Name: Criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de Tortricidae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda técnicas de criação em massa e diferenciação sexual em insetos da família Tortricidae para estudos moleculares. Este método permite extrair ácidos nucleicos de alta qualidade para sequenciamento e avançar na biologia de pragas agrícolas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores desejam reconhecer o apoio da Sociedade japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) Bolsas de Pesquisa para Jovens Cientistas [Grant Number 19J13123 e 21J00895].

1. Coleta de insetos e criação em massa
<ol><li>Coletar insetos tortricídeos de campos após referênciaspublicadas anteriormente 8,12. NOTA: As larvas H. magnanima e A. honmai são coletadas de folhas de chá danificadas (Figura 1A); adultos são atraídos usando luz UV portátil de 4 W (comprimento de onda de 365 nm, ver Tabela de Materiais, Figura 1B).</li>
	<li>Colete as larvas coletadas (Figura 1C,D) individualmente em um pedaço de dieta artificial em um copo de 1/2 oz por 2-3 semanas até a eclosão adulta (Figura 1E,F). Confirme o sexo de pupas e adultos por traços morfológicos (Figura 1G,I).</li>
	<li>Mate os machos e fêmeas em uma caixa de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm) para ovipositar massas de ovos em um papel de parafina (Figura 1J-L). Coloque uma fêmea e dois machos em um copo de plástico de 120 mL com um pedaço de papel de parafina para estabelecer uma matrilina. NOTA: É importante fazer vincos no papel parafina. Para H. magnanima, o papel de parafina precisa estar no fundo do caso. Enquanto isso, para A. honmai, coloque um papel no teto da caixa para coletar ovos (Figura 1L) desde h. magnanima oviposit massa de ovos no lado superior das folhas de chá, mas A. honmai coloca ovos na parte inferior das folhas8. Os procedimentos também foram verificados em outras espécies de tortricida, e é melhor colocar documentos de ambos os lados se a ecologia e o comportamento das espécies-alvo não forem inclarizados.</li>
	<li>Corte as massas de ovos (aproximadamente 100-200 ovos por massa de ovo12, Figura 1M) no papel de parafina com uma tesoura. Coloque os ovos em uma xícara de 1/2 oz com papel despejado por 5-7 dias. NOTA: O embrião amadurecido exibe uma cápsula de cabeça negra (Figura 1N). Os períodos de embriogênese são diversas mente atribuídos a espécies tortricidas, mas geralmente 5 dias após a oviposição (dpo) para H. magnanima e 4 dpo para A. honmai a 25 °C com 60% de umidade relativa, 16 h luz/8 h ciclos escuros7.</li>
	<li>Armazene as massas de ovos mostrando cápsulas de cabeça preta a 4-8 °C durante 7 dias.</li>
	<li>Corte ~60 g dietas artificiais usando um ralador para criação em massa. Coloque a massa de ovos cheia de embriões maduros na dieta artificial fatiada em um recipiente plástico (23 cm x 16 cm x 8 cm). Coloque os papéis de parafina na massa de ovos com as dietas fatiadas (Figura 10). NOTA: Abaixo de 30% a umidade relativa é considerada mais seca, enquanto mais de 70% é muito úmida. Criar furos na tampa do recipiente de plástico é melhor para permitir uma melhor ventilação. Encha os buracos com algodão para evitar as fugas de pequenas larvas.</li>
	<li>Para eliminar contaminantes superficiais dos ovos, mergulhe a massa de ovos em 3% de formalina e 0,2% de solução de cloreto de benzalkonium por 5 min, respectivamente12. Para erradicar bactérias intestinais ou intracelulares, utilize uma dieta artificial suplementada com 0,05% (w/w) cloridrato de tetraciclina ou 0,06% (w/w) rifampicina em vez de uma dieta artificial normal (ver Tabela de Materiais). NOTA: Esta etapa é opcional. É importante amassar o Mate de Seda 2S e 0,05% (w/w) Cloridrato de Tetraciclina ou 0,06% (w/w) rifampicina equificadamente para consistência.</li>
	<li>Recolhe a pupa do recipiente plástico e distingue o sexo com base nas características morfológicas12 (Figura 1G-I). NOTA: Geralmente, os tortricídeos apresentam 5-6 instars até a pupação12. As larvas H. magnanima e A. honmai levam 3 semanas e 2 semanas, respectivamente, depois de eclodir até a pupação.</li>
	<li>Coloque 15 machos e 10 fêmeas em uma caixa de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figura 1K) para acasalamento com 25 °C, 16 L/8 D. Coletar ovos por 5-7 dias e repetir as etapas 1.4-1.9. para cada geração. NOTA: Se for necessário coletar massas de ovos recém-ovipositados para análise subsequente, defina o início e o fim do período escuro, por exemplo, das 9:00 às 17:00. Nesta condição, H. magnanima e A. honami geralmente oviposit ovos após 5 h (2 PM).</li>
</ol>2. Separação de ovos e larvas de pharate de massas de ovos para fixação, permeabilização e coloração
<ol><li>Mergulhe a massa de ovos em 1.000 μL de 1,2% de solução aquosa hipoclorito de sódio por 10 min ou em 1.000 μL de solução aquosa de hidróxido de potássio de 5 M por 30 minutos para separar os ovos.</li>
	<li>Lave os ovos separados em 1.000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% de Polioximetileno (20) Monolaurate Sorbitano [Tween-20] pH 7.4, ver Tabela de Materiais) após o relatório publicado anteriormente7.</li>
	<li>Mergulhe ovos em uma mistura de 500 μL de heptano 100% e 500 μL de solução paraformaldeída-PBSt de 4% (c/v). Misture por 10 min a 1.500 rpm usando um misturador de vórtice.</li>
	<li>Mergulhe os ovos em uma mistura de 500 μL de 100% de heptano e 500 μL de 100% de metanol. Misture por 10 min a 1.500 rpm.</li>
	<li>Lave os ovos duas vezes com 1.000 μL de 100% de metanol e armazene a 4 °C em 100% de metanol até novos experimentos (Figura 2A). NOTA: Os ovos podem ser armazenados por pelo menos 1 ano a 4 °C.</li>
	<li>Mergulhe os ovos sequencialmente em 99%, 70%, 50% etanol e PBSt por 5 min cada para hidrofilização seguindo o relatório publicado anteriormente7.</li>
