Name: Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprenda a criar organoides de glioblastoma humano ex vivo que mantêm a diversidade celular tumoral. Este método tridimensional permite estudar eficácia de fármacos e resistência em modelos personalizados.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Justin Lathia por seus conselhos inestimáveis e apoio contínuo. Agradecemos também a Katrina Fife, Lisa Wallace e Maya Camhi pelo excelente apoio técnico.

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
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<li>Seidel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypoxic+niche+regulates+glioblastoma+stem+cells+through+hypoxia+inducible+factor+2+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha.</a> Brain. 133, 983-995 (2010).</li>
<li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+cancer+stem+cells+secrete+Gremlin1+to+promote+their+maintenance+within+the+tumor+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy.</a> Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li>
<li>Flavahan, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+initiating+cells+adapt+to+restricted+nutrition+through+preferential+glucose+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).</li>
<li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li>
<li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos para revelar.

Os organoides GBM são um método de cultura complementar às esferas tradicionais que incluem maior heterogeneidade celular e microambiental 4,22,30. Embora mais tempo e recursos intensivos, a cultura organoide pode oferecer uma visão valiosa sobre o comportamento intra-tumoral e mecanismos de resistência a medicamentos.
O GBM é impulsionado por uma população de CSCs 5,31, e esses métodos foram desenvolvidos para permitir o crescimento contínuo e a auto-renovação dessa população CSC. O fator de crescimento epidérmico (EGF) e o fator de crescimento do fibroblasto (FGF) são conhecidos por aumentar a manutenção e o crescimento de células-tronco e fornecer sinalização ativa de tyrosina quinase receptora (RTK). A formação de populações celulares heterogêneas e microambientes tumorais distintos dentro de tumores GBM depende do apoio aos comportamentos de CSC. A seleção de um irECM imita o ambiente cerebral rico em laminina e apoia as células na cultura organoide para se auto-organizar e migrar por invasão. Embora alguns grupos tenham estabelecido a cultura organoide sem o uso de uma mídia lrECM ou EGF/FGF enriquecida24,28, o que pode oferecer uma forma mais eficiente deste método de cultura e uma seleção mais forte de sinalização oncogênica para impulsionar o crescimento, esses métodos foram escolhidos para otimizar o ambiente de células pró-tronco para melhor estabelecer a heterogeneidade celular dos organoides. Tanto organoides cerebrais quanto organoides GBM foram feitos com lrECM na literatura anteriormente 21,32,33. Embora tenhamos estabelecido dados sobre as populações tumorais encontradas dentro dos organoides e da variação espacial, menos se sabe sobre populações não tumorais dentro dos organoides e quanto tempo sobrevivem dos espécimes originais do paciente. Certas manchas de IHC (como CD45) podem fornecer esses dados, e podem ser um ponto interessante de pesquisa no futuro com organoides.
Conhecer o uso pretendido para a cultura organoide é importante para selecionar métodos apropriados. Estabelecer organoides de espécimes primários versus organoides uniformes em crescimento para experimentos específicos têm procedimentos ligeiramente diferentes. Ter uma apreciação de como os organoides amadurecem e preenchem visualmente o andaime LrECM é importante para poder alocar tempo e recursos adequados para a cultura organoide. Regiões esparsas de células em organoides se expandirão lentamente e crescerão para preencher o LrECM, que pode levar de 2 a 8 semanas, dependendo do comportamento do espécime. Esta taxa de crescimento é um pouco intrínseca a cada espécime; é preservado em diferentes lotes de organoides e bastante consistente com a taxa relativa de crescimento da esfera. Os organoides podem ser mantidos por mais de 1 ano e reter capacidades de formação de tumores em xenoenxerto em camundongos; no entanto, recomenda-se cultivá-los com um propósito distinto de não desperdiçar recursos de laboratório (materiais e tempo)4. O crescimento organoide foi testado em múltiplos tamanhos e formatos de poços, e mostra que uma placa de 10 cm é o cenário ideal para manter a viabilidade celular ideal, seguido por uma placa de 6 poços com três organoides por poço34. Organoides consomem mais mídia em comparação com suas contrapartes de cultura bidimensional, e usar um formato de poço menor não leva à manutenção adequada. Por exemplo, um poço de uma placa de formato de 96 poços não tem espaço ou volume de mídia suficiente em relação ao tamanho de um organoide para sustentar o crescimento organoide.
