Uma estratégia de enriquecimento de ponta de spin para análise simultânea de N-glicopeptídeos e Fosfopeptídeos de Tecidos Pancreáticos Humanos

Modificações pós-translacionais (PTMs) alteram estruturas e funções proteicas. Métodos para o enriquecimento simultâneo de vários tipos de PTM podem maximizar a cobertura nas análises. Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia de afinidade metálica ti(IV) automobilizada duplamente, seguida de espectrometria de massa para o enriquecimento simultâneo e análise da proteína N-glicosilação e fosforilação em tecidos pancreáticos.

A estratégia de cromatografia de afinidade metálica imobilizada de titânio duplo pode enriquecer tanto N-glicopeptídeos quanto fosfopeptídeos no mesmo fluxo de trabalho, aumentando as informações biomoleculares da mesma análise. A principal vantagem desse enriquecimento são dois mecanismos de separação, que permitem a separação simultânea de N-glicopeptídeos e fosfopeptídeos em frações separadas para análise de espectrometria de massa a jusante. O uso deste método de enriquecimento pode melhorar a detecção de glicosilação e fosforilação em amostras biológicas complexas, como tecidos pancreáticos para a descoberta de biomarcadores de doenças, como diabetes e câncer.

Como este método se baseia em pontas de giro e centrifugação, é importante controlar a velocidade de centrifugação e certificar-se de que as amostras estão livres de partículas para evitar qualquer entupimento. Para começar, pré-arrefeça as partes do pulverizador de tecido que entrarão em contato com os tecidos pancreáticos, ou seja, a câmara, o pulverizador e a colher de recuperação, juntamente com quaisquer espátulas, em um recipiente de poliestireno. Em seguida, transfira peças de tecido para o suporte de amostra pré-refrigerado, e adicione um nitrogênio líquido ao tecido até que eles sejam congelados.

Depois de colocar o pulverizador na câmara, golpeie-o usando uma marreta de cinco a dez vezes para esmagar a amostra, em seguida, remova o pulverizador da câmara e raspe o pó de tecido aderente e pedaços. Em seguida, adicione uma colher cheia de nitrogênio líquido à câmara se os tecidos começarem a derreter, e repita o processo de pulverização até que um pó fino seja obtido e porção as amostras em alíquotas de aproximadamente 100 miligramas em tubos pré-refrigerados. Após preparar o tampão de lise, dissolva um comprimido cada um do inibidor de protease e fosfatase em 500 microliters de água, para um estoque de 20 vezes a concentração final desejada, e adicione o volume necessário de estoque de cada inibidor ao tampão de lise para alcançar as concentrações inibidoras finais.

Depois de adicionar 600 microliters de tampão de lise ao tubo, incubar a 95 graus Celsius no bloco de aquecimento por 10 minutos com agitação a 800 RPM, em seguida, remover as amostras do bloco de aquecimento e deixá-los esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, sonicar as amostras a 60 Watts de energia por 45 segundos, usando pulsos de 15 segundos com um descanso de 30 segundos no meio, e pellet as amostras a 3000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Adicione o supernatante a cinco vezes o seu volume de solvente de precipitação.

Por exemplo, 300 microliters de tampão de lise para 1,5 mililitros de solvente de precipitação contendo 50% de acetona, 49,9% de etanol e ácido acético de 0,1%, depois esfriam durante a noite a 80 graus Celsius. Pelotar as amostras novamente a 3000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius, e remover o supernasce, em seguida, lave a pelota rompendo com uma espátula e misture com a mesma quantidade de solvente de precipitação. Após a centrifugação, seque a pelota de amostra em um capô de fumaça por 15 minutos, e armazene a 80 graus Celsius até estar pronto para prosseguir.

Primeiro, suspenda a pelota de proteína em 300 microliters de tampão de digestão recém-feito contendo 50 milimonas de tampão de bicarbonato de trietilamônio e oito ureia molar. À proteína em solução, adicione dithiothreitol a uma concentração final de cinco milimólares, misture e reduza à temperatura ambiente por uma hora, em seguida, adicione iodoacetamida a uma concentração final a 15 milimolares. Misture e misture à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro.