	<li>Lave os ovos com PBSt, mergulhe os ovos em 1 μg/mL de solução DAPI por 5 minutos e depois lave os ovos com 1x PBS duas vezes. Mergulhe os ovos em 20 μL de 1,25% (w/w) solução de orceina láctica-acética (ver Tabela de Materiais)11 para visualizar heterocromatina até que os núcleos exerçam uma cor vermelha brilhante (isso varia de 5 a 60 min) (Figura 2B,C). NOTA: Os períodos de coloração de orceínia láctica-acética dependem da temperatura e umidade. É melhor verificar se há uma coloração adequada usando um microscópio com ampliação de 4x-10x.</li>
	<li>Transfira os ovos manchados usando uma pipeta para um slide de vidro. Inclua os ovos manchados com reagente antifade (ver Tabela de Materiais) e um copo de cobertura7.</li>
	<li>Extraia as larvas de pharate H. magnanima e A. honmai (4-5 dias pós oviposition (dpo)) das massas de ovos usando fórceps (Figura 2D). Larvas de bissecto em uma lâmina de vidro (Figura 2E).</li>
	<li>Fixar todos os tecidos (por exemplo, gânglio suboesofágico, gânglio torácico, túbulo malpighiano, etc.) com uma mistura de 1:3 (v/v) 99,7% de ácido acético/100% metanol por 5 min. Colora aqueles com 1,25% (w/w) solução de orceina láctica-actic11 até que os núcleos estejam manchados (isso pode levar de 5 a 60 minutos, dependendo da temperatura e umidade).</li>
	<li>Determine o sexo de cada espécime observando a presença (feminina) ou ausência (masculina) de heterocromatina (o cromossomo W, Figura 2F,G) sob um microscópio. NOTA: O sexo é determinado visualizando a cromatina sexual. Cada célula representa a cromatina sexual como ponto em fêmeas11,12, enquanto a porção restante de tecidos larvais de pharate (não fixo) deve ser imediatamente imersa no tampão de lise celular12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8.0) ou reagentes de extração de RNA contendo fenol para extração de DNA ou RNA. Antes das dissecções, dispense 20 μL dos reagentes em tubos PCR de 0,2 mL com antecedência (Figura 3A). Mergulhe e armazene amostras a -80 °C até uma extração adicional. As amostras podem ser armazenadas por pelo menos 3 meses, mas é melhor prosseguir com os experimentos a jusante para evitar a degradação dos ácidos nucleicos.</li>
</ol>3. Extrações de DNA e RNA de larvas de pharate determinadas por sexo
<ol><li>Piscina 12 larvas de pharate masculino ou feminino determinadas por sexo (5 embriões dpo) e adicionar tampão de lise celular ou reagentes de extração de RNA (ver passo 2.11 e Tabela de Materiais) em um tubo de 1,5 mL. NOTA: Siga as etapas 3.2-3.7 para extração de DNA e etapas 3.8-3.11 para extração de RNA.</li>
	<li>Homogeneize tecidos em 600 μL do tampão de lise celular (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8.0), e centrifugar as amostras a 10.000 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Colete o supernante (500 μL) usando uma pipeta e incubar a 50 °C com 1,5 μL de Proteinase K (20 mg/mL, ver Tabela de Materiais) por 5h em um bloco de calor.</li>
	<li>Trate as amostras com 1,0 μL de 10 mg/mL de solução RNase (ver Tabela de Materiais) a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>Adicione 200 μL de solução de precipitação proteica (ver Tabela de Materiais) aos tubos7, seguido de uma centrífuga a 17.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Misture o supernatante (500 μL) com 500 μL de isopropanol de 100% e, em seguida, centrífuga a 20.400 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Lave o DNA de pelotas duas vezes com 1.000 μL de 70% de etanol. Em seguida, ar-seco (5-10 min à temperatura ambiente), dissolva o DNA em 30 μL de 10 mM tris-cl tampão (pH 8.5).</li>
	<li>Homogeneize os tecidos em 600 μL de reagentes de extração de RNA e adicione 240 μL de água destilada ultra-pura ao tubo. Centrifugar os tubos a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Misture o supernasciente (600 μL) com 600 μL de isopropanol de 100% e transfira a mistura para uma coluna de giro de sílica (ver Tabela de Materiais). Centrifugar os tubos a 17.900 x g por 1 min a 4 °C.</li>
	<li>Lave a coluna com 750 μL de 70% de etanol, e centrifugar a coluna duas vezes a 17.900 x g por 1 min cada a 4 °C.</li>
	<li>Carregue 15 μL de água destilada ultra-pura para a coluna. Centrifugar os tubos a 17.900 x g por 1 min a 4 °C para elute o RNA.</li>
	<li>Calcule e verifique a qualidade e quantidade de DNA e RNA usando um espectrômetro baseado em UV. Avalie a pureza dos ácidos nucleicos utilizando as razões A260/A280 (ácidos/proteínas nucleicas) e A260/A230 (ácidos/sais nucleicos e outros contaminantes)13. NOTA: Para a extração do RNA, seguiu-se o procedimento publicado anteriormente12 , que resultou em contaminação do fenol (Tabela 1). O DNA extraído e RNA de um único embrião ou larvas de pharate produz amostras de baixa quantidade e baixa qualidade. Normalmente, a extração de DNA de 12 larvas de pharate produz 100-600 ng, enquanto a extração de RNA usando o método atual gera 900-1.500 ng, como mostra a Tabela 1. NOTA: As etapas 3.13-3.15 são opcionais para outros ensaios de sequenciamentos de alto rendimento.</li>
	<li>Calcule as quantidades de DNA e RNA usando um espectrofotômetro baseado em fluorescência. NOTA: A razão das quantidades de RNA (concentração baseada em UV (ng/μL)/concentração baseada em fluorescência (ng/μL)) foi calculada para avaliar a qualidade para aplicação experimental posterior. Por exemplo, quando as concentrações baseadas em UV e fluorescência são de 80 ng/uL e 60 ng/uL, respectivamente, a razão será de 1,5 (80/60). Normalmente, as razões abaixo de 1,5 indicam pureza suficiente para aplicações a jusante usando sequenciamento de alto rendimento13.</li>
	<li>Analise a qualidade do RNA usando a eletroforese de microchip14.</li>
	<li>Utilize as RNAs qualificadas para preparar a biblioteca RNA usando um kit de preparação da biblioteca RNA (ver Tabela de Materiais). Sequencie as bibliotecas usando uma plataforma adequada para as bibliotecas preparadas.</li>
</ol>