À medida que os organoides se estabelecem, ser observador é importante para aumentar o sucesso. Inicialmente, os organoides consumirão mídia lentamente, mas à medida que se tornam mais densos e maduros, consumirão mídia mais rapidamente. Adicionar fenol vermelho à mídia pode ajudar a servir como um indicador de consumo de mídia. Quando a mídia é mais amarela, pode nos levar a ajustar o padrão de alimentação, seja para trocar um maior volume de mídia, aumentar a quantidade total de mídia na placa, dividir organoides entre múltiplas placas de cultura celular para acompanhar seu crescimento, ou até mesmo ajustar a linha do tempo para experimentos. 
Em muitos aspectos, organoides são uma maneira ineficiente de conduzir pesquisas sobre câncer. Eles envolvem escalas de longo prazo, e são caros e pesados em termos de recursos em comparação com a cultura da esfera GBM. No entanto, em comparação com os xenoenxertos derivados do paciente, um método alternativo para recriar a diversidade celular e microambiental, eles são mais simples, menos caros e controláveis. A seleção de quando melhor usar organoides é importante para os pesquisadores de câncer. Eles não se destinam a substituir a esfera tradicional ou a cultura aderente e não substituir os modelos de xenoenxerto. Organoides podem, quando aplicados à questão científica certa, combinar os benefícios desses dois sistemas e podem nos permitir observar a biologia das células tumorais que de outra forma permaneceriam escondidas. A comunidade científica está apenas começando a entender quais oportunidades de aprendizagem os organoides oferecem, mas é claro que eles serão uma ferramenta inestimável no futuro para entender a complexa biologia do GBM.

Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comumente ocorrência com um prognóstico sombrio de aproximadamente 15 meses a partir do diagnóstico1. Tratamentos eficazes em estudos pré-clínicos podem muitas vezes ser pouco eficazes em pacientes 2,3. A má resposta clínica é atribuída a muitos fatores, incluindo a heterogeneidade microambiental do GBM e interações intra-tumorais complexas. Estes podem ser difíceis de recriar no ambiente de laboratório com métodos tradicionais de cultura aderente ou esfera4. A presença de um subconjunto de células-tronco cancerígenas autoconexantes (CSCs) dentro do GBM também pode contribuir para essa complexidade 5,6. Os CSCs são cruciais para a propagação do tumor e mantêm o crescimento do tumor, promovendo angiogênese ativa, invasão do câncer e resistência a terapias, incluindo radiação 7,8,9. Os CSCs não são uniformemente distribuídos em todos os tumores, mas sim são enriquecidos dentro de microambientes específicos, incluindo o nicho perivascular e regiões perinecroticas, que cada uma fornece regulação molecular distinta de seus estados celulares 10,11,12,13,14. Os CSCs não são receptores passivos de pistas microambientais, mas possuem a capacidade de remodelar seus próprios microambientes 7,15,16. O microambiente de um CSC pode promover a manutenção do estado das células-tronco em resposta a pressões como escassez de nutrientes, pH e hipóxia 17,18,19,20, sugerindo a importância dessas condições em um sistema modelo. A recapitulação do diversos microambientes celulares dentro dos tumores é, portanto, fundamental para compreender a resistência terapêutica e identificar novas terapias.
A cultura tridimensional aumentou em popularidade nos últimos anos21,22. Organoides têm sido usados em outros tipos de câncer, e o objetivo principal de manter as células como organoides é permitir o crescimento de populações de células heterogêneas (muitas das quais normalmente podem ser superadas em cultura de esferas mais homogêneas) e diversidade espacial, vistas como microambientes tumorais regionais com especificidade genética 4,23,24,25,26 . Existem muitos métodos para a cultura tridimensional das células cancerosas, que cada uma tem vantagens e desvantagens 27,28,29. A cultura organoide não se destina a ser um substituto para a cultura tradicional de adeptos ou esferas. É melhor usado como técnica complementar a métodos bidimensionais quando há questões específicas onde a interação entre microambiente celular e respostas de células tumorais é crítica.
