Name: Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a estabelecer xenoenxertos derivados de pacientes em zebrafish para testar quimiosensibilidade em câncer de pâncreas. Este modelo preserva o microambiente tumoral e prevê respostas ao tratamento em uma semana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pela Fondazione Pisa (projeto 114/16). Os autores agradecem a Raffaele Gaeta, da Unidade de Histopatologia da Azienda Ospedaliera Pisana, pela seleção da amostra e apoio anatomopatológico. Agradecemos também a Alessia Galante pelo suporte técnico nos experimentos. Este artigo baseia-se no trabalho da COST Action TRANSPAN, CA21116, apoiado pela COST (Cooperação Europeia em Ciência e Tecnologia).

O Ministério da Saúde Pública italiano aprovou todas as experiências com animais descritas, em conformidade com a Diretiva 2010/63/UE relativa à utilização e aos cuidados a prestar aos animais. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local, sob o registro número 70213. Consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos envolvidos. Antes de começar, todas as soluções e equipamentos devem ser preparados (secção 1) e os peixes devem ser cruzados (secção 2).
1. Preparação de soluções e equipamentos
NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter as soluções e os meios a serem preparados.
<ol><li>Suporte em gel de agarose<ol><li>Pesar o pó de agarose num balão micro-ondulável e dissolvê-lo num determinado volume de meio de zebrafish E3 para fazer um gel a 1%. Aqueça no micro-ondas até que a agarose esteja completamente dissolvida. NOTA: Não sobreferva a solução.</li>
		<li>Despeje a agarose derretida em uma placa de Petri e espere até que o gel se solidifique completamente.</li>
		<li>Faça pequenos cilindros de agarose (~5 mm de altura) usando uma pipeta plástica Pasteur com a ponta cortada. Depois de preparado, armazenar em uma placa de Petri a 4 °C envolto em papel alumínio.</li>
	</ol></li>
	<li>Microagulhas de vidro<ol><li>Puxe os capilares de vidro borossilicato com um extrator para obter agulhas finas (configurações: HEAT 990, PULL 550). OBS: A partir de um capilar, é possível obter duas agulhas finas com diâmetro de ponta de 10 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cruzamento de peixes e coleta de ovos
<ol><li>Transferir peixes adultos para tanques de reprodução 3 dias antes da implantação do tecido, conforme descrito por Avdesh et al.17.</li>
	<li>NOTA: Recomenda-se uma proporção de 1:1 ou 2:3 machos para fêmeas. A densidade de peixes deve ser de, no máximo, cinco peixes por litro de água. Mantenha machos e fêmeas separados com uma barreira durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, remova a barreira e deixe o peixe acasalar.</li>
	<li>Retire os peixes dos tanques de reprodução e devolva-os aos tanques de alojamento.</li>
	<li>Despeje a água do tanque de reprodução através de uma rede de malha fina. Transfira os ovos fertilizados para uma placa de Petri com meio de zebrafish E3.</li>
	<li>Verifique a placa de Petri com um estereomicroscópio e descarte os ovos turvos. Manter os ovos fertilizados em meio fresco de zebrafish E3 a 28 °C.</li>
</ol>3. Coleta de espécimes
OBS: Pinça de autoclave e cabo de bisturi.
<ol><li>Processamento imediato<ol><li>Coletar a peça cirúrgica do tumor em 10 mL de meio tumoral a 4 °C (espécime tumoral variando de 5 mm a 10 mm de diâmetro). Transfira a amostra a 4 °C do local desejado para processamento imediato.</li>
	</ol></li>
	<li>Armazenamento durante a noite (opcional)<ol><li>Coletar o espécime cirúrgico do tumor em 10 mL de meio tumoral e armazenar a amostra durante a noite a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Armazenamento a -80 °C (opcional, menos recomendado)<ol><li>Conservar a amostra a -80 °C num frasco para injetáveis criogénico com meio tumoral suplementado com 5% de dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Processamento da amostra
NOTA: Execute as etapas sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecido estéril.
