Além disso, o uso de organoides derivados do tecido primário (que podem ser amostrados de diferentes regiões do intestino humano) como material inicial aumenta a versatilidade deste modelo, pois chips representando duodeno humano, jejunum, ileum e cólon podem ser estabelecidos após procedimentos semelhantes de semeadura e cultura. É importante ressaltar que os intestino-chips permitem a avaliação em tempo real da integridade da barreira intestinal; atividade da borda da escova e enzimas de metabolismo de drogas; produção de mucinas; secreção de citocinas; e interação de células intestinais com microrganismos patogênicos e commensais, como demonstrado nos relatórios publicados anteriormente. Notavelmente, quando os chips do intestino foram estabelecidos utilizando organoides gerados a partir do tecido de diferentes indivíduos, esses modelos capturaram a variabilidade inter-doadora esperada nas respostas funcionais a vários medicamentos e tratamentos. Ao todo, a fusão de organoides com a tecnologia Organ-on-a-Chip abre as portas para modelos mais avançados, personalizados e relevantes que possam melhorar a relevância fisiológica e a precisão dos achados in vitro, bem como sua extrapolação para os seres humanos. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para o estabelecimento do chip intestinal e sua aplicação nos estudos das funções fisiológicas dos dois segmentos intestinais: duodeno e cólon. Em primeiro lugar, são descritos os métodos para avaliar a atividade da enzima metabolizadora cyp3A4 no chip duodeno, bem como sua indução por compostos prototípicos como rifampicina e vitamina D3. Em segundo lugar, as etapas necessárias para modelar o "intestino vazão" no chip de cólon são descritas no protocolo, com a interrupção da barreira epitelial sendo realizada usando citocinas marcantes implicadas na patogênese do IBD. Resumidamente, organoides derivados de biópsias humanas são propagados in vitro, submetidos à digestão enzimática, e introduzidos no canal superior do chip. Na presença de perfusão contínua com mídia enriquecida com fator de crescimento, eles se desenvolvem em uma monocamada epitelial confluente com arquitetura 3D e uma superfície celular apical facilmente acessível. O compartimento de chip "vascular" inferior é semeado com células endoteliais microvasculares isoladas do intestino delgado ou grande. O epitélio e o endotélio são separados por uma membrana porosa elástica, que facilita as interações paracrinas entre os dois tecidos e, quando submetidas a deformações cíclicas, emula movimentos semelhantes à peristalse do intestino humano. A cocultura é mantida sob as condições dinâmicas de fluxo geradas pela perfusão luminal e vascular com meios de cultura celular adequados. Finalmente, descrevemos inúmeros tipos de ensaios e análises de ponto final que podem ser realizadas diretamente no chip ou a partir de efluentes de cultura celular amostrada.