Este artigo descreve métodos confiáveis e repetitivos para gerar organoides GBM a partir de amostras de pacientes primários ou culturas derivadas do paciente. Abordamos dois objetivos diferentes para a cultura organoide tridimensional: (1) estabelecer organoides a partir do tecido primário do paciente, com potencial máximo de engrafamento, independentemente da uniformidade, ou (2) organoides uniformes em crescimento para uso experimental mais quantitativo. Ao estabelecer um espécime primário como organoides, não é necessário filtrar para células únicas ou contar células, pois manter o número máximo de células e tipos para estabelecer a cultura inicial é uma prioridade. Quando os organoides em crescimento para experimentos comparativos, no entanto, a filtração de células únicas e a contagem celular são necessárias para garantir que os organoides de replicação sejam comparáveis para a consistência experimental. Este protocolo detalha como estabelecer culturas organoides e criar organoides uniformes, bem como métodos refinados para incorporar e preservar organoides e experimentos de cultura celular padrão, incluindo imunohistoquímica, imunofluorescência e avaliação da viabilidade celular total em organoides GBM.

<table><tbody><tr><td>Comprimidos de 3,3-diaminobenzidina (DAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>08980681</td><td>Comprimidos de 3,3-diaminobenzidina (DAB)</td></tr><tr><td>Placas de PCR de 96 poços Placas de PCR de 96</td><td>poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>Solução de descolamento</td></tr><tr><td>celular Antibiótico-antimicótico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Antibiótico-antimicótico</td></tr><tr><td>B-27 suplemento menos vitamina A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587001</td><td>B-27 suplemento menos vitamina A (50x)</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>Reagente azulado</td></tr><tr><td>Filtro de células (70 &micro; m)</td> <td>CellTreat Scientific</td><td>229483</td><td>Filtro de células (70 &micro; m)</td></tr> <tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Ensaio de viabilidade celular luminescente</td></tr><tr><td>Clarificador 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>Reagente clarificante de hematoxilina nuclear</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>substituto de xileno</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 Hematoxilina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>Hematoxilina</td></tr><tr><td>Glutamina em 0,85% NaCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Glutamina em 0,85% NaCl (200 mM)</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>Matriz extracelular enriquecida com laminina</td></tr><tr><td>Mini caneta PAP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>Caneta de barreira hidrofóbica</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>Neurobasal meio menos vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>Meio neurobasal menos vermelho de fenol (500 mL)</td></tr><tr><td>Soro de burro normal (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Soro de burro normal (NDS)</td></tr><tr><td>Paraformaldeído 4% em PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>Paraformaldeído 4% em PBS</td></tr><tr><td>Vermelho de fenol</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Vermelho de fenol (0,5%)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant com DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td>Montagem de cura líquida</td></tr><tr><td>Proteína EGF humana recombinante</td><td>R & D systems</td><td>236-EG-01M</td><td>Proteína EGF humana recombinante (250 &micro; g/mL)</td></tr> <tr><td>R & básico de FGF humano recombinante</td><td> D systems</td><td>4144-TC-01</td><td>FGF humano recombinante básico (250 &micro; g / mL)</td></tr> <tr><td>SignalStain Anticorpo Diluente</td><td>Cell Signaling</td><td>8112</td><td>Diluente de anticorpo</td></tr><tr><td>SignalStain Boost IHC Detection Reagent</td><td>Cell Signaling</td><td>8114</td><td>Reagente de detecção de imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>SignalStain Citrato Unmasking Solution</td><td>Cell Signaling</td><td>14746</td><td>Solução de desmascaramento de citrato</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de borda única</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>Borda única lâmina de barbear</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Sodium pyruvate (100 mM)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomolds</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Cryomolds descartáveis</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>VWR</td><td>25608-930 Composto de</td><td>temperatura de corte ideal</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Mancha impermeável de célula (0,4%)</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Xileno</td></tr></tbody></table>

