Name: Fabricação de chip micro-padronizado com espessura controlada para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprenda a fabricar chips micro-padronizados com janelas de óxido de grafeno para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade. Esta técnica MEMS melhora a análise 3D de biomoléculas e nanomateriais.

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M.-H.K., S.K., M.L., e J.P. reconhecem o apoio financeiro do Instituto de Ciência Básica (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L., e J.P. reconhecem o apoio financeiro do Programa de Pesquisadores Pioneiros criativos através da Universidade Nacional de Seul (2021) e da bolsa NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant Nos. NRF-2020R1A2C2101871 e NRF-2021M3A9I4022936). M.L. e J.P. reconhecem o apoio financeiro da Posco Science Fellowship da POSCO TJ Park Foundation e da bolsa NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. reconhece o apoio financeiro da subvenção da NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2020R1A6C10183), e os Programas de Iniciativas Interdisciplinares de Pesquisa pela Faculdade de Engenharia e Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Seul (2021). M.-H.K. reconhece o apoio financeiro da subvenção da NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2020R1I1A0107416612). Os autores agradecem à equipe e à equipe do Centro Nacional universitário de Seul para Imagens Macromoleculares e Celulares (SNU CMCI) por seus esforços incansáveis e perseverança com os experimentos crio-EM. Os autores agradecem a S. J. Kim, do Centro Nacional de Instalações inter universitárias de Pesquisa, pela assistência aos experimentos fib-SEM.