<table><tbody><tr><td>intestino delgado Células endoteliais microvasculares intestinais humanas</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE15</td><td>0,5 células M/ml ; cólon criopreservado</td></tr><tr><td>Células endoteliais microvasculares intestinais humanas</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE16</td><td>0,5 células M/ml ;</td></tr><tr><td>organoides duodenais humanos derivados de biópsia criopreservada</td><td>Universidade de John Hopkin</td><td>-</td><td>Os organoides foram fornecidos pelo professor Mark Donowitz (número do Conselho de Revisão Institucional: NA_00038329).</td></tr><tr><td>Organoides colônicos humanos derivados de biópsia</td><td>Universidade de John Hopkin-Os</td><td></td> <td>organoides foram fornecidos pelo professor Mark Donowitz (número do Conselho de Revisão Institucional: NA_00038329).</td></tr><tr><td>Zo&euml; CM-1 e comércio; &nbsp; Módulo de Cultura</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Módulo de cultura</td></tr><tr><td>Orb-HM1&trade; &nbsp; Emular Módulo de Hub</td><td>Inc.</td><td>-</td><td>5% de CO2, estiramento a vácuo e fonte de alimentação</td></tr><tr><td>Chip-S1&trade; Emulador de Chip Esticável</td><td>&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Cápsula de Organ-Chip</td></tr><tr><td>&trade; Módulos portáteis</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Módulo portátil</td></tr><tr><td>UV Light Box</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Chip Cradle</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>1 por prato de cultura quadrado</td></tr><tr><td>Filtros Steriflip&reg;-HV EMD</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>0.45&nbsp; &mu; m&nbsp; Filtro PVDF</td></tr><tr><td>Prato Quadrado para Cultura de Células (120 x 120 mm)</td><td>VWR</td><td>82051-068-Handheld</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; aspirador&nbsp; aspirador</td><td>Corning</td><td>4930</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Aspiração&nbsp; pipetas</td><td>Corning / Falcon</td><td>357558</td><td>2 mL,&nbsp; poliestireno, individualmente Pontas de</td></tr><tr><td>aspiração</td> embrulhadas<td>&nbsp;-</td><td></td><td>Estéril (autoclavado)</td></tr><tr><td>Sorológico&nbsp; pipetas</td><td></td><td>&nbsp;-</td><td>2 mL, 5 mL,&nbsp; 10 mL,&nbsp; e&nbsp; 25 mL&nbsp; Pipeta de baixa endotoxina, estéril</td></tr><tr><td>P20</td>, P200,&nbsp;<td></td><td></td><td> P1000&nbsp; e pipeta multicanal padrão</td></tr><tr><td>&nbsp; dicas&nbsp;</td><td></td><td></td><td>P20, P200,&nbsp; e&nbsp; Pág. 1000.</td></tr><tr><td>Tubos cônicos&nbsp;( Proteína&nbsp; LoBind&reg; Tubos)</td><td>Eppendorf</td><td>0030122216; &nbsp; 0030122240</td><td>Tubos de 15 mL, 50 mL</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Tubos&reg; &nbsp; lo-bind</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td>tubos de 1,5 mL</td></tr><tr><td>96 poços placa de parede preta</td> <td>-</td><td></td> <td>para análise de permeabilidade epitelial</td></tr><tr><td>Microscópio (com câmera)</td> <td>-</td><td></td> <td>Para campo claro&nbsp; imagem</td></tr><tr><td>Banho-maria (ou contas)</td> <td>-</td><td></td> <td>Definido para 37&deg; C</td></tr><tr><td>Configuração de vácuo</td><td>&nbsp;-</td><td>-</td><td>Mínimo&nbsp; pressão: -70 kPa</td></tr><tr><td>Frascos</td> de <td>biotium</td><td>220033</td><td></td></tr><tr><td>T75 Frascos</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td>Frasco de cultura de células</td></tr><tr><td>Emular reagente-1&nbsp;( ER-1)</td> <td>Emular Inc.</td><td>-</td><td>Solução de revestimento de chip</td></tr><tr><td>Emulate Reagent-2( ER-2)</td> <td>Emular Inc.</td><td>-</td><td>Solução de revestimento de cavacos</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS&nbsp; (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>1X</td></tr><tr><td>Grau de Cultura de Células Água</td><td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td></td></tr><tr><td>Azul Trypan</td><td>Sigma</td><td>93595</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>TryplE&nbsp; Express</td><td>ThermoFisher&nbsp; Organoides</td><td>12604013</td><td>Científicos&nbsp; dissociação&nbsp; e células do endotélio&nbsp; destacamento&nbsp; solução</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher&nbsp; Científico</td><td>12634028</td><td>Médio</td></tr><tr><td>IntestiCult&trade; Meio de Crescimento Organoide (Humano)</td><td>Tecnologias de Células-Tronco</td><td>06010</td><td>Meio de Crescimento Organoide</td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Endoteliais MV 2</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>Meio Endotelial</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Soro</td></tr><tr><td>Primocin&trade; &nbsp;</td><td>Agente antimicrobiano</td> <td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-1</td></tr><tr><td>Fator de Fixação&trade;</td>Solução de revestimento <td>Cell Systems</td><td>4Z0-210</td><td>para frasco</td></tr><tr><td>Matrigel - Fator de Crescimento Reduzido</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matriz de membrana basal solubilizada</td></tr><tr><td>Colágeno IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Componente ECM</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>componente ECM</td></tr><tr><td>Y-27632 Tecnologias de</td><td>células-tronco</td><td>72304</td><td>suplemento de mídia organoide</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-10</td><td>suplemento de mídia organoide</td></tr><tr><td>Solução de recuperação celular</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A9576</td><td>30%,</td></tr><tr><td>Grau de cultura de células</td> estéril Água <td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td>Estéril, Água</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>solvente</td></tr><tr><td>3KDa Dextran Cascade Blue</td><td>Invitrogen</td><td>D7132</td><td>10 mg em pó</td></tr><tr><td>Rifampicina (RIF)</td><td>Sigma</td><td>Cat# R3501</td><td>Indutor de CYP</td></tr><tr><td>Hidrato de testosterona</td><td>Sigma</td><td>T1500</td><td>Substrato CYP</td></tr><tr><td>1,25-di-hidroxi Vitamina D3 (VD3)</td><td>Sigma</td><td>Cat# D1530</td><td>Indutor de CYP</td></tr><tr><td>Acetonitrila com 0,1% (v/v) de ácido fórmico</td><td>Sigma</td><td>159002</td><td>Solução de parada</td></tr><tr><td>LCMS IFN e gama;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído (PFA)</td><td>EMS</td><td>157-4</td><td>Fixativo</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Burro Normal (NDS)</td><td>Sigma</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>anti-Oclusina</td><td>ThermoFisher&nbsp; Marcador de</td><td>junções apertadas</td>Scientific <td>33-1500</td></tr><tr><td>anti-Claudin 4</td><td>ThermoFisher&nbsp; Marcador de</td><td>junções apertadas</td>Scientific <td>36-4800</td></tr><tr><td>anti-E-caderina</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td> marcador de <td>junções de aderentes epiteliais</td></tr><tr><td>anti-VE-caderina</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>marcador de junções aderentes endoteliais</td></tr><tr><td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td><td>Thermo Fischer</td><td>339194</td><td>marcador de junções apertadas</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>62248</td><td>mancha nuclear</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183020</td><td>kit de lise, isolamento e purificação de RNA</td></tr><tr><td>SuperScript&trade; IV VILO&trade; Kit de</td><td>transcriptase reversa</td>Master Mix <td>Invitrogen</td><td>11756050</td></tr><tr><td>TaqMan&trade; Fast Advanced Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444557</td><td>reagente qPCR</td></tr><tr><td>QuantStudio&trade; 5 Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28573</td><td>Ciclador de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>18S primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999901_s1</td><td>Eukaryotic 18S rRNA</td></tr><tr><td>CYP3A4 primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00604506_m1</td><td>Citocromo&nbsp; família 3 subfamília A membro 4</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Kit de ensaio Coomassie Plus (Bradford)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23236</td><td>Kit de quantificação de proteínas</td></tr><tr><td>Tampão de lise MSD Tris</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R60TX-3</td><td>Tampão de lise de proteína</td></tr><tr><td>Cleaved/Total Caspase-3 Kit de lisado de células inteiras</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15140D</td><td>Kit de detecção de caspase 3</td></tr><tr><td>Painel de lesões vasculares V-PLEX 2 Kit humano</td><td>Meso Scale</td><td>Diagnostics K15198D</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Painel Pró-inflamatório Humano II (4-Plex)</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15053D</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td> <td>Microscópio Zeiss-Confocal</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td><td>Zeiss-20X</td><td></td> <td>lentes objetivas de longa distância</td></tr><tr><td>Zeiss AXIOvert.A1</td><td>Zeiss-Microscópio</td> <td>de</td> <td>campo claro</td></tr><tr><td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td><td>Lentes objetivas Zeiss-10X</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