<ol><li>Gaston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+magnitude+of+global+insect+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Biology%22%5BJournal%5D)">The magnitude of global insect species richness.</a> Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).</li>
<li>Pogue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+world+revision+of+the+genus+Spodoptera+Guen%C3%A9e+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+the+American+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1(2002).</li>
<li>Matsuura, H., Naito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+cold-hardiness+and+overwintering+of+Spodoptera+litura+F.+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%3A+VI.+Possible+overwintering+areas+predicted+from+meteorological+data+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).</li>
<li>Mita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+an+EST+database+for+Bombyx+mori+and+its+application%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The construction of an EST database for Bombyx mori and its application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).</li>
<li>Kawamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+genome+assembly+of+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).</li>
<li>Fukui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+masculinizing+function+of+the+Ostrinia+furnacalis+Masculinizer+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).</li>
<li>Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+disperse+eggs+from+lepidopteran+scale-like+egg+masses+and+to+observe+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Entomological+Science%22%5BJournal%5D)">A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis.</a> Entomological Science. 25 (1), 12497(2022).</li>
<li>vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avander+Geest%2C+LP+%22Tortricid+pests%3A+their+biology%2C+natural+enemies+and+control%22">Tortricid pests: their biology, natural enemies and control</a>. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).</li>
<li>Kiuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+female-specific+piRNA+is+the+primary+determiner+of+sex+in+the+silkworm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm.</a> Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).</li>
<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li>
<li>Kageyama, D., Traut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+sex-specific+effects+of+Wolbachia+and+interference+with+the+sex+determination+of+its+host+Ostrinia+scapulalis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis.</a> Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).</li>
<li>Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+male-killing+and+nonmale-killing+Wolbachia+strains+in+the+oriental+tea+tortrix+Homona+magnanima%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima.</a> Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).</li>
<li>Schalamun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+MinION%3A+An+example+of+how+to+establish+long-read+sequencing+in+a+laboratory+using+challenging+plant+tissue+from+Eucalyptus+pauciflora%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora.</a> Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).</li>
<li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+insect+RNA+look+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10 (1), 159(2010).</li>
<li>Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inbreeding+in+Mimulus+guttatus+on+tolerance+to+herbivory+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments.</a> Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).</li>
<li>Saccheri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+and+extinction+in+a+butterfly+metapopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation.</a> Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).</li>
<li>Crnokrak, P., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+depression+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Inbreeding depression in the wild.</a> Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).</li>
<li>Keller, L. F., Waller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+effects+in+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Inbreeding effects in wild populations.</a> Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).</li>
<li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).</li>
<li>Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+male-killing+Wolbachia+carries+a+feminizing+factor+and+is+associated+with+degradation+of+the+sex-determining+system+of+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host.</a> Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O tortrida compreende várias pragas agrícolas e florestais; o presente estudo apresentou métodos para retrocoterar ao longo de gerações, observar a embriogênese e o sexo dos insetos e realizar análises moleculares utilizando embriões maduros.
Um dos obstáculos para o estudo de insetos de pragas é estabelecer métodos de criação. Especialmente, a endogamia às vezes afeta negativamente a aptidão da espécie. A redução do condicionamento físico pelo inerido, chamada de depressão endogamia, tem sido...