1. Fabricação de chip micro-padronizado com janelas GO (Figura 1)
<ol><li>Deposite o nitreto de silício.<ol><li>Deposite nitreto de silício de baixo estresse (SixNy) em ambos os lados do wafer Si (4 polegadas de diâmetro e 100 μm de espessura) usando deposição de vapor químico de baixa pressão (LPCVD) a 830 °C e uma pressão de 150 mTorr, sob um fluxo de 170 sccm diclorosilane (SiH2Cl2, DCS) e amônia de 38 sccm (NH3).</li>
		<li>Usando uma taxa de deposição de ~30 Å/min, controle a espessura sixNy para estar dentro de 25-100 nm variando o tempo de deposição. NOTA: Deve-se tomar muito cuidado ao manusear o wafer Si porque o wafer é muito fino e frágil. Tome cuidado para não dobrar o wafer durante o manuseio ou carregamento no equipamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Padrone o fotoresist.<ol><li>Aplique uma solução de hexametiethyldisilazane (HMDS) no wafer SixNy-depositado si com volume suficiente para cobrir toda a superfície do wafer, gire casaco com um revestr de spin a 3.000 rpm por 30 s, e asse a 95°C por 30 s em uma placa quente para tornar a superfície hidrofóbica da superfície do wafer e, assim, garantir um bom desempenho de revestimento com fotoistres (PR).</li>
		<li>Aplique RP (Tabela de Materiais) positiva com volume suficiente para cobrir toda a superfície do wafer, gire o casaco a 3.000 rpm por 30 s e asse a 100 °C por 90 s em uma placa quente. Pr revestido de spin tem uma espessura de 500 nm.</li>
		<li>Exponha o wafer revestido de RP com luz ultravioleta (comprimento de onda de 365 nm e intensidade de20 mW/cm 2) por 5 s através de uma máscara de cromo (Figura 2A-D) usando um alinhador.</li>
		<li>Desenvolva o PR por 1 min usando um desenvolvedor (Tabela de Materiais) e enxágue o wafer imergindo-o em água deionizada (DI) 2x. Seque totalmente o wafer com padrão pr soprando gás N2 na superfície do wafer. NOTA: Deve-se tomar cuidado ao soprar gás N2 no wafer Si porque o wafer é muito fino e frágil. Não sopre gás N2 com alta pressão em direção perpendicular ao wafer, pois isso pode causar a fratura do wafer.</li>
	</ol></li>
	<li>Padre o SixNy.<ol><li>Etch o SixNy exposto seguindo a padronização do RP usando um íon reativo construído em laboratório etc(RIE), com 3 sccm de hexafluoreto de enxofre (SF6) a um poder de radiofrequência (RF) de 50 W. A taxa de gravação com essas configurações é de ~6 Å/s. Ajuste o tempo de gravação dependendo da espessura da camada SixNy depositada. NOTA: A taxa de gravação pode variar e precisa de otimização em laboratório, dependendo das especificações do equipamento RIE utilizado.</li>
		<li>Elimine o RP imergindo o wafer padrão SixNy em acetona à temperatura ambiente por 30 minutos, seguido por enxaguar o wafer imergindo-o em água DI 2x. Seque totalmente o wafer soprando gás N2 na superfície do wafer. NOTA: Devem ser tomados extremos cuidados ao mergulhar ou retirar o wafer das soluções porque o wafer pode ser fraturado pela tensão superficial da solução. Não mergulhe ou tire o wafer paralelamente à superfície da solução. Use pinças de manuseio de wafer de precisão com pontas de fibra de carbono. Não pegue fortemente o wafer com a pinça; levantar um lado do wafer até que o wafer se incline para um ângulo, onde ele pode ser retirado da solução. O wafer pode fraturar quando se curva devido à aderência firme durante o levantamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Etch the Si.<ol><li>Prepare uma solução de hidróxido de potássio de 1,5 M (KOH) dissolvendo o pó KOH em água DI a 80 °C.</li>
		<li>Mergulhe o wafer padrão SixNy na solução KOH para gravar o Si. Deixe o wafer na solução com agitação até que as janelas SixNy de pé livre possam ser observadas no lado oposto do padrão SixNy. NOTA: O tempo de gravação molhada pode diferir dependendo da espessura do Si; para um wafer de 100 μm de espessura, a gravura molhada normalmente leva várias horas. Não defina a velocidade de agitação muito alta durante a gravação de Si porque as janelas sixny de pé livre são muito finas e podem ser fraturadas pelo fluxo do fluido. Neste experimento, a taxa de agitação foi definida para 250 rpm.</li>
		<li>Limpe o wafer gravado mergulhando-o várias vezes em um banho d'água DI para eliminar resíduos de gravura. Seque o wafer no ar. NOTA: Devem ser tomados cuidados extremos ao mergulhar ou tirar o wafer padronizado Si das soluções porque as janelas sixny de pé livre são muito finas e frágeis e podem ser fraturadas pela tensão superficial da solução. O wafer deve ser imerso ou retirado em um ângulo, de tal forma que a borda do wafer entre e saia da solução primeiro.</li>
	</ol></li>
	<li>Elimine os resíduos de gravação KOH.<ol><li>Pressione levemente os limites da matriz de chips com uma pinça para obter uma matriz de chips que serão micro-padronizados (Figura 1B).</li>
		<li>Prepare a solução KOH de 1,5 M a 80 °C com agitação.</li>
		<li>Mergulhe a matriz de chips na solução KOH para 30 s e enxágue-a mergulhando-a em água DI 2x. Seque totalmente os chips soprando gás N2 . NOTA: Deve-se tomar muito cuidado ao mergulhar os chips em soluções e secá-los com gás N2 porque as janelas de sixny autônomos são muito finas e frágeis. Enquanto o chip está imerso na solução KOH, a agitação deve ser interrompida. Os chips devem ser mergulhados com suas bordas primeiro na direção perpendicular à solução e soprados com gás N2 na direção paralela.</li>