A mucosa intestinal é uma barreira física e bioquímica complexa que cumpre uma miríade de funções importantes. Permite o transporte, absorção e metabolismo de nutrientes e xenobióticos, facilitando uma relação simbiótica com a microbiota e restringindo a invasão de microrganismos. A interação funcional entre vários tipos celulares e seu ambiente físico e bioquímico é vital para estabelecer e manter a homeostase do tecido intestinal. Modelar essas interações complexas e a fisiologia intestinal integrada in vitro é um objetivo formidável com o potencial de transformar a forma como novos alvos terapêuticos e candidatos a medicamentos são descobertos e desenvolvidos.
Organoides e tecnologias organoides e organ-on-a-chip foram recentemente combinados para gerar chips intestinais relevantes para o homem adequados para estudar os aspectos funcionais da fisiologia intestinal e da fisiopatologia in vitro. Organoides derivados das biópsias do intestino delgado (duodeno) e intestino grosso são semeados no compartimento superior de um chip de órgão e, em seguida, expandem com sucesso como monocamadas, preservando as características celulares, moleculares e funcionais distintas de cada região intestinal. Células microvasculares microvasculares específicas do intestino humano são incorporadas no compartimento inferior do chip de órgão para recriar a interface epitelial-endotelial. Esta nova plataforma facilita a exposição luminal a nutrientes, drogas e microrganismos, permitindo estudos de transporte intestinal, permeabilidade e interações hospedeiro-micróbio.
Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para o estabelecimento de chips de intestino representando o duodeno humano (chip duodeno) e cólon (chip de cólon), e sua cultura subsequente sob fluxo contínuo e deformações semelhantes à peristalse. Demonstramos métodos para avaliar o metabolismo de drogas e indução CYP3A4 no chip duodeno usando indutores e substratos prototípicos. Por fim, fornecemos um procedimento passo-a-passo para a modelagem in vitro de interferon gama (IFNγ)-mediado ruptura de barreira (síndrome do intestino vazado) em um chip de cólon, incluindo métodos para avaliar a alteração da permeabilidade paracelular, alterações na secreção de citocinas e perfil transcriômico das células dentro do chip.

