Utilizando Baixa Tensão de Oxigênio para Reduzir Células Hematopoiéticas em Culturas de Células Estromais da Medula Óssea Murina

Resumo

Uma cultura rotineira de células estromais da medula óssea (BMSCs) leva ao isolamento de populações de células heterogêneas, sendo muitas células de origem hematopoiética. Aqui, descrevemos um método que utiliza baixa tensão de oxigênio para reduzir significativamente os contaminantes hematopoiéticos em culturas murinas de BMSC.

Resumo

Atualmente, ainda há uma falta de marcadores universalmente aceitos para isolar prospectivamente uma população homogênea de células-tronco esqueléticas (SSCs). Por esse motivo, as BMSCs, que suportam a hematopoiese e contribuem para todas as funções do esqueleto, continuam a ser amplamente utilizadas para estudar progenitores mesenquimais multipotentes (MMPs) e inferir a função das SSC. Além disso, dada a amplitude dos modelos murinos transgênicos usados para estudar doenças musculoesqueléticas, o uso de BMSCs também serve como uma ferramenta poderosa para examinar os mecanismos moleculares que regulam MMPs e SSCs. No entanto, procedimentos comuns de isolamento para BMSCs murinas resultam em mais de 50% das células recuperadas sendo de origem hematopoiética, potencialmente dificultando a interpretação dos dados gerados durante esses estudos. Aqui, descrevemos um método usando baixa tensão de oxigênio ou hipóxia para a eliminação seletiva de células CD45⁺ em culturas de BMSC. É importante ressaltar que esse método pode ser facilmente implementado não apenas para reduzir os contaminantes hemopoiéticos, mas também para aumentar a porcentagem de MMPs e SSCs putativos em culturas de BMSC.

Introdução

Semelhante às células-tronco hematopoiéticas (HSCs), as SSCs estão alojadas no microambiente ósseo; no entanto, ao contrário das HSCs, atualmente há uma falta de marcadores de superfície celular universalmente aceitos que possam ser usados para identificar prospectivamente as SSCs ^1,2,3. No entanto, sistemas de cultura in vitro e ensaios de reconstituição in vivo demonstram que uma proporção de BMSCs tem a capacidade de suportar a hematopoiese, bem como a capacidade de se diferenciar em todas as células das linhagens mesenqu....

Protocolo

Todos os métodos descritos utilizando modelos murinos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (A187-19-08).

1. Dissecção dos ossos dos membros posteriores

1. Eutanasiar camundongos C57BL/6 machos ou fêmeas de 10 a 12 semanas de idade por asfixia por CO₂ usando uma taxa de fluxo de 2-4 L/min seguida de confirmação de morte por decapitação. Camundongos fêmeas ou machos podem ser usados neste ensaio sem diferenças esperadas nos resultados. Pulverize o pelo com etanol 70%.
2. Use pinças ....

Resultados

Após 7 dias de isolamento celular, as células cultivadas a 21% de oxigênio são altamente heterogêneas. Especificamente, há uma grande variação de tamanho, com células bipolares maiores interespaçadas com células menores contendo múltiplas saliências (Figura 1A). Em contraste, as células cultivadas em condições hipóxicas são altamente homogêneas. As células dentro das colônias são relativamente semelhantes em tamanho e têm uma aparência bipolar, assemelhando-se a outras células de origem mese.......

Discussão

Com base em nossas observações, as BMSCs aderem ao plástico de cultura de tecidos mais cedo do que os macrófagos e outras células de origem hemopoiética¹¹. Por esse motivo, enxaguar as placas 3 h após o plaqueamento é uma etapa crítica, pois remove as células hematopoiéticas flutuantes que têm o potencial de se ligar a pontos de tempo posteriores. Além disso, esses enxágues devem ser feitos com cuidado, especificamente pipetando o meio na lateral do prato para evi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100mm2 placas de cultura de tecidos	Corning	353003
1x Phosphate Buffred Saline (PBS)	Gibco	100010-023
Hemocitômetro Bright-Line	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (EUA), Caracterizou	GE Healthcare Life Ciências	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosídeos	Gibco	12571-063
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Tampão de lise de glóbulos vermelhos Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  frascos de cultura de tecidos	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Gibco	25200-056

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