Name: Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Descubra como o sódio atua como segundo mensageiro na diferenciação de piscinas de ubiquinol mitocondrial. Este protocolo simplificado utiliza espectrofotometria com NADH e succinato para estudar transferência de elétrons.

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Agradecemos ao Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez pela assistência técnica. Este estudo foi apoiado pelo MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). O CNIC conta com o apoio do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), do Ministério da Ciencia, da Innovación e das Universidades (MCNU) e da Fundação Pró CNIC e do Centro de Excelência Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figura 2 criada com BioRender.com.

Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo comitê de ética institucional do Centro Nacional de Investigações Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Espanha, de acordo com a Diretiva da União Europeia de 22 de setembro de 2010 (2010/63/UE) e com o Decreto Real Espanhol de 1 de fevereiro de 2013 (53/2013). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento.
NOTA: Este ensaio comparativo para estudar a segmentação de piscinas de CoQ mitocondrial é descrito da seguinte forma:
1. Quantificação de proteínas
<ol><li>Congele e descongele as mitocôndrias isoladas26 de um fígado de camundongo tipo selvagem três vezes (ou seja, membranas mitocondriais) antes da experimentação para tornar as organelas permeáveis aos substratos de reação.</li>
	<li>Quantifique a quantidade proteica da amostra isolada de mitocôndrias pelos métodos de Bradford ou ácido bicinchonínico (BCA). No caso de Bradford, adicione 2 μL de amostra em 1 mL de reagente 1x Bradford.</li>
	<li>Divida a amostra em quatro subsampleas de 20 μg cada (a: A, B, C, D; Figura 2A).</li>
</ol>2. Medição da atividade CI+CIII
NOTA: Esta parte do protocolo utiliza as amostras A e B para medir a atividade CI+CIII (Figura 2B).
<ol><li>Divida as amostras A e B em duas subamostras de 10 μg cada (a1, A2, B1 e B2). Misture cada uma das subamplegas em um cuvette de 1 mL com 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 10 μL de malonato de 100 mM e adicione tampão C1/C2 pré-aquecido (Tabela 1) a 37 °C até 980 μL (979 μL para cuvettes A2 e B2). ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso dos reagentes tóxicos malonato e cianeto de potássio. NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve ser preparado fresco misturando 10 mg de cit c em 1 mL de 10 mM K2HPO4 solução, pH ajustado para 7,2, e deve ser mantido em gelo durante todo o experimento.</li>
	<li>Adicione 10 μL de 1 M KCl nas cuvetas A1 e A2, e adicione 10 μL de 1 M NaCl nas cuvetas B1 e B2.</li>
	<li>Adicione 1 μL de rotenona de 1 mM na cuvette contendo subsames A2 e B2. ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso do reagente tóxico rotenona.</li>
	<li>Logo antes da medição, adicione 10 μL de NADH (10 mM) em todas as cuvetas. NOTA: O 10 μL é de preferência adicionado no degrau da cuvette, de modo que a reação começa após a mistura.</li>
	<li>Misture a cuvette girando-a cuidadosamente três vezes. Coloque-o no leitor de cuvette de absorção (espectrofotômetro UV/VISJASCO).</li>
	<li>Clique em Measure > Parâmetros > Geral e defina os parâmetros de medição em Comprimento de Onda: 550 nm e Tempo: 4 minutos de leitura; pressione os botões Aceitar e Iniciar para iniciar o experimento.</li>