<ol><li>Lavar todo o tecido tumoral com 5 mL de meio tumoral fresco, pipetando para cima e para baixo 10x usando uma pipeta plástica de Pasteur. Aspirar e descartar o meio de lavagem. Repita esta etapa 3x. NOTA: Evitar a aspiração do tecido tumoral, pois este poderia permanecer aderido à pipeta plástica de Pasteur.</li>
	<li>Transfira a amostra em uma placa de Petri e mergulhe-a em 1-2 mL de meio tumoral fresco. Cortar a amostra tumoral em pequenos pedaços (1-2 mm3) com uma lâmina de bisturi e colocá-los em um tubo plástico estéril de 5 mL com meio tumoral.</li>
	<li>Ajuste o cortador de tecido McIlwain para 100 μm de espessura. Coloque os fragmentos do espécime na mesa circular de plástico do picador e pique-os. Gire a mesa em 90° e repita o corte.</li>
	<li>Centrifugar os fragmentos a 300 × g por 3 min. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e descartá-lo.</li>
	<li>Incubar os fragmentos com um rastreador de células fluorescentes, CM-DiI (concentração final de 10 μg/mL no soro fisiológico tamponada com fosfato de Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentração final de 1 μL/mL em DPBS) ou CellTrace (concentração final de 5 μM em DPBS) por 30 min, colocando o tubo em banho-maria a 37 °C.</li>
	<li>Ressuspenda os fragmentos pipetando suavemente para cima e para baixo a cada 10 min. NOTA: No caso de CellTrace, adicionar meio contendo pelo menos 1% de proteína no final da incubação, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g por 3 min e descartar o sobrenadante. Repita esta etapa 3x com 1 mL de DPBS para remover o corante não incorporado.</li>
	<li>Suspender os fragmentos em 5 mL de DPBS em placa de Petri de 60 mm. NOTA: Certifique-se de que o tecido não seca.</li>
</ol>5. Criação do zPDX
NOTA: Execute as etapas sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecido estéril.
<ol><li>Anestesiar os embriões 2 dias pós-fertilização (dpf) com 0,16 mg/mL de tricaína em meio de zebrafish E3.</li>
	<li>Colocar três cilindros de agarose (passo 1.1.3) numa placa de Petri e colocar um embrião de peixe-zebra num cilindro, expondo um dos lados. Retire o excesso de solução para manter o embrião em apenas uma película fina.</li>
	<li>Transfira o pedaço de tecido corado com pinça estéril da placa de Petri para o suporte de agarose a 1% onde o embrião está deitado. Pegar no tecido, colocá-lo em cima da gema do embrião e, em seguida, empurrá-lo para o espaço perivitelino usando a microagulha de vidro puxada pelo calor (passo 1.2.1).</li>
	<li>Adicione suavemente algumas gotas de E3 1% penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) ao embrião para trazê-lo de volta ao líquido.</li>
	<li>Repetir os passos 5.2-5.4 para todos os embriões e, finalmente, remover os suportes de agarose da placa de Petri e incubar os embriões a 35 °C.</li>
	<li>Verificar os embriões quanto aos xenoenxertos corretos (coloração positiva) 2 h após a implantação utilizando um estereomicroscópio fluorescente. Descarte os embriões com fragmentos tumorais que não estejam completamente dentro do espaço perivitelino, assim como os embriões mortos. Distribuir aleatoriamente os embriões em seis placas multipoços (máximo n = 20 embriões/poço), igualmente divididos em grupos de acordo com o plano experimental (e.g., controle e FOLFOXIRI).</li>
</ol>6. Tratamento
<ol><li>Diluir o medicamento (por exemplo, 5-fluorouracila, oxaliplatina, irinotecano) em E3 1% Pen-Strep, misturando completamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Conforme proposto por Usai et al.12, utilizar uma diluição de cinco vezes do fármaco na água do peixe, com relação à concentração plasmática equivalente (CPE).</li>
	<li>Misture os medicamentos para preparar o coquetel (por exemplo, FOLFOXIRI).</li>
	<li>Retire o meio de cada poço e adicione o coquetel de drogas 2 h após o implante.</li>
	<li>Tratar os embriões por 3 dias. Renove o coquetel de drogas todos os dias.</li>
</ol>7. Coloração imunofluorescente de montagem total
NOTA: Antes de começar, colocar acetona a -20 °C e preparar as soluções indicadas no quadro 1.
<ol><li>Dia 1:<ol><li>Fixar as larvas com 1 ml de paraformaldeído a 4% em frascos para injetáveis de vidro a 4 °C durante a noite.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2:<ol><li>Lavar as larvas 3 x 5 min com 1 mL de PBS, agitando suavemente em um balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).</li>