Os insetos lepidopteranos representam mais de 10% de todas as espécies vivas descritas1, e certas espécies de taxas causam danos graves às plantas e graves perdas agrícolas 2,3. Embora estudos moleculares e genéticos tenham sido desenvolvidos usando insetos modelo, como o bicho-da-seda Bombyx mori 4,5, os insetos pragas permanecem sem investigação, em parte devido às dificuldades para criar e manusear 6,7. Portanto, estudos e técnicas fundamentais são necessários para entender a biologia desses insetos pestes não-modelo.
O Tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais8. Da taxa de insetos, a tortrix oriental Homona magnanima Diakonoff e a tortrix de frutas de verão Adoxophyes honmai Yasuda são pragas polifagosas graves conhecidas por danificar árvores de chá no leste da Ásia7. As duas espécies estavam agrupamentos de ovos planos e ovais (ou massas de ovos) consistindo de ovos finos, macios e frágeis cobertos por secreções maternas. Embora os estágios de embriogênese sejam cruciais para o desenvolvimento de insetos e determinações sexuais9, as estruturas dos ovos impedem que uma análise mais aprofundada entenda a biologia dos insetos. É importante superar as dificuldades para um estudo mais aprofundado sobre pragas que oviposim essa complexa massa de ovos.
Aqui, para entender a biologia dos tortricídeos, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares foram desenvolvidos usando A. honmai e H. magnanima. Primeiro, os métodos de criação em massa mantêm os dois tortricídeos acima de 100 gerações por inserção. A separação dos ovos da massa de ovos em escala concatenada facilitou a observação embrigênese dos tortricídeos usando solventes alcalinos e orgânicos previamente desenvolvidos a partir de técnicas usadas em moscas10. Além disso, o presente estudo estabeleceu a discriminação sexual de pequenos embriões, desenvolvendo métodos de coloração da cromatina sexual de fêmeas lepidopteranas utilizando orceina láctica-acética11. Combinando esses métodos, ácidos nucleicos de alta qualidade e quantidade foram extraídos de embriões determinados por sexo, o que de outra forma era difícil de estabelecer6. O RNA extraído foi utilizado para sequenciamento de próxima geração. Coletivamente, os métodos aqui apresentados aplicam-se a outros insetos lepidopteranos e outros insetos taxa.