	<li>No final da medição, salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvância clicando em Arquivo e Salve As. A inclinação também pode ser coletada manualmente.</li>
</ol>3. Medindo a atividade CII+CIII
NOTA: Esta parte do protocolo utiliza as amostras C e D para medir a atividade CII+CIII (Figura 2C).
<ol><li>Divida as amostras C e D em duas subamostras de 10 μg cada (ou seja, C1, C2, D1 e D2). Misture cada uma das subamplenas em um cuvette de 1 mL com 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 1 μL de rotenona de 1 mM e adicione o tampão C1/C2 pré-aquecido a 37 °C até 980 μL (970 μL para cuvettes C2 e D2). ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso dos reagentes tóxicos cianeto de potássio e rotenona. NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve ser preparado fresco misturando 10 mg de cit c em 1 mL de 10 mM K2HPO4 solução, pH ajustado para 7,2, e deve ser mantido em gelo durante todo o experimento.</li>
	<li>Adicione 10 μL de 1 M KCl nas cuvetas C1 e C2, e adicione 10 μL de 1 M NaCl nas cuvetas D1 e D2.</li>
	<li>Adicione 1 μL de 1 mM de antimicina A na cuvette contendo subsames C2 e D2. ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso da antimicina de reagente tóxico A.</li>
	<li>Logo antes da medição, adicione 10 μL de succinato (1 M) em todas as cuvetas. NOTA: O 10 μL é de preferência adicionado no degrau da cuvette, de modo que a reação começa após a mistura.</li>
	<li>Misture a cuvette com cuidado, virando-a três vezes. Coloque-o no leitor de cuvette de absorção (espectrômetro UV/VIS).</li>
	<li>Clique em Measure > Parâmetros > Geral e defina os parâmetros de medição em Comprimento de Onda: 550 nm e Tempo: 4 minutos de leitura; pressione os botões Aceitar e Iniciar para iniciar o experimento.</li>
	<li>No final da medição, salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvância clicando em Arquivo e Salve As. A inclinação também pode ser coletada manualmente.</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+respiratory+Supercomplex+I%2BIII2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+the+mammalian+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
<li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
<li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+the+supercomplex%3A+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li>
<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
<li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).</li>
<li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria%3A+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).</li>
<li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQH2%2FCoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain%3A+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+formation+boosts+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).</li>
<li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%3A+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li>
<li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li>
<li>Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Embora este protocolo represente um procedimento muito simples para identificar a existência das piscinas de CoQ parcialmente segmentadas, existem algumas medidas críticas a serem tomadas em conta. Substratos (ou seja, NADH ou succinato) são preferencialmente adicionados por último, uma vez que a autooxidação desses compostos pode ocorrer. A inversão de Cuvette deve ter cuidado para evitar a formação de bolhas que possam interferir na leitura.
Além disso, a presente técnica apresenta algumas l...

O sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é a principal via que conduz a síntese de triptosfato de adenosina (ATP), a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e o consumo de equivalentes redutores, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) ou succinato, por mitocôndrias. O sistema OXPHOS é composto por cinco complexos proteicos: Complexo I (CI) oxida NADH e reduz o CoQ em ubiquinol (CoQH2). O Complexo II (CII) oxida o succinato em fumarate e reduz o CoQ em CoQH2. Complexo III (CIII) oxida CoQH2 de volta ao CoQ, reduzindo citocromo c (cyt c). Finalmente, o complexo IV (CIV) oxida o cit c e reduz o oxigênio à água. Esta cadeia de oxidoredução, a chamada cadeia de transporte de elétrons (mETC), é acoplada ao bombeamento de H+ através do IMM, que cria um gradiente eletroquímico usado pelo complexo V (CV) para fosfortar difosfato de adenosina (ADP) em ATP.
os complexos mETC podem estar sozinhos no IMM ou montar em estruturas quaternárias chamadas supercomplexos. O CIV pode montar com CIII, formando o III2+IV ou Q-respirasome (como é capaz de respirar na presença de CoQH2)1,2,3 ou formando homodimers ou homooligomers4. O CIII pode interagir com a CI, formando o supercomplexo I+III25. Finalmente, a CI também é capaz de interagir com o Q-respirasome, construindo o I+III2+IV ou N-respirasome (pois pode respirar consumindo NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ e cyt c são portadores de elétrons móveis encarregados da transferência de elétrons de CI/CII para CIII, e de CIII para CIV, respectivamente. Se os supercomplexos impõem ou não uma restrição local funcional para essas operadoras tem sido uma questão de intenso debate ao longo das últimas duas décadas 2,7,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, vários grupos independentes demonstraram que o CoQ e o cyt c podem ser segmentados funcionalmente em piscinas no IMM. Em relação ao CoQ, ele pode ser segmentado funcionalmente em um pool específico de CoQ para CI (CoQNAD) e outro pool dedicado às enzimas dependentes de FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. No entanto, para diferenciar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas, foram necessárias a superexpressão da oxidase alternativa (AOX) e a geração de mutantes específicos de MTDNA, que podem montar IC na ausência de CIII, foram necessários 1,19,20.
O mecanismo de produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) durante a hipóxia era desconhecido até recentemente. Após a hipóxia aguda, a IC sofre a transição ativa/deativa (A/D), que envolve a diminuição de sua atividade de oxidoreductase de bombeamento H+ . Tal diminuição no bombeamento H+ acidifica a matriz mitocondrial e dissolve parcialmente os precipitados de cálcio-fosfato na matriz mitocondrial, liberando ca2+solúvel. Esse aumento no Ca2+ solúvel ativa o trocador Na+/Ca2+ (NCLX), que extrude o Ca2+ em troca de Na+. Mitocondrial Na+ o aumento interage com fosfolipídios no lado interno do IMM, diminuindo sua fluidez e transferência de CoQ entre CII e CIII, finalmente produzindo ânion de superóxido, um sinal de redox21. Curiosamente, a transferência de CoQ só foi diminuída entre CII e CIII, mas não entre CI e CIII, destacando que 1) Na+ foi capaz de modular apenas uma das piscinas coq existentes nas mitocôndrias; 2) existem piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM. Assim, um protocolo amplamente utilizado para o estudo de atividades enzimárias mitocondriais pode ser utilizado para avaliar a existência das piscinas coq mencionadas.
O protocolo atual baseia-se na medição da redução do cit c oxidado, o substrato do CIII, por absorção na presença de succinato (ou seja, substrato CII) ou NADH (ou seja, substrato ci). A mesma amostra é dividida em duas, uma das quais será tratada com LCI, e a outra com a mesma concentração de NaCi. Dessa forma, dado que o Na+ diminui a fluidez do IMM, se o CoQ existisse em um pool único no IMM, tanto CI+CIII quanto CII+CIII diminuiriam na presença de Na+. No entanto, se o CoQ existisse em pools de CoQ funcionais parcialmente segmentados, o efeito de Na+ seria evidente principalmente (ou apenas) sobre a atividade CII+CIII, mas não no CI+CIII. Como publicado recentemente21, Na+ afeta apenas a transferência de CoQ entre CII e CIII (Figura 1C,D), mas não entre CI e CIII (Figura 1A,B).
Este protocolo, juntamente com uma panóplia de técnicas, tem sido utilizado para confirmar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas no IMM, uma dedicada à CI (ou seja, CoQNAD), e outra dedicada às enzimas ligadas à FAD (ou seja, CoQFAD)1,3,7; observação que, embora continue a ser debatida22, foi corroborada independentemente por vários grupos 7,19. Assim, a supermontagem da CI em supercomplexos impacta na mobilidade local do CoQ, facilitando seu uso pelo CIII dentro do supercomplexo 1,7,13,14,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c do coração equino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Ácido malônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Cianeto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Manager software</td><td>JASCO</td><td>versão 2</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>UV/VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de coq funcionais parcialmente segmentadas