		<li>Conservar em 1 ml de metanol a 100% a -20 °C durante a noite (ou para armazenamento a longo prazo).</li>
		<li>Reidratar 3 x 10 min com 1 mL de PTw (0,1% de interpolação em PBS), agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).</li>
		<li>Permeabilizar com 1 mL de Tris-HCl 150 mM pH 8,8 por 5 min em TR, seguido de aquecimento por 15 min a 70 °C.</li>
		<li>Lavar 2 x 10 min com 1 mL de PTw, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).</li>
		<li>Lavar 2 x 5 min com 1 mL de dH2O, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).</li>
		<li>Permeabilizar com 1 mL de acetona gelada por 20 min a -20 °C.</li>
		<li>Lavar 2 x 5 min com 1 mL de dH2O, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).</li>
		<li>Lavar 2 x 5 min com 1 mL de PTw, agitando suavemente em um balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).</li>
		<li>Incubar as larvas em 1 mL de tampão de bloqueio por 3 h a 4 °C, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).</li>
		<li>Coloque as larvas em placas de poço divididas por grupo da seguinte forma: 10 larvas em 50 μL de volume/poço em uma placa de 96 poços ou 20 larvas em 100 μL de volume/poço em uma placa de 48 poços.</li>
		<li>Descarte o tampão de bloqueio, incube as larvas com solução primária de anticorpos (por exemplo, caspase-3 clivada anti-humana de coelho, 1:250) diluída em tampão de incubação durante a noite a 4 °C no escuro e balançar suavemente em uma placa agitadora (400 rpm). Consulte a etapa 7.2.11 para obter os volumes recomendados.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 3:<ol><li>Lavar as larvas sequencialmente 3 x 1 h com 1 mL de PBS-TS (10% de soro de cabra, 1% Triton X-100 em PBS) e, em seguida, com 2 x 10 min com 1 mL de PBS-T (1% Triton X-100 em PBS) e 2 x 1 h com 1 mL de PBS-TS. Em cada lavagem, agite suavemente as placas contendo as larvas em uma placa agitadora (400 rpm).</li>
		<li>Incubar as larvas com anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente (por exemplo, Anticorpo Secundário Associado Cruzado IgG [H+L] de Cabra anti-Coelho, Alexa Fluor 647, 1:500) e 100 μg/mL Hoechst 33258 diluído em tampão de incubação no escuro durante a noite a 4 °C, com agitação suave em uma placa agitadora (400 rpm). Ver passo 7.2.11 para volumes recomendados de solução de anticorpos secundários.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 4:<ol><li>Lavar 3 x 1 h com 1 mL de PBS-TS e 2 x 1 h com 1 mL de PTw, com agitação suave em uma placa agitadora (400 rpm).</li>
		<li>Crie uma camada circular com o esmalte (espessura de ~0,5-1 mm) em lâminas de microscópio. Deixe o esmalte secar e coloque as larvas no centro da camada circular, expondo o lado do xenoenxerto.</li>
		<li>Seque o excesso de solução e monte a lamínula de vidro com um meio de montagem solúvel em água e não fluorescente.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Exames por imagem
<ol><li>Captura de imagens em microscopia confocal com objetiva de 40x. Use os seguintes parâmetros de aquisição: resolução de 1024 x 512 pixels com espaçamento Z de 5 μm.</li>
</ol>9. Análise da apoptose pelo ImageJ
<ol><li>Carregue o software ImageJ (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) e abra a imagem do arquivo Z-stack (clique em Arquivo | Aberto). Na janela pop-up, selecione Visualização de pilha/Hyperstack e clique em OK.</li>
	<li>Sobreponha os diferentes canais selecionando Imagem | Cor | Faça Composto.</li>
	<li>Arraste a barra Z na parte inferior da imagem para navegar pela imagem da pilha Z e identificar a área de xenoenxerto (células que são positivas para rastreador de células fluorescentes. Ver passo 4.5) no espaço perivitelina do peixe-zebra.</li>
	<li>Selecione Point Tool e conte o número de células humanas apoptóticas (positivo para fluorescente cell tracker e clived caspase-3), conforme mostrado no Vídeo Suplementar S1.</li>
	<li>Clique duas vezes no ícone da ferramenta Ponto , altere o contador e conte o número total de núcleos de células humanas (núcleos de células positivas para CM-DiI).</li>
</ol>