manutenção da diversidade celular glioblastoma humano ex vivo usando cultura organoide tridimensional

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Glioblastoma (GBM) é o câncer cerebral maligno primário mais comumente ocorrido com um prognóstico extremamente ruim. A diversidade celular e molecular intra-tumoral, bem como interações complexas entre microambientes tumorais, podem tornar a busca de tratamentos eficazes um desafio. Métodos tradicionais de cultura aderente ou esfera podem mascarar tais complexidades, enquanto a cultura organoide tridimensional pode recapitular gradientes microambientais regionais. Organoides são um método de cultura gbm tridimensional que imita melhor a arquitetura tumoral do paciente, contém populações de células fenotipicamente diversas e pode ser usado para experimentos de médio rendimento. Embora a cultura organoide tridimensional seja mais trabalhosa e demorada em comparação com a cultura tradicional, ela oferece benefícios únicos e pode servir para preencher a lacuna entre os sistemas in vitro atuais e in vivo . Os organoides estabeleceram-se como ferramentas inestimáveis no arsenal de biólogos do câncer para entender melhor o comportamento do tumor e os mecanismos de resistência, e suas aplicações só continuam a crescer. Aqui, são fornecidos detalhes sobre métodos de geração e manutenção de organoides GBM. Instruções de como realizar a incorporação e secção de amostras organoides usando técnicas congeladas e de incorporação de parafina, bem como recomendações para protocolos de imunohistoquímica e imunofluorescência em seções organoides, e medição da viabilidade total das células organoides, também são descritas.

A Figura 1 mostra o crescimento organoide precoce visto através de microscopia leve na ampliação de 10x. A Figura 1A mostra a migração e invasão de células únicas através do IrECM na visão central. As células continuarão a expandir e 'colonizar' o LrECM, e elas parecerão mais densas e eventualmente opacas por inspeção visual. A Figura 1B mostra vários organoides maduros (com 7 semanas) sem ampliação, em relação ao tamanho de um centavo.
A Figura 2 demonstra a coloração imunohistoquímica de organoides GBM para fosfo-histona H3, um marcador de proliferação ativa. A maioria das células altamente proliferativas são vistas no perímetro organoide comparado com o núcleo organoide. A coloração positiva terá uma aparência marrom/cobre.
A Figura 3 descreve o processo para homogeneizar e medir o número total de células em organoides GBM usando um ensaio de viabilidade celular luminescente 3D. Devido ao alto número de células presentes nos organoides GBM, a maior estrutura organoide é inicialmente homogeneizada por trituração em reagente de ensaio luminescente. Em seguida, frações do total organoide lysate são carregadas em poços individuais e diluídas com reagente de ensaio luminescente adicional antes da incubação e leitura em um leitor de placas multi-poço apropriado.
A Figura 4 representa dados de controle DMSO (veículo comum) para organoides. Dados plotados demonstram consistência intra-organóide e inter-organóide. Os dados de viabilidade luminescente serão normalmente normalizados para controles para cada espécime ao gerar dados experimentais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> Figura 1: Ver através de um microscópio leve (10x). (A) Crescimento organoide precoce demonstrando migração/invasão de células GBM em toda a matriz extracelular rica em laminina. (B) Organoides maduros em relação ao tamanho de um centavo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> Figura 2: Imunohistoquímica de organoides GBM. (A, B) Organoides GBM mostrando células manchadas de fosfo-histona H3 para proliferação ativa. As barras de escala são de 600 μm e 300 μm para A e B, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> Figura 3: Protocolo de viabilidade celular luminescente para organoides. (A) Mova organoides individuais para pequenos tubos de centrífugas e remova o excesso de mídia. (B) Adicione 500 μL de 1:1 PBS e mistura de ensaio de viabilidade celular luminescente a cada tubo e pipeta agressivamente para quebrar o organoide. (C) Adicione 25 μL desta mistura organoide e 75 μL da mesma mistura de ensaio de viabilidade celular de 1:1 PBS e luminescente a cada poço de uma placa de 96 poços. (D) Coloque em um agitador por 2 minutos, seguido de incubação por 20 min no RT e, em seguida, leia luminescência em um leitor de placas. Figura feita usando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> Figura 