		<li>Seque totalmente a matriz do chip no ar por pelo menos 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Padrone o RP.<ol><li>Prepare um wafer si de 525 μm em branco como suporte sólido. Gire o wafer Si com HMDS e RP positivo, como descrito acima, mas conecte a matriz de chip (com o lado da janela sixny para cima) no wafer Si antes de assar o RP. O PR age como um adesivo entre o wafer e a matriz de chips. Asse o wafer Si anexado com a matriz de chip a 100 °C por 90 s em uma placa quente.</li>
		<li>Gire o conjunto de chips com HMDS e RP positivo, conforme descrito acima.</li>
		<li>Exponha o conjunto de chip com luz ultravioleta (comprimento de onda de 365 nm; intensidade de 20 mW/cm2) para 5 s através de uma máscara de cromo (Figura 2E,F) usando um alinhador.</li>
		<li>Desenvolva o RP usando um desenvolvedor para 15 s, enxágue o conjunto de chips mergulhando-o em água DI 2x, e seque totalmente o chip padrão pr definido soprando gás N2 .</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o micro-padronizado SixNy.<ol style="margin-left: 40px;"><li>Etch SixNy seguindo a padronização de RP usando um RIE construído em laboratório, com 3 sccm de gás SF6 em potência RF de 50 W. Controle o tempo de gravação dependendo da espessura da camada SixNy .</li>
	</ol></li>
	<li>Elimine o RP.<ol><li>Elimine o RP imergindo o conjunto de chip padronizado na solução 1-metil-2-pyrrolidina (NMP) a 60 °C e deixando-o durante a noite. Enxágüe o conjunto de chips mergulhando-o em água DI 2x, e seque totalmente o chip padronizado, soprando gás N2 .</li>
		<li>Elimine os resíduos de RP com um processo de plasma O2 usando 100 sccm O2 gás em rf potência de 150 W por 1 min com o RIE construído em laboratório.</li>
	</ol></li>
	<li>Enxágüe o chip micro-padronizado.<ol><li>Prepare a solução KOH de 1,5 M a 80 °C.</li>
		<li>Mergulhe os chips micro-padronizados na solução KOH por 30 s para eliminar totalmente os resíduos de RP e enxaguar os chips imergindo-os em água DI 2x. Seque totalmente os chips soprando gás N2 .</li>
		<li>Seque totalmente as lascas no ar por pelo menos 1h.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira óxido de grafeno (GO) pelo método de fundição de gotas.<ol><li>Solução DILuir GO (2 mg/mL) a 0,2 mg/L com água DI e sonicato por 10 minutos para quebrar agregados de folhas GO. Centrifugar a solução GO diluída a 300 x g para 30 s.</li>
		<li>Descarregue o lado gravado do chip micro-padronizado para tornar a superfície do chip com carga positiva usando um descarga de brilho (Tabela de Materiais) a 15 mA por 1 min.</li>
		<li>Solte 3 μL da solução GO no lado descarado do chip micro-padronizado e deixe a gota no chip por 1 min. Depois de 1 min, limpe a solução GO em excesso no chip com papel filtro.</li>
		<li>Lave o chip transferido para GO com gotículas dI preparadas em filme de parafina e limpe a água DI no chip com papel filtro. Repita este procedimento 2x no lado transferido go e 1x no lado oposto. Seque o chip transferido por GO à temperatura ambiente durante a noite.</li>
		<li>Lave o chip micro-padronizado com janelas GO, imergindo-o na água DI e seque o chip com gás N2 .</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imagem Cryo-EM
<ol><li>Prepare a crio-amostra.<ol><li>Prepare a crio-amostra usando uma máquina mecânica de mergulho crio-mergulhador (Tabela de Materiais), que controla a temperatura, a umidade, o tempo de mancha e a força. Depois de carregar a almofada de manchas nas manchas, certifique-se de que a umidade e a temperatura na câmara sejam mantidas a 100% e 15 °C, respectivamente.</li>
		<li>Pegue o chip micro-padronizado com uma pinça crio-doce típica e carregue a pinça para a máquina de mergulho crio-. Pipet 3 μL de solução de amostra para o chip micro-padronizado no lado padrão do orifício, com janelas GO na parte inferior. Controle o tempo e a força de manchas dependendo da solução amostral. NOTA: Aqui, foram utilizados espécimes biológicos, ou seja, vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), ferritina, proteasome 26S, groEL, partículas de proteína de apoferritina e proteínas de filamento foram usadas para imagens crio-EM. Além disso, diversos tipos de materiais inorgânicos, como nanopartículas Fe2O3 (NP), nanopartículas Au, nanorods Au e nanopartículas de sílica, foram utilizados para imagens crio-EM. O tempo e a força desejados foram colocados no êmbolo criogeno para diferentes tipos de amostras.</li>
		<li>Após o processo de desinchar, congele o chip carregado com amostras imediatamente em etano líquido. Transfira o chip para a caixa de grade em nitrogênio líquido (LN2) e armazene-o na LN2 antes da imagem crio-EM.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize imagens crio-EM.<ol><li>Carregue a crio-amostra em um suporte crio-EM com a temperatura mantida a -180 °C.</li>
		<li>Carregue o suporte crio-EM em um TEM e observe as amostras com o modo de sistema de dose mínima (MDS).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Os processos de microfabização para a produção de chips micro-padronizados com janelas GO são introduzidos aqui. O chip micro-padronizado fabricado foi projetado para regular a espessura da camada de gelo vítreo, controlando a profundidade do micro-buraco com janelas GO, dependendo do tamanho do material a ser analisado. Um chip micro-padronizado com janelas GO foi fabricado usando uma série de técnicas MEMS e um método de transferência de nanofolha 2D (Figura 1). A maior vantagem do uso da ...