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

As piscinas de ubiquinona (CoQ) na membrana mitocondrial interna (IMM) são parcialmente segmentadas para enzimas complexas I ou dependentes de FAD. Tal subdivisão pode ser facilmente avaliada por um ensaio comparativo usando NADH ou succinato como doadores de elétrons em mitocôndrias descongeladas congeladas, nas quais a redução do citocromo c (cyt c) é medida. O ensaio se baseia no efeito de Na+ no IMM, diminuindo sua fluidez. Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade naDH-cyt c oxidoreductase e atividades de succinato-cyt c oxidoreductase na presença de NaCl ou KCl. As reações, que dependem da mistura de reagentes em uma cuvette de forma stepwise, são medidas espectrofotometricamente durante 4 minutos na presença de Na+ ou K+. A mesma mistura é realizada em paralelo na presença dos inibidores específicos da enzima, a fim de subtrair a alteração inespecífica na absortância. A atividade nadh-cyt c oxidoreductase não diminui na presença de nenhuma dessas alcaações. No entanto, a atividade de succinato-cyt c oxidoreductase diminui na presença de NaCl. Este simples experimento destaca: 1) o efeito de Na+ na diminuição da fluidez do IMM e da transferência de CoQ; 2) que o supercomplexO I+III2 protege a transferência de ubiquinona (CoQ) de ser afetada pela redução da fluidez do IMM; 3) que a transferência de CoQ entre CI e CIII é funcionalmente diferente da transferência de CoQ entre CII e CIII. Esses fatos sustentam a existência de piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM e mostram que podem ser reguladas pelo ambiente Na+ em mudança das mitocôndrias.

Os resultados típicos deste protocolo estão representados abaixo (Figura 3). Como a absorvência c reduzida se localiza a 550 nm, todas as subsampeções desinibidas devem mostrar um aumento na absorvância de 550 nm. Subsamples inibidas, o ideal é mostrar uma inclinação plana ou ligeiramente crescente (Figura 3). As encostas de subsamtras inibidas devem ser subtraídas de subsampleções desinibidas.
As amostras A e B, ambas corrigidas por ...

Este protocolo descreve um ensaio comparativo, utilizando atividades complexas mitocondriais CI+CIII e CII+CIII na presença ou ausência de Na+, para estudar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.

Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Este protocolo destaca o papel do sódio como segundo mensageiro e também mostra a existência de piscinas de ubiquinol parcialmente diferenciadas. Esta técnica demonstra uma abordagem extremamente simples para o estudo de piscinas de ubiquinol que de outra forma requer modelos celulares muito específicos. Esta abordagem pode ser usada para o estudo da transferência de elétrons em outras membranas, particularmente de enzimas dentro de gotas lipídicas.Divida as amostras em quatro subamostras de 20 microgramas cada e rotule-as de A a D.Split amostras A e B em duas subamostras de 10 microgramas cada e rotule-as como A1, A2, B1 e B2. Prepare o buffer C1/C2 conforme descrito no protocolo de texto e pré-aqueça a 37 graus Celsius. Em um cuvette de um mililitro, adicione cada uma das subamostras a 30 microlitadores de citocromo c e 10 microliters de malonato. Adicione o buffer C1/C2 para aumentar o volume para 980 microliters nas cuvetas A1 e B1 e 979 microliters em A2 e B2. Adicione 10 microlitres de cloreto de potássio de um molar nas cédonas A1 e A2 e 10 microlitrais de cloreto de sódio de um molar em B1 e B2. Adicione um microliter de rotenona de um mililitro nas cuvetas A2 e B2. Logo antes da medição, adicione 10 microliters de NADH de 10 mililitros em todas as cuvetas.Vire a cuvette três vezes e coloque-a no espectotúmetro. Um software anexado, clique em Medir em parâmetros e, em seguida, vá para Geral e defina os parâmetros de medição em comprimento de onda de 550 nanômetros e tempo em quatro minutos de leitura. Clique em OK e Comece a iniciar o experimento.No final da medição, salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvância clicando em File e Save As.Split amostras C e D em duas subamostras de 10 microgramas cada e rotulá-los como C1, C2, D1 e D2. Misture cada uma das subamostras em uma cuvette de um mililitro com 30 microlitadores de citocromo c e um microliter de rotenone. Adicione o buffer C1/C2 pré-aquecido a 37 graus Celsius para aumentar o volume para 980 microliters nas cuvettes C1 e D1 e 970 microliters em C2 e D2. Adicione 10 microlitres de cloreto de potássio de um molar nas cédonas C1 e C2 e 10 microliters de cloreto de sódio de um molar em D1 e D2. Adicione um microliter de antimicina de um mililitro A nas cuvetas C2 e D2 logo antes da medição e 10 microlitres de succinato de um molar em todas as cuvetas. Vire a cuvette três vezes e coloque-a no espectotúmetro.Realize a medição e salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvência no final da medição. Este protocolo foi utilizado para estudar o efeito de íons de sódio na redução do citocromo c por membranas mitocondriais sobre nadh ou adição de succinato. Os traços de absorção gerados a 550 nanômetros para as amostras A e B foram corrigidos para sua inibição correspondente.Estes traços mostraram uma inclinação semelhante, indicando atividade nadh-citocromo c oxidoreductase semelhante. No entanto, os traços das amostras C e D foram diferentes, mostrando que a atividade de succinato-citocromático c oxidoreductase da amostra C é maior do que a amostra D.In para normalizar a quantidade de mudança medida com essa técnica, outros métodos podem ser realizados ainda mais, como atividade complexa isolada I, complexo II ou complexo III. Usando essa técnica, estamos explorando as configurações fisiológicas em que o sódio pode estar envolvido como um segundo mensageiro.