4: Viabilidade celular. Dados de viabilidade celular para organoides em 0,1% de sulfóxido de dimetil (DMSO) para seis réplicas técnicas de quatro organoides para quatro amostras de pacientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr><tr><td>Meio neurobásal menos fenol vermelho</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento B-27 menos vitamina A (50x)</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>Antibiótico-antimicoótico (100x)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Glutamina em 0,85% NaCl (200 mM)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Padrão humano recombinante FGF (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Proteína EFG humana recombinante (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Phenol vermelho</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Formulação completa do meio neurobásal (NBMc)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Hora</td>
		</tr><tr><td>50% etanol</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>75% etanol</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>95% Etanol</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>95% Etanol</td>
			<td>4 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>4 min.</td>
		</tr><tr><td>Substituto de xileno</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>Substituto de xileno</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>Substituto de xileno</td>
			<td>4 min.</td>
		</tr><tr><td>Parafina</td>
			<td>15 min.</td>
		</tr><tr><td>Parafina</td>
			<td>15 min.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Cronograma de processamento de organoides pequenos (abaixo de 3 mm de diâmetro)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Hora</td>
		</tr><tr><td>50% etanol</td>
			<td>6 min.</td>
		</tr><tr><td>75% etanol</td>
			<td>6 min.</td>
		</tr><tr><td>95% Etanol</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>95% Etanol</td>
			<td>8 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>8 min.</td>
		</tr><tr><td>Substituto de xileno</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>Substituto de xileno</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>Substituto de xileno</td>
			<td>8 min.</td>
		</tr><tr><td>Parafina</td>
			<td>30 min.</td>
		</tr><tr><td>Parafina</td>
			<td>30 min.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Cronograma de processamento de organoides de grande porte (acima de 3 mm de diâmetro)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Hora</td>
		</tr><tr><td>Hematoxilina</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>Executando diH2O</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>Hematoxilina nuclear esclarece reagente</td>
			<td>1 min.</td>
		</tr><tr><td>Executando diH2O</td>
			<td>1 min.</td>
		</tr><tr><td>Reagente bluing</td>
			<td>1 min.</td>
		</tr><tr><td>Executando diH2O</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>70% de etanol</td>
			<td>1 min.</td>
		</tr><tr><td>100% etanol</td>
			<td>1 min.</td>
		</tr><tr><td>100% etanol</td>
			<td>1 min.</td>
		</tr><tr><td>Substituto de xileno</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>Substituto de xileno</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 4: Contra-mancha de hematoxilina

Aqui, descrevemos um método de geração de organoides de glioblastoma (GBM) a partir de amostras de pacientes primários ou culturas celulares derivadas do paciente e mantê-los até a maturidade. Esses organoides GBM contêm populações de células fenotipicamente diversas e recriam microambientes tumorais ex vivo.

Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Encontrar tratamentos para glioblastoma é um desafio devido à diversidade celular que existe nos tumores e às interações entre diversos microambientes. Organoides podem ajudar a recriar um pouco dessa diversidade espacial, e podemos usar isso para entender melhor a biologia dos tumores. Enquanto métodos tradicionais de cultura celular tendem a produzir populações de células tumorais homogêneas, os organoides podem imitar melhor a diversidade molecular e celular do glioblastoma e melhores interações intratumorais.Organoides podem ser usados para investigar a eficácia da droga e mecanismos de resistência. A resistência às terapias clínicas só pode aparecer em organoides e não na cultura tradicional da esfera, refletindo a realidade clínica desta doença. Organoides podem ajudar a demonstrar os efeitos regionais das quimioterapias.Eles podem ser usados para descobrir novas terapias específicas de nicho, e também podem atuar como uma ferramenta preditiva para a medicina personalizada no futuro. Alguns materiais usados para criar