<ol><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li>
<li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2022%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
<li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li>
<li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer-A+disease+in+need%3A+Optimizing+and+integrating+supportive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li>
<li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+Treatment+hurdles%2C+tumor+microenvironment+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastrointestinal+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li>
<li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+vs.+organoids%3A+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output%2C+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923(2020).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+models%3A+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178(2021).</li>
<li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131(2021).</li>
<li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677(2020).</li>
<li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551(2021).</li>
<li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229(2017).</li>
<li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment%3A+interplay+in+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077(2021).</li>
<li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+patient-derived+xenografts%3A+the+best+laid+plans+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li>
<li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+%28CAFs%29+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li>
<li>Strähle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Modelos in vivo na pesquisa do câncer fornecem ferramentas inestimáveis para entender a biologia do câncer e prever a resposta ao tratamento do câncer. Atualmente, diferentes modelos in vivo estão disponíveis, por exemplo, animais geneticamente modificados (camundongos transgênicos e knockout) ou xenoenxertos derivados de pacientes a partir de células primárias humanas. Apesar de muitas características ideais, cada um tem várias limitações. Em particular, os modelos acima mencionados carecem de uma mane...

Um dos problemas da pesquisa clínica do câncer é que o câncer não é uma doença única, mas uma variedade de doenças diferentes que podem evoluir ao longo do tempo, exigindo tratamentos específicos dependendo das características do próprio tumor e do paciente1. Consequentemente, o desafio é avançar em direção à pesquisa do câncer orientada ao paciente, a fim de identificar novas estratégias personalizadas para a predição precoce dos resultados do tratamento do câncer2. Isso é particularmente relevante para o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), por ser considerado um câncer de difícil tratamento, com sobrevida em 5 anos de 11%3.
O diagnóstico tardio, a rápida progressão e a falta de terapias eficazes continuam sendo os problemas clínicos mais prementes da ADP. O principal desafio é, portanto, modelar o paciente e identificar biomarcadores que possam ser aplicados na clínica para selecionar a terapia mais eficaz de acordo com a medicina personalizada 4,5,6. Ao longo do tempo, novas abordagens têm sido propostas para modelar doenças oncológicas: organoides derivados do paciente (PDOs) e xenoenxertos derivados do paciente de camundongo (mPDXs) originados de uma fonte de tecido tumoral humano. Eles têm sido usados para reproduzir a doença para estudar a resposta e a resistência à terapia, bem como a recorrência da doença 7,8,9.
Da mesma forma, o interesse em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (zPDX) baseado em peixe-zebra tem aumentado, graças às suas características únicas epromissoras10, representando uma ferramenta rápida e de baixo custo para a pesquisa docâncer11,12. Os modelos zPDX requerem apenas um pequeno tamanho de amostra tumoral, o que torna viável o rastreamento de quimioterapiaem alto rendimento13. A técnica mais comumente utilizada para modelos zPDX baseia-se na digestão completa da amostra e implantação das populações celulares primárias, que reproduz parcialmente o tumor, mas tem como desvantagens a falta de microambiente tumoral e crosstalk entre células malignas esaudáveis14.
Este trabalho mostra como zPDXs podem ser usados como um modelo pré-clínico para identificar o perfil de quimiossensibilidade de pacientes com câncer de pâncreas. A valiosa estratégia facilita o processo de xenoenxerto, uma vez que não há necessidade de expansão celular, permitindo a aceleração da triagem quimioterápica. A força do modelo é que todos os componentes do microambiente são mantidos como estão no tecido do paciente com câncer, pois, como se sabe, o comportamento do tumor depende de sua interação15,16. Isso é altamente favorável em relação aos métodos alternativos na literatura, pois é possível preservar a heterogeneidade tumoral e contribuir para melhorar a previsibilidade do resultado do tratamento e a recidiva de forma paciente-específica, permitindo que o modelo zPDX seja utilizado em ensaios coclínicos. Este artigo descreve as etapas envolvidas na confecção do modelo zPDX, começando com um pedaço de ressecção tumoral do paciente e tratando-o para analisar a resposta à quimioterapia.