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) foi desenvolvida para resolver a estrutura tridimensional (3D) de proteínas em seu estado natal 1,2,3,4. A técnica envolve a fixação de proteínas em uma camada fina (10-100 nm) de gelo vítreo e a aquisição de imagens de projeção de proteínas orientadas aleatoriamente usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM), com a amostra mantida à temperatura de nitrogênio líquido. Milhares a milhões de imagens de projeção são adquiridas e usadas para reconstruir uma estrutura 3D da proteína por algoritmos computacionais 5,6. Para uma análise bem-sucedida com crio-EM, a preparação crio-amostra foi automatizada por meio do congelamento do equipamento que controla as condições de mancha, umidade e temperatura. A solução amostral é carregada em uma grade TEM com uma membrana de carbono furada, sucessivamente borrada para remover a solução em excesso, e, em seguida, mergulha-congelada com etano líquido para produzir gelo fino e vítreo 1,5,6. Com os avanços da crio-EM e a automação da preparação da amostra7, a crio-EM tem sido cada vez mais utilizada para resolver a estrutura de proteínas, incluindo proteínas envelope para vírus e proteínas do canal de íons na membrana celular 8,9,10. A estrutura das proteínas envelope de partículas virais patogênicas é importante para a compreensão da patologia da infecção viral, bem como para o desenvolvimento do sistema de diagnóstico e vacinas, por exemplo, SARS-CoV-211, que causou a pandemia COVID-19. Além disso, técnicas crio-EM foram recentemente aplicadas às ciências materiais, como para materiais sensíveis ao feixe de imagem utilizados na bateria 12,13,14 e sistemas catalíticos 14,15 e análise da estrutura de materiais inorgânicos em estado de solução16.
Apesar dos desenvolvimentos perceptíveis em crio-EM e técnicas relevantes, existem limitações na preparação da criom amostra, dificultando a análise da estrutura 3D de alto rendimento. Preparar um filme de gelo vítreo com espessura ideal é especialmente importante para a obtenção da estrutura 3D de materiais biológicos com resolução atômica. O gelo deve ser fino o suficiente para minimizar o ruído de fundo de elétrons espalhados pelo gelo e proibir sobreposições de biomoléculas ao longo do caminhodo feixe de elétrons 1,17. No entanto, se o gelo é muito fino, pode fazer com que moléculas de proteínas se alinhem em orientações preferenciais ou desnaturais 18,19,20. Portanto, a espessura do gelo vítreo deve ser otimizada dependendo do tamanho do material de interesse. Além disso, um esforço extensivo é normalmente necessário para a preparação da amostra e a triagem manual da integridade do gelo e da proteína nas grades TEM preparadas. Esse processo é extremamente demorado, o que dificulta sua eficiência para análise de estrutura 3D de alto rendimento. Portanto, melhorias na confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM aumentariam a utilização da crio-EM na biologia estrutural e na descoberta de medicamentos comerciais, bem como na ciência material.
Aqui, introduzimos processos de microfabização para a fabricação de um chip micro-padronizado com janelas de óxido de grafeno (GO) projetados para crio-EM de alta produtividade com espessura de gelo controlada21. O chip micro-padronizado foi fabricado usando técnicas de sistema microeletromecânico (MEMS), que podem manipular a estrutura e as dimensões do chip dependendo dos propósitos de imagem. O chip micro-padronizado com janelas GO tem uma estrutura de microwell que pode ser preenchida com a solução de amostra, e a profundidade da microwell pode ser regulada para controlar a espessura do gelo vítreo. A forte afinidade do GO com as biomoléculas aumenta a concentração de biomoléculas para visualização, melhorando a eficiência da análise da estrutura. Além disso, o chip micro-padronizado é composto por um quadro Si, que proporciona alta estabilidade mecânica para a grade19, tornando-o ideal para manusear o chip durante os procedimentos de preparação da amostra e imagens crio-EM. Portanto, um chip micro-padronizado com janelas GO fabricadas por técnicas MEMS fornece confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM, que pode permitir uma análise eficiente e de estrutura de alto rendimento com base no crio-EM.