A Figura 1D resume a linha do tempo da cultura do chip intestinal e ilustra as células endoteliais intestinais e organoides antes e depois de semear o chip. Além disso, demonstra as distintas diferenças morfológicas entre o duodeno e os chips de cólon, destacados pela presença das formações semelhantes a villi no chip duodeno e representativa da pequena arquitetura intestinal.
Figura 3A,B demonstram as respostas de in...

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Este protocolo mostra como usar organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologia organ-on-a-chip para gerar um chip intestinal fisiologicamente relevante que pode então ser usado para prever farmacocinéticas e interação droga-droga e para estudar disfunção da barreira epitelial intestinal. A união de organoides na tecnologia organ-on-a-chip nos permite reproduzir a complexidade do epitélio intestinal. Além disso, permite maior controle experimental das pistas mecânicas, distribuição de fluxo e gradientes bioquímicos.Este método emula a complexa fisiologia do intestino humano, dando uma maior compreensão da base celular e molecular das funções pertestinais normais e patológicas. Isso ajuda a prever melhor a farmacocinética e a farmacodinâmica e potenciais candidatos a medicamentos para evitar danos inflamatórios. A semeadura é um passo crítico no protocolo.A fragmentação excessiva ou a densidade de semeadura imprecisa dos fragmentos organoides intestinais podem comprometer o desenvolvimento e a diferenciação da barreira epitelial. Para começar, aspire o meio da cultura organoide estática. Recuperar a mídia de poços suficientes para alcançar uma densidade final de semeadura d

combining-human-organoids-organ-on-chip-technology-to-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo permite a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais. O protocolo mimetiza o desenvolvimento humano normal, diferenciando as células em uma população de endoderme definitivo, endoderme do intestino posterior e, em seguida, epitélio intestinal. Isso torna o protocolo adequado para estudar tanto o desenvolvimento intestinal quanto aplicações de modelagem de doenças.

Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

neuroHuMiX é um modelo avançado de gut-on-a-chip para estudar as interações de células bacterianas, epiteliais e neuronais sob condições de co-cultura proximal e representativa. Este modelo permite desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à comunicação entre o microbioma intestinal e o sistema nervoso.

Um modelo Gut-on-a-Chip para estudar o eixo microbioma intestinal-sistema nervoso

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides intestinais de ratos e usá-los em várias aplicações a jusante. Os ratos são frequentemente um modelo pré-clínico preferido, e o robusto sistema organoide intestinal preenche a necessidade de um sistema in vitro para acompanhar os estudos in vivo .

Geração e Manipulação de Organoides Intestinais em Rato

Este protocolo descreve um modelo in vitro de enterocolite necrosante (ECN), que pode ser usado para estudos mecanísticos da patogênese da doença. Apresenta um chip microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados do intestino neonatal humano, células endoteliais e o microbioma intestinal de um neonato com ECN grave.

Modelo Microfluídico de Enterocolite Necrosante Incorporando Enteróides Intestinais Neonatais Humanos e um Microbioma Disbiótico

A integração de organoides intestinais caninos e um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip oferece modelos translacionais relevantes para doenças intestinais humanas. Os protocolos apresentados permitem a morfogênese 3D e a modelagem dinâmica in vitro do intestino, auxiliando no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças intestinais em cães e humanos com o One Health.

Morfogênese Tridimensional em Intestino Canino Utilizando Organoides Intestinais Derivados de Pacientes com Doença Inflamatória Intestinal

Nosso protocolo detalhado descreve a criação e o uso do modelo avançado de intestino em chip, que simula a mucosa intestinal humana com estruturas 3D e vários tipos de células, permitindo uma análise aprofundada das respostas imunes e funções celulares em resposta à colonização microbiana.

Modelo Intestino em Chip Imunocompetente para Análise das Respostas Imunes da Mucosa Intestinal

O protocolo combina a tecnologia organoide intestinal humana com análise transcriptômica de célula única para fornecer informações significativas sobre a biologia intestinal anteriormente inexplorada.

Usando organoides intestinais humanos para entender o epitélio do intestino delgado no nível transcricional de uma única célula

Os organoides intestinais humanos devem ser inervados para melhor recapitular a estrutura e a função do intestino humano nativo. Aqui, apresentamos um método para incorporar um sistema nervoso entérico a essas construções.

Inervação de organoides intestinais humanos

Aprenda a integrar organoides intestinais derivados de biópsia com tecnologia organ-on-a-chip para criar uma plataforma microfisiológica que emula a funcionalidade do intestino humano.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

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