organoides são sensíveis à temperatura, e deixar de manter esses materiais em sua temperatura adequada pode levar a dificuldades de criação ou manutenção de organoides. Comece a preparar os moldes organoides sob uma capa de cultura tirando o papel de cera da folha de parafilm e colocando-o entre duas estéreis reações de corrente de polimerase de 96 poços ou placas PCR.Certifique-se de que o interior do parafilme está limpo. Aplique até pressão na placa superior para formar pequenas covinhas de dois milímetros de profundidade no parafilme sem criar furos. Separe as placas.O parafilme dimpled vai ficar na placa superior. Em seguida, coloque a placa superior em gelo seco por 30 segundos. Use fórceps estéreis para puxar o parafilm da placa superior em um movimento rápido.Parafilm congelado é mais fácil de remover. Coloque o molde de parafilme completo em um prato de cultura celular coberta e estéril de 10 centímetros. Para preparar a suspensão unicelular da cultura aderente ao glioblastoma ou GBM, remova a mídia usada da placa.Em seguida, adicione dois mililitros de solução de descolamento celular à temperatura ambiente à placa, e incubar a placa a 37 graus por três minutos. Após confirmar o descolamento celular da placa sob o microscópio, adicione oito mililitros de Neurobasal Medium completos, ou meio NBMc, para neutralizar a solução de descolamento celular. Coe a suspensão através de um único coador de células de 70 mícrons.Gire as células a 120 vezes g por cinco minutos. Em seguida, remova o supernatante e resuspende as células em um mililitro de NBMc. Conte as células da suspensão unicelular usando uma mancha impermeável celular.Para fazer organoides a partir de uma suspensão de célula única, adicione uma quantidade apropriada de matriz extracelular rica em laminina, ou 1ECM, em um pequeno tubo de centrífuga em um balde de gelo ou bloco frio. Prepare uma mistura celular contendo 20.000 células por organoide. Misture bem a mistura de suspensão celular LrECM para evitar a fixação das células, o que resultaria em formação organoide não uniforme.Em seguida, pipeta cuidadosamente 20 microliters da mistura em um molde de parafilme para formar uma gota semelhante a pérola. Certifique-se de esfriar a ponta da pipeta a cada dois ou três organoides para evitar a polimerização do 1ECM. Uma vez que o número desejado de organoides são pipetados no molde de parafilme em uma placa de cultura de 10 centímetros, incubar os organoides a 37 graus Celsius por uma a duas horas em uma incubadora de cultura celular.Depois que os organoides forem solidificados, tire os organoides suavemente do molde de parafilme com o meio NBMc usando uma ponta P1000 e colete-os em uma nova placa de cultura de 10 centímetros contendo 20 mililitros de NBMc. Coloque a placa de cultura em uma incubadora sem tremer por quatro dias. Depois de quatro dias, substitua a mídia na placa.Para fazer isso, coloque um pedaço de papel escuro sob a placa de cultura celular. Incline a placa e espere por 20 segundos. À medida que os organoides se acomodam completamente na parte inferior do prato, lentamente remova a mídia com uma pipeta de vidro de abertura grande.Depois de adicionar novas mídias, coloque a placa na incubadora em um agitador orbital a 80 RPM, e troque a mídia a cada dois ou três dias depois. O crescimento do organoide foi observado por meio de microscopia leve. Na visão central, o crescimento organoide precoce mostrou migração e invasão unicelular através do IrECM.Os organoides maduros com sete semanas eram relativos ao tamanho de um centavo. A coloração imunohistoquímica dos organoides GBM com fosfo-histona H3 revelou células altamente proliferativas com uma aparência marrom ou roxa no perímetro organoide em comparação com o núcleo. Os dados de viabilidade celular para organoides em 0,1% DMSO demonstraram consistência intraorganoide e interorganóide.Preste atenção à biomassa organoide e à acidificação da mídia. Se os organoides estiverem passando pela mídia muito rapidamente, certifique-se de trocar a mídia com mais frequência ou dividir os organoides entre placas adicionais. Organoides maduros podem ser usados para experimentos com terapias ou incorporados e seccionados para uso com imunohistoquímica ou imunofluorescência.Os organoides dissociados podem ser usados para análise FACS. Esses organoides foram recentemente usados no rastreamento funcional tridimensional para descobrir alvos essenciais em nichos de células-tronco de câncer espacialmente distintos. Também estamos usando esses modelos para priorizar diferentes medicamentos e terapias antes dos testes in vivo.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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