<table><tbody><tr><td>Copo de 1/2 onça</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070009</td><td>criação de insetos; tampa de copo de https://www.askul.co.jp/p/6010417/</td></tr> <tr><td>1/2 onça</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070011</td><td>criação de insetos; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether</td></tr><tr><td>99,7% de ácido acético</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão</td><td>36289</td><td>fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>não mostrado</td><td>Quantificação de ácidos nucleicos; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td></tr><tr><td>Agilent RNA6000 nano kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>Quantificação de ácidos nucleicos; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf</td></tr><tr><td>solução de cloreto de benzalcônio</td><td>Nihon Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>No.4987123116046</td><td>Esterilização; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td></tr><tr><td>Algodão</td><td>AOUME</td><td>8-1611-02</td> criação de <td>insetos; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1</td></tr><tr><td>solução DAPI</td><td>Dojindo, Tóquio, Japão</td><td>340-07971</td><td>colorações; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td></tr> <tr><td>Hidrogenofosfato dissódico</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Na2HPO4;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html kit de quantificação dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Quantificação de ácidos nucleicos; coluna</td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 Econospin RNA II</td><td>Epoch Life Science Inc.</td><td>EP-11201</td><td>Extração de RNA; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td></tr><tr><td></td><td>Etanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão</td><td>4.98748E + 12</td><td>fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina-N, N, N', N'-tetraacético Sal tetrassódico tetrahidratado (4NA)</td> <td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E + 12</td><td>Tampão de lise celular (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html</td></tr><tr><td>Papel glassine</td><td>HEIKO</td><td>2100010</td><td>criação de insetos; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&amp; utm_medium=cpc& utm_source= Bloco</td></tr><tr><td>de calor Adw WSC-2620 PowerBLOCK</td><td>ATTO, Tóquio, Japão</td><td>4002620</td><td>incubação; https://www.attoeng.site/</td></tr> <tr><td>heptano</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão</td><td>4.98748E+12</td><td>fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html</td></tr><tr><td>INSECTA LF</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>não mostrado</td><td>Dieta artificial; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>ISOGENII</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td>Extração de RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html</td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E + 12</td><td>extração de ácidos nucléicos; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td></tr><tr><td>Ácido láctico</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E + 12</td><td>Manchas; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html</td></tr><tr><td></td><td>metanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão</td><td>4.98748E + 12</td><td>fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html</td></tr><tr><td>MSV-3500 vórtice</td><td>Biosan</td><td>BS-010210-TAK</td><td>Misturador Voltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td></tr><tr><td>Nano Fotômetro NP 80</td><td>Implen</td><td>não mostrado</td><td>Quantificação de ácidos nucléicos; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td></tr> <tr><td>Embalagem natural ampla</td><td>Inomata química</td><td>1859</td> criação <td>de insetos; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3% 82%A4%E3%83%89</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit para preparação da biblioteca Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7770S</td><td>; https://www.nebj.jp/products/detail/2039</td></tr><tr><td>orceína</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>colorações; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html</td></tr><tr>produtos <td>químicos Co. de FUJIFILM Wako do paraformaldeído.</td><td></td><td>160-16061</td><td>fixação; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html</td></tr><tr><td>Polioxietileno (20) Monolaurato de Sorbitano</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tween-20; Luz</td></tr><tr><td>negra UV portátil https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html (comprimento de onda 4W, 365nm)</td><td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japão</td><td>não mostrado</td><td>Coleção de insetos; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html</td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de potássio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Invitrogen, miliampère, EUA</td><td>P36965</td><td>antifade; Solução de</td></tr><tr><td>proteinase K</td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 Extração de DNA <td>Merck</td><td>71049-4CN</td><td>; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049</td></tr><tr><td>solução de precipitação de proteínas</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td>extração de DNA; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC</td></tr><tr><td>Qubit V4</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Quantificação de ácidos nucleicos;</td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 rifampicina</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão</td><td>4.98748E+12</td><td>Esterilização; Kit de</td></tr><tr><td>quantificação de RNA HS</td> de https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html<td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Quantificação de ácidos nucleicos; solução de</td></tr><tr><td>RNase</td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 <td>Nippon Gene</td><td>313-01461</td><td>Extração de RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html</td></tr><tr><td>Silk Mate 2S</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>não mostrado</td><td>Dieta artificial; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html</td></tr> produtos <tr><td>químicos Co. de FUJIFILM Wako do</td> <td>sulfato do Dodecil do sódio</td>.<td>4.98748E+12</td><td>Tampão de lise celular (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html</td></tr><tr><td>solução aquosa de hipoclorito de sódio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão</td><td>4.98748E+12</td><td>separação de ovos; Cloridrato de</td></tr><tr><td>tetraciclina</td> https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html <td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japão</td><td>4.98748E+12</td><td>Esterilização; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E + 12</td><td>Tampão de lise celular; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html</td></tr><tr><td>água destilada ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>extração de RNA; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015</td></tr></tbody></table>

criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de tortricidae

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

O tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais, que causam sérias perdas agrícolas. Para entender a biologia dessas mariposas de pragas, técnicas fundamentais têm sido de alta demanda. Aqui, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares são desenvolvidos usando duas tortrix de chá, Homona magnanima e Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Os insetos foram criados em massa com dieta artificial fatiada e mantidos pela endogamia por mais de 100 gerações, considerando suas características biológicas. Insetos têm vários dimorfismos sexuais; portanto, é difícil distinguir o sexo durante os estágios de desenvolvimento, que impediram ensaios subsequentes. O presente trabalho destacou que o sexo das larvas de tortricóides poderia ser determinado observando testículos ou coloração de orceina láctica-actic para visualizar o cromossomo W específico feminino. Além disso, utilizando os métodos de determinação sexual, o presente estudo possibilitou extrações de ácido nucleico a partir de embriões determinados por sexo e aplicação para sequenciamento de alto rendimento. Essas dicas são aplicáveis para outros insetos pragas e facilitarão estudos morfológicos e genéticos.

Estabelecimento de linhas de hospedagem e sua manutenção A viabilidade das larvas coletadas em campo é diferentemente atribuída à localização do campo, estações e condições de criação (por exemplo, 90% da viabilidade em Taiwan, Taoyuan, como mostrado em Arai et al.12). Aproximadamente 30%-50% dos pares gerarão a próxima geração como de costume. Para H. magnanima e A. honmai, as matrilinas foram mantidas por endogamia por mais de 100 gerações.
<p class="jov...