Em seguida, adicione Lys-C/Trypsin a 1 a 100% da relação enzima-proteína, e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora por quatro horas, depois adicione 50 milimônios trietilamônio bicarbonato tampão para diluir a ureia molar de oito molar usada para menos de um molar. Depois de adicionar trippsina a 1 a 100% da relação enzima-proteína, incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora durante a noite, subsequentemente saciar a digestão com a adição de ácido trifluoroacético. Para cada miligrama de proteína inicial, condicionar um cartucho desalado com um mililitro de acetonitrilo, e três vezes com um mililitro de ácido trifluoroacetic de 0,1%, em seguida, carregar a mistura digerida no cartucho desalar, e lavar a mistura três vezes usando um mililitro de ácido trifluorocetic de 0,1%.

Em seguida, peptídeos elutos usando um mililitro de 60% de acetonitrilo e 0,1% solução de ácido fórmico, em seguida, peptídeos elucidos secos a aproximadamente 35 graus Celsius usando um concentrador de vácuo centrífugo até que o solvente tenha evaporado completamente. Depois de suspender novamente os peptídeos na água, estime concentrações de peptídeos usando um ensaio de peptídeo de acordo com o protocolo do fabricante, em seguida, porção os peptídeos em alíquotas de 500 microgramas, e seque completamente. Pese aproximadamente três miligramas de algodão e embale-o em uma ponta de giro vazia.

Depois de transferir um grama de material de cromatografia de afinidade metálica imobilizada de titânio em um tubo, adicione ácido trifluoroacético de 0,1% a uma concentração conhecida de material. Depois de adicionar chorume suficiente a uma ponta de giro para transferir 20 miligramas de material, lave a ponta de giro por centrifugação com 200 microliters de ácido trifluoroacético de 0,1%. Suspenda as amostras em 200 microliters de solvente de carga/lavagem e flua através da ponta de giro.

Depois de lavar a ponta de giro por centrifugação com solvente de carga/lavagem, lave a ponta de giro com 200 microlitres de 80% de acetonitrilo 0,1 solução de ácido fórmico, em seguida, elute os peptídeos com 200 microliters de E1 e E2, e analise cada eluição separadamente. Repita o processo de eluição usando solventes E3 e E4 e combine as frações de elução apropriadas antes da análise a jusante. Antes de realizar as eluções no pH básico, condicionar o material três vezes usando 200 microlitres de 90% de acetonitrilo em hidróxido de amônio de 2,5%, em seguida, elute os peptídeos com 200 microliters de solventes E5 e E6, e analise essas eluções separadamente após a dessalação usando uma ponta embalada.

Em seguida, elute os peptídeos com 200 microliters de diferentes concentrações de acetonitrilo e hidróxido de amônio. Depois, misture essas eluções e analise como uma amostra, E7, após a dessedação usando uma ponta embalada. Os espectros de MS/MS de alta confiança anotados de peptídeos N-glicosylated e fosforilados foram obtidos com rica fragmentação de precursores, aumentando a confiança na identificação, conforme atribuído pelo software de pesquisa de banco de dados.

As identificações de peptídeos foram encontradas a partir de amostras enriquecidas utilizando o método de ponta de spin de cromatografia de afinidade metálica de titânio imobilizado dual-funcional sobre cada fração de eluição. A maioria dos glicopeptides elute nas quatro primeiras frações, enquanto a maioria dos fosfopeptides elute nas últimas três frações, diminuindo possíveis interferências na ionização. Os resultados da glicoproteômica do método de titânio duplo foram comparados a um enriquecimento somente Ehrlich-glycopeptide, demonstrando que as proporções de cada tipo de glicano após binning em seis categorias com base em suas composições, são semelhantes entre ambos os métodos.

Os resultados da fosfoproteômica do método de titânio duplo foram comparados a um enriquecimento convencional de cromatografia de afinidade metálica imobilizada ou usando ambos os métodos. A maioria dos aminoácidos fosforilalatados foram identificados como serinoina e ritréonina, com cerca de 1%de tyrosina fosforilada. A construção adequada da ponta de giro é importante para garantir a eluição suave.

Conecte o algodão firmemente na ponta, para que o material de enriquecimento possa ser embalado em cima do algodão. Utilizamos o método IMAC de titânio dual-funcional para caracterização simultânea de glicosilação e fosforilação na maioria dos tecidos e a proteína de pico SARS-CoV-2.