<table><tbody><tr><td>1-metil-2-pirrolidinona (NMP)</td><td>Sigma Aldrich, EUA</td><td>443778</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM</td><td>Park Systems, Coreia do Sul</td><td>NX-10</td><td></td></tr><tr><td>Aligner</td><td>Midas System, Coreia do Sul</td><td>MDA-600S</td><td></td></tr><tr><td>AZ 300 MIF desenvolvedor</td><td>AZ Electronic Materials USA Corp., EUA</td><td>184411</td><td></td></tr><tr><td>Suporte</td> <td>Cryo-EMGatan, EUA</td><td>626 suporte crio-EM de inclinação única</td> Máquina de mergulho criogênico Thermo Fisher SCIENTIFIC, EUA Vitrobot Mark IV Microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizados (FIB-SEM)FEI Company, EUA Helios NanoLab 650 Descarregador de brilho Ted Pella Inc., EUA PELCO easiGlow Solução de óxido de grafeno (GO) Sigma Aldrich, EUA <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>763705</tr><tr><td>Hexametildisizazne (HMDS), 98+%</td><td>Alfa Aesar, EUA</td><td>10226590</td><td></td></tr><tr><td>Deposição química de vapor de baixa pressão (LPCVD)</td><td>Centrotherm, Alemanha</td><td>LPCVD E1200</td><td></td></tr><tr><td>maP1205 PR positivo</td><td>Micro resist technology, Alemanha</td><td>A15139</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH), floco</td><td>DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., Coreia do Sul</td><td>6597-4400</td><td></td></tr><tr><td>Raman Espectrômetro</td><td>NOST, Coreia do Sul</td><td>Confocal Micro Raman System HEDA</td><td></td></tr><tr><td>Reactive ion etcher (RIE)</td><td>Engenharia Científica, Coreia do Sul</td> SEM <td>Carl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td> construído em laboratório, Alemanha <td>SUPRA 55VP</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>JP COMMERCE, Coreia</td><td></td> do Sul <td>4" Bolacha de silício, tipo P(B), (100), 1-30ohm.c m, DSP, T: 100um</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Dong Ah Trade Corp., Coreia do Sul</td><td>ACE-200</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL, Japão</td><td>JEM-2100F</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de chip micro-padronizado com espessura controlada para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade

Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy

Uma grande limitação para a análise eficiente e de estrutura de alto rendimento de biomoléculas usando microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) é a dificuldade de preparar amostras crio-EM com espessura de gelo controlada na nanoescala. O chip à base de silício (Si), que tem uma matriz regular de micro-buracos com janela de óxido de grafeno (GO) padronizado em um filme de nitreto de silício controlado pela espessura (SixNy), foi desenvolvido aplicando técnicas de sistema microeletrocrânico (MEMS). Fotolitografia UV, deposição de vapor químico, gravura molhada e seca do filme fino e lançamento de materiais de nanofolha 2D foram usados para a produção em massa dos chips micro-padronizados com janelas GO. A profundidade dos micro-buracos é regulada para controlar a espessura do gelo sob demanda, dependendo do tamanho do espécime para análise crio-EM. A afinidade favorável do GO em relação às biomoléculas concentra as biomoléculas de interesse dentro do microrifício durante a preparação da amostra crio-EM. O chip micro-padronizado com janelas GO permite imagens crio-EM de alto rendimento de várias moléculas biológicas, bem como nanomateriais inorgânicos.

Um chip micro-padronizado com janelas GO foi fabricado pela fabricação mems e transferência de nanofolha 2D GO. Os chips para micro-padronização foram produzidos em massa, com cerca de 500 chips produzidos a partir de um wafer de 4 polegadas (Figura 1B e Figura 2A,B). Os desenhos dos chips micro-padronizados podem ser manipulados usando diferentes desenhos da máscara de cromo (Figura 2) durante o procedimento de fot...

Um chip micro-padronizado recém-desenvolvido com janelas de óxido de grafeno é fabricado aplicando técnicas de sistema microeletromecânico, permitindo imagens eficientes e de microscopia criogênica de elétrons de vários biomoléculas e nanomateriais.

Fabricação de chip micro-padronizado com espessura controlada para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade

A major limitation for the efficient and high-throughput structure analysis of biomolecules using cryogenic electron microscopy (cryo-EM) is the ...