<table><tbody><tr><td>5-fluorouracil</td><td>Teva Pharma AG</td><td>SMP 1532755</td><td></td></tr><tr><td>48 placa multipoços</td><td>Sarstedt</td><td>83 3923</td><td></td></tr><tr><td>96 placa multipoços</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Agarose em pó&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nuclei Anticorpo, clone 235-1</td><td>Merck</td><td>MAB1281&nbsp;</td><td>Diluição 1:200</td></tr><tr><td>Rede de aquário QN6</td><td>Penn-plax</td><td>0-30172-23006-6</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34567</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Vermelho Profundo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Tecnologia</td><td>de Sinalização de Células</td> mAb de Coelho <td>9661S</td><td>diluição 1:250</td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Pinça PanReac AppliChem ITW Reagents</td><td>A3672,0250</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico -&nbsp; Capilares de vidro Lederfolin</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 3.5"</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Diâmetro externo = 1.14 mm. Diâmetro interno = 0.53 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de vidro&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>WHEAW224581</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho&nbsp; IgG&nbsp; (H + L) Anticorpo Secundário Cruzado Adsorvido, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21244&nbsp; &nbsp;</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Irinotecan</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos de freezer de baixa temperatura</td><td>VWR International</td><td>479-1220</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador</td> <td>de microplacasSCILOGEX</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Oxaliplatina</td><td>Teva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp;</td>Placa de Petri <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3902500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3901</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de plástico Pasteur</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Mount</td><td>Tebu-bio</td><td>18606-5</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Merck</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi No 10 Aço inoxidável estéril</td> Cabo de bisturi <td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>#3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Merck</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Micropipeta Vertical</td><td>Instrumento de Obturador</td><td>P-30&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento de xenoenxertos derivados de pacientes com zebrafish de câncer de pâncreas para teste de quimiosensibilidade

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, e a incidência de muitos tipos de câncer continua aumentando. Muito se avançou em termos de rastreio, prevenção e tratamento; no entanto, ainda faltam modelos pré-clínicos que predizem o perfil quimiossensível de pacientes com câncer. Para preencher essa lacuna, um modelo de xenoenxerto derivado do paciente in vivo foi desenvolvido e validado. O modelo foi baseado em embriões de zebrafish (Danio rerio) aos 2 dias pós-fecundação, os quais foram utilizados como receptores de fragmentos de xenoenxerto de tecido tumoral retirados da peça cirúrgica de uma paciente. 
Vale ressaltar também que as amostras bióticas não foram digeridas ou desagregadas, a fim de manter o microambiente tumoral, o que é crucial para analisar o comportamento tumoral e a resposta à terapia. O protocolo detalha um método para estabelecer xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) baseados em peixe-zebra a partir da ressecção cirúrgica de tumor sólido primário. Após triagem por um anatomopatologista, o espécime é dissecado com lâmina de bisturi. Tecido necrótico, vasos ou tecido adiposo são removidos e, em seguida, picados em pedaços de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm. 
As peças são então marcadas fluorescentemente e xenotransplantadas para o espaço perivitelino de embriões de peixe-zebra. Um grande número de embriões pode ser processado a baixo custo, permitindo análises in vivo de alto rendimento da quimiossensibilidade de zPDXs a múltiplas drogas anticâncer. Imagens confocais são rotineiramente adquiridas para detectar e quantificar os níveis apoptóticos induzidos pelo tratamento quimioterápico em comparação com o grupo controle. O procedimento de xenoenxerto tem uma vantagem de tempo significativa, uma vez que pode ser concluído em um único dia, proporcionando uma janela de tempo razoável para realizar uma triagem terapêutica para ensaios co-clínicos.

Este protocolo descreve a abordagem experimental para o estabelecimento de zPDXs a partir de adenocarcinoma pancreático humano primário. Uma amostra tumoral foi coletada, picada e corada com corante fluorescente, conforme descrito na seção 4 do protocolo. zPDXs foram então estabelecidos com sucesso pela implantação de um pedaço de tumor no espaço perivitelino de 2 embriões de peixe-zebra dpf, conforme descrito na seção 5 do protocolo. Conforme descrito na seção 6 do protocolo, os zPDXs foram rastreados para identificar o...

Os modelos pré-clínicos visam avançar no conhecimento da biologia do câncer e predizer a eficácia do tratamento. Este trabalho descreve a geração de xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) à base de peixe-zebra com fragmentos de tecido tumoral. Os zPDXs foram tratados com quimioterapia, cujo efeito terapêutico foi avaliado em termos de apoptose celular do tecido transplantado.