inner-mitochondrial-membrane-sensitivity-to-na-reveals-partially

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Este protocolo descreve a separação de complexos funcionais de cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (Cx) IV e supercomplexos usando eletroforese nativa para revelar informações sobre sua montagem e estrutura. O gel nativo pode ser submetido a imunotransferência, ensaios em gel e purificação por eletroeluição para caracterizar ainda mais complexos individuais.

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

Aqui, apresentamos dois protocolos para a medição de mitocondrial Ca2 + afluxo em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Por mitocôndrias isoladas, detalhamos uma placa baseada no leitor Ca2 + importação ensaio usando o Ca2 + sensível tingir cálcio verde-5N. Para culturas de células, nós descrevemos um método de microscopia confocal, usar a tintura de Ca2 + Rhod-2h.

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Aqui apresentamos um protocolo para extrair, resolver e identificar supercomplexos mitocondrial que minimiza a exposição a detergentes e Coomassie Blue. Este protocolo oferece um equilíbrio ideal entre a resolução e a preservação das atividades enzimáticas, minimizando o risco de perda de interações proteína-proteína lábil.

Eletroforese nativa clara/azul híbrida para a separação e análise de supercomplexos de cadeia respiratória mitocondrial

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

Este método explora a contribuição do poro de transição de permeabilidade mitocondrial para o vazamento de prótons de baixa condução para determinar o limiar de tensão para abertura de poros em camundongos neonatais frágeis da síndrome X com aumento do teor de coenzyme mitocondrial de cardiomiocrata Q em comparação com o controle do tipo selvagem.

Avaliação da Probabilidade Aberta do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial na Configuração do Coenzyme Q Excesso

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Os sítios de contato mitocondrial são complexos proteicos que interagem com proteínas da membrana interna e externa mitocondriais. Esses sítios são essenciais para a comunicação entre as membranas mitocondriais e, portanto, entre o citosol e a matriz mitocondrial. Aqui, descrevemos um método para identificar candidatos que se qualificam para esta classe específica de proteínas.

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho para a propagação, diferenciação e coloração de células SH-SY5Y cultivadas e neurônios primários do hipocampo de ratos para visualização e análise da ultraestrutura mitocondrial usando microscopia de depleção de emissão estimulada (STED).

Usando imagens STED de células vivas para visualizar a ultraestrutura da membrana interna mitocondrial em modelos de células neuronais

Fornecemos um método para rastrear simultaneamente uma biblioteca de fragmentos de anticorpos quanto à afinidade de ligação e solubilidade citoplasmática usando a via de translocação de arginina dupla de Escherichia coli, que possui um mecanismo de controle de qualidade inerente para dobramento de proteínas intracelulares, para exibir os fragmentos de anticorpos na membrana interna.

Exibição Inner-membrana bacteriana para o rastreio de uma biblioteca de anticorpo Fragments

Descubra como o sódio atua como segundo mensageiro na diferenciação de piscinas de ubiquinol mitocondrial. Este protocolo simplificado utiliza espectrofotometria com NADH e succinato para estudar transferência de elétrons.

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