O presente protocolo descreve o método de criação de insetos de peste tortricida nos laboratórios. Os procedimentos para distinguir o sexo dos insetos e extrair ácidos nucleicos para sequenciamento de alto rendimento são estabelecidos usando duas pragas tortricidas.

Criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de Tortricidae

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

Apresentamos massas fundamentais, mas altamente demandadas para criação em massa, observações e estudos moleculares usando massas tortrix de pragas graves, para estudar sua biologia. Até agora, a estrutura dos ovos de insetos impediu uma análise mais aprofundada. Notavelmente, possibilitamos o estudo de ovos finos, macios e frágeis cobertos pela secreção materna.Espera-se que sejam aplicáveis técnicas simples para novas pesquisas sobre tortrix, experimentando outros insetos e outros taxas. Comece colocando uma fêmea e dois machos em um copo de plástico de 120 mililitros com um pedaço de papel parafina para estabelecer uma linha de Matra. Corte aproximadamente 60 gramas de dietas artificiais usando um Ralador para criação em massa.Coloque a massa de ovos cheia de embriões maduros na dieta artificial fatiada em um recipiente plástico. Coloque papéis de parafina na massa de ovos com as dietas fatiadas. Coloque 15 machos e 10 fêmeas em uma caixa de plástico para acasalamento a 25 graus Celsius.Colete ovos a cada cinco a sete dias e repita etapas de criação em massa para cada geração. Mergulhe a massa de ovos em 1000 microlitres de 1,2% de solução aquosa hipoclorito de sódio por 10 minu

mass-rearing-and-molecular-studies-in-tortricidae-pest-insects

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Para alcançar a supressão populacional do Aedes aegypti usando o sistema RIDL® (Liberação de Insetos portadores de uma Letal Dominante), um grande número de mosquitos machos precisa ser liberado. Isso requer o uso de técnicas de criação em massa e tecnologia para fornecer sistemas confiáveis para obter o número máximo de mosquitos machos de alta qualidade.

Produção em massa de Aedes aegypti geneticamente modificado para lançamentos de campo no Brasil

Protocolos para preparação eficiente de amostras homogêneas de ácaros, infestação de plantas experimentais e avaliação de danos às plantas, como requerido para estudos de interação planta-praga foram desenvolvidos.

Aplicação de duas avistou Ácaro<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; De Estudos Planta-praga de Interação

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

Tabelas de vida permitem a quantificação das fontes e as taxas de mortalidade nas populações de insetos e contribuam para a compreensão, previsão e manipulação dinâmica populacional em agroecossistemas. São apresentados métodos para realização e análise de tabelas de vida baseada em coorte no campo para um inseto com estágios de vida imatura séssil.

Metodologia para desenvolvimento de tabelas de vida para insetos sésseis no campo utilizando a mosca branca, Bemisia tabaci, em algodão como um modelo de sistema

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

Este artigo descreve métodos básicos para padronizar fatores importantes como densidade, disponibilidade de ração, fonte de hidratação e controles ambientais para a criação a longo prazo de culturas laboratoriais do grilo comestível, Gryllus bimaculatus.

Mantendo culturas laboratoriais de Gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados

O protocolo demonstra um método de dissecação simples e fácil, adequado para fêmeas de insetos migratórios selvagens capturadas com armadilhas de holofotes. Esta técnica pode esclarecer significativamente a mesma espécie comparando ambos os tecidos reprodutivos, ou seja, o saco de acasalamento e o desenvolvimento ovariano de fêmeas de insetos selvagens.

Dissecção e classificação do desenvolvimento ovariano em fêmeas selvagens

Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.

Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

Aprenda técnicas de criação em massa e diferenciação sexual em insetos da família Tortricidae para estudos moleculares. Este método permite extrair ácidos nucleicos de alta qualidade para sequenciamento e avançar na biologia de pragas agrícolas.

Criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de Tortricidae

Explorar mais vídeos