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

O xenoenxerto derivado de pacientes com peixe-zebra é um poderoso modelo pré-clínico para predizer o perfil de quimiossensibilidade de pacientes com câncer in vivo. O protocolo descreve a geração do modelo a partir de uma peça cirúrgica do paciente. Ao xenoenxertar um pequeno fragmento de tecido em vez de isolar células em embriões de peixe-zebra, é possível manter o microambiente tumoral, que é o passo crucial para a progressão do tumor e a resposta à quimioterapia.A grande vantagem do modelo é dada pelo seu potencial de prever o prognóstico do paciente em um período de tempo clinicamente relevante de apenas uma semana, atuando como uma ferramenta para a medicina personalizada. Iniciar o processamento da amostra lavando todo o tecido tumoral coletado do paciente com cinco mililitros de meio tumoral fresco. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta plástica Pasteur.Aspirar e descartar cuidadosamente o meio de lavagem antes de repetir a lavagem três vezes. Imergir a amostra em um a dois mililitros de meio tumoral fresco. Corte a amostra do tumor em pedaços de cubo de um a dois milímetros usando uma lâmina de bisturi e, em seguida, coloque-os em um tubo plástico estér

establishment-zebrafish-patient-derived-xenografts-from-pancreatic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve a técnica para criar um modelo de xenoenxerto derivado de paciente peixe-zebra. No protocolo da amostra, avaliamos a eficiência dos fármacos Gemcitabina e Navitoclax no modelo de xenoenxerto de tumor pancreático.

Xenoenxerto derivado de paciente de peixe-zebra (zPDX): um modelo de câncer

Este vídeo descreve o ensaio de xenoenxerto de peixe-zebra para avaliar a formação de tumores in vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos.

Ensaio de Xenoenxerto de Peixe-Zebra: Um Método para Avaliar a Eficácia Anticancerígena da Terapêutica na Tumorigenicidade em Peixe-Zebra In Vivo

Este vídeo descreve o método de transplante de células tumorais do modelo de peixe-zebra doador portador de melanoma para um receptor imunocomprometido Casper zebrafish. Ajuda a visualizar o enxerto e a proliferação do tumor no peixe receptor.

Ensaio de transplante subcutâneo: um método para transplantar células de melanoma de um doador para um modelo receptor de peixe-zebra

O transplante de células cancerosas é uma ferramenta importante para a identificação de mecanismos de câncer e respostas terapêuticas. As técnicas atuais dependem de animais imune-incompetentes. Descrevemos aqui um método para transplantar células tumorais de zebrafish em embriões imunocompetentes para a análise a longo prazo do comportamento de células tumorais e respostas de fármacos in vivo .

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Este protocolo descreve procedimentos da optimização em um modelo fluorescência-etiquetado duplo baseado em vírus do xenograft do tumor usando o zebrafish larval como anfitriões. Este modelo heterogêneo do xenograft imita a composição do tecido do microambiente pancreatic do cancro in vivo e sere como uma ferramenta mais precisa para avaliar respostas da droga em modelos personalizados de zPDX (xenograft paciente-derivado de zebrafish).

Modelo de Xenoenxerto heterogêneo derivado do paciente do câncer pancreático usando larvas de zebrafish como hospedeiros para avaliação comparativa de fármacos

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Descrevemos um protocolo de xenotransplante na gema de embriões transparentes de peixe-zebra que é otimizado por um método de estadiamento simples e rápido. As análises pós-injeção incluem sobrevida e avaliação da carga da doença de células xenotransplantadas por citometria de fluxo.

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Este protocolo fornece instruções passo a passo para gerar e solucionar problemas de xenoenxertos de leucemia linfoblástica aguda humana (LLA) de linhagens celulares e material fresco do paciente em embriões de peixe-zebra imunossuprimidos transitoriamente, juntamente com diretrizes para avaliação de resposta a medicamentos usando citometria de fluxo. O pipeline experimental também pode ser adaptado para tumores sólidos.

Predição rápida de resposta a medicamentos in vivo usando enxertos de células de leucemia em embriões de peixe-zebra

Descreve-se um método para rotulagem de xenoenxertos estável derivado do doente (PDXs) com partículas lentivirais que expressam a proteína e repórteres de luciferase fluorescente verde. Este método permite acompanhar o crescimento de PDXs no sítio primário, bem como a detecção de metástases espontâneas e experimentais que utilizam em sistemas de imagem in vivo.

Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

Aprenda a estabelecer xenoenxertos derivados de pacientes em zebrafish para testar quimiosensibilidade em câncer de pâncreas. Este modelo preserva o microambiente tumoral e prevê respostas ao tratamento em uma semana.

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Explorar mais vídeos