Este protocolo é importante para regular a espessura do tamanho da imagem na escala nano para observar com sucesso proteínas e nano materiais de diferentes tamanhos usando crio EM. A técnica de fabricação do Mem permite a produção em massa do microchip. Também permite a seleção de profundidades e desenhos dos poços de micro padrão. Dependendo dos propósitos experimentais.A técnica pode contribuir para aumentar a eficiência da análise de estrutura 3D de alta produtividade das biomoléculas que é utilizada para a descoberta de drogas comerciais, e então wafers finos e microchips com membranas nitro de silício que tendem ao risco podem ser complicados. É importante não dobrar o wafer ou aplicar forças perpendiculares à janela de nitrato de silício. Comece a padronizar a resistência fotográfica, ou RP cobrindo um wafer de silício depositado em nitreto de silício com solução de hexametiletiladisilazane e, em seguida, gire o revestimento do wafer a 3000 RPM por 30 segundos em um codificador de giro.Asse o wafer revestido a 95 graus Celsius por 30 segundos em uma placa quente para tornar a superfície da água hidrofóbica e garantir um bom desempenho de revestimento com o RP. Em seguida, gire o wafer com um RP positivo e assá-lo 100 graus Celsius por 90 segundos. Uma RP revestida de spin tem uma espessura de 500 nanômetros. Exponha o wafer revestido de RP à luz ultravioleta por cinco segundos através de uma máscara de cromo usando um alinhador.Desenvolva o RP por um minuto usando um desenvolvedor e enxágue duas vezes, imergindo o wafer em água desionizada. Em seguida, seque o wafer padrão pr soprando gás nitrogênio na superfície da água. Seguindo a padronização do RP. Use um íon reativo construído em laboratório, etcher com uma potência de radiofrequência de 50 watts, e com gás hexafluoreto de enxofre a três centímetros cúbicos padrão por minuto.Para gravar o nitreto de silício exposto à taxa de seis angstroms por segundo. Elimine o RP imergindo o wafer padrão de nitreto de silício em acetona à temperatura ambiente por 30 minutos. Seguido por enxaguar o wafer duas vezes em água deionizada e secar o wafer com gás nitrogênio.Para gravar o si exposto, mergulhe o wafer padrão de nitreto de silício em solução de hidróxido de potássio recém-preparada. Com agitação contínua até que as janelas de nitreto de silício de pé livre possam ser observadas no lado oposto do wafer padronizado. Limpe o wafer gravado mergulhando-o várias vezes em um banho de água deionizado.Em seguida, seque o wafer no ar. Para eliminar os resíduos de gravação, pressione levemente os limites da matriz de chips com uma pinça e obtenha uma matriz de chips para ser micro padronizado. Em seguida, mergulhe a matriz de chips em solução de hidróxido de potássio recém-preparada por 30 segundos, seguida por enxaguar duas vezes, soprar os chips com gás nitrogênio e secá-los no ar por uma hora.Para suporte sólido, prepare um wafer de silício em branco de 525 micrômetros com o revestimento de spin, como demonstrado anteriormente. Anexado ao raio de triturador no wafer de silício antes de assar o wafer e seguir o procedimento como descrito anteriormente para obter o wafer de silício de micropattern. Elimine o RP imergindo o chip padrão definido em uma solução de littanol puro de metil dois a 60 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, enxágue o conjunto de chips duas vezes com água deionizada. Depois de secar o chip padrão com nitrogênio, elimine os resíduos de RP com um processo de plasma de oxigênio usando 100 centímetros cúbicos padrão por minuto de gás oxigênio a uma potência de radiofrequência de 150 watts por um minuto com o íon reativo etcher. Mais tarde, mergulhe os chips micro padronizados na solução de hidróxido de potássio por 30 segundos para eliminar totalmente os resíduos de RP.Em seguida, enxágue e seque completamente o conjunto de chips. Diluir dois miligramas por óxido de grafeno mililitro ou solução 10 dobras com água deionizada e sonicar a solução diluída por 10 minutos para quebrar os agregados das folhas. Em seguida, centrifugar para a solução diluída a 300 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente.Use um descarregador de brilho a 15 milhões de amperes para glow descarregar o lado gravado de silício do chip micro padrão por um minuto e tornar a superfície do chip com uma carga positiva. Quando terminar, solte três microliters da solução no lado de descarga de brilho do chip de micropattern. Após um minuto, borre a solução em excesso no chip com papel filtro.Lave o chip transferido com gotículas de água deionizadas em um filme de parafina e borre o excesso com papel filtro. Repita o procedimento de fundição de queda duas vezes no lado transferido e uma vez no lado oposto. Seque o chip transferido à temperatura ambiente durante a noite.Durante o procedimento de fotolitografia, os desenhos dos chips de micro padrão foram manipulados usando diferentes desenhos da máscara de cromo. Os números e as dimensões das membranas de nitreto de silício de pé livre foram controlados. Observou-se que os chips micro padronizados fabricados poderiam ter até 25.000 buracos suspensos.O espectro de ramen na janela exibia os picos representativos do Além disso, os padrões de defração hexagonal multiplicados indicavam que as janelas consistiam na multicamadas A estrutura e a profundidade do micro buraco com janelas foram estudadas com microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. Uma estrutura bem tipo do micro orifício com a janela foi observada nas imagens confirmando a possibilidade do design do chip micro padrão com janelas. Com a ajuda do chip micro padronizado, alguns espécimes biológicos e nanopartículas inorgânicas foram imagens com o microscópio eletrônico crio.Otimizar as condições como a espessura do revestimento puro usando intensidade e tempo de desenvolvimento para micro padronização dependendo do tamanho e design dos padrões é importante. Aplicando técnicas de nano pattering, como FIB ou mesmo litho grafeno, alguns padrões de micrômetros podem ser produzidos, o que pode expandir as aplicações deste micro dispositivo onde é usado com outras técnicas analíticas.

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Engenharia

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