Name: Efeito do ácido hialurônico 35 kDa em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Explore o ensaio de ferida por arranhão em monocamadas derivadas de enteróides para estudar regeneração intestinal em modelo de intestino prematuro. Este método permite visualização em tempo real do fechamento da ferida.

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Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. HC é apoiado pela concessão P20GM134973 dos Institutos Nacionais de Saúde. A KB é apoiada por uma doação da Children's Hospital Foundation (CHF) e da Presbyterian Health Foundation (PHF). Os serviços de imagem de células vivas fornecidos pelo núcleo de Genômica Funcional do Câncer foram apoiados em parte pelo National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 e pelo National Cancer Institute Grant P30CA225520 dos Institutos Nacionais de Saúde, concedido ao Centro de Ciências da Saúde Stephenson da Universidade de Oklahoma.

Todos os procedimentos em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma. Após aprovação institucional, amostras de conveniência fetal do intestino delgado de um primata não humano prematuro (PNH, gestação de 90%, babuíno-oliva, Papio anubis) foram obtidas após eutanásia para um estudo separado (Protocolo nº 101523-16-039-I)20.
1. Estabelecimento de enteróides intestinais 3D de primatas não humanos prematuros
<ol><li>Preparação para a mídia NOTA: A mídia pode ser preparada até 1 semana antes do isolamento da cripta seguindo a técnica asséptica padrão. A penicilina/estreptomicina (concentração final de 1%) pode ser usada no lugar dos antibióticos de amplo espectro para células primárias, se desejado.<ol><li>Preparar meios de crescimento organoides humanos + Y-27632 (HOGMY) misturando 50 mL de meio de crescimento organoide meio basal humano com 50 mL de suplemento organoide (Tabela de Materiais). Adicionar 200 μL dos antibióticos de amplo espectro (concentração final de 100 μg/mL) (Tabela de Materiais) e Y-27632 (a uma concentração final de 10 μM). Aqueça na bancada até a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar meios de crescimento organoides humanos (HOGM) misturando 50 mL de meio de crescimento organoide meio basal humano com 50 mL de suplemento organoide. Adicionar 200 μL dos antibióticos de amplo espectro (100 μg/mL). Aqueça na bancada até a temperatura ambiente. NOTA: O HOGM será usado ao mudar de mídia além dos primeiros 2-3 dias após a passagem.</li>
		<li>Refrigerar 100 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio ou magnésio até ficar gelado.</li>
		<li>Preparar 50 mL de tampão de lavagem combinando 1x PBS sem cálcio ou magnésio com albumina sérica bovina (BSA) a 0,1%. Esfrie até gelar.</li>
		<li>Prepare o tampão de lavagem DMEM-F12 adicionando 1 mL dos antibióticos de amplo espectro (100 μg/mL) a 500 mL de DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mix F12 + 15 mM HEPES buffer). Mantenha-o gelado.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento e revestimento de criptas NOTA: O hidrogel à base de matriz extracelular (ECM) deve permanecer no gelo durante todo o procedimento. Este procedimento pressupõe tecido suficiente para preencher seis cúpulas de hidrogel à base de ECM. Se uma densidade diferente de criptas for colhida, o número da cúpula deve ser alterado de acordo.<ol><li>Descongelar 150 μL de extracto de membrana basal (BME) (isento de vermelho de fenol) reduzido ao fator de crescimento (TFG) durante a noite sobre o gelo a 2-8 °C.</li>
		<li>Incubar uma placa de poliestireno tratada com cultura de tecidos de 24 poços, de fundo plano, numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2 durante um mínimo de 30 minutos antes da utilização.</li>
		<li>Após a eutanásia NHP e a coleta de tecidos, lave o segmento de íleo dos detritos com uma ponta de pipeta de 1.000 μL usando PBS 1x gelado em uma placa de Petri descartável. NOTA: O tecido fresco deve ser colhido rapidamente e mantido gelado para colher enteróides saudáveis.</li>
		<li>Corte o íleo longitudinalmente ao longo de todo o intestino e lave com PBS 3x gelado. Pice o tecido em pequenos fragmentos (aproximadamente 2 mm de comprimento) com tesouras estéreis sobre um tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL de PBS gelado, a partir da porção do segmento ileal mais próxima do tubo.</li>
		<li>Use uma pipeta sorológica de 10 mL para interromper as criptas pipetando para cima e para baixo 5-10x. Deixe os segmentos de tecido se depositarem no fundo do tubo, remova o sobrenadante e substitua-o por PBS fresco e gelado. Repita este processo um mínimo de 7x-10x até que o sobrenadante esteja limpo e livre de detritos.</li>
		<li>Uma vez limpo, remova o sobrenadante e ressuspenda as criptas em 25 mL de reagente de dissociação celular. Coloque o tubo sobre uma plataforma de balanço a 20 rpm durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remova o tubo do balancim, deixe as células se acomodarem por aproximadamente 30 s a 1 min e remova o sobrenadante. Adicione 10 mL de tampão de lavagem gelado. Pipeta para cima e para baixo com uma pipeta p1000 para dissociar ainda mais em criptas únicas.</li>
		<li>Filtre o tecido através de um filtro de células de 70 μm em um novo tubo cônico de 50 mL. Lave o tubo cônico original de 50 mL com 10 mL de tampão de lavagem gelada e filtre através do filtro de 70 μm para garantir que todas as criptas foram removidas do tubo original. Repita esta lavagem de lenço de papel para um total de 4x enxaguamentos.</li>
		<li>Centrifugar o filtrado a 300 x g durante 5 min a 4 °C e remover o sobrenadante. Adicione 600 μL de HOGMY e interrompa o pellet pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 200 μL. Coloque o tubo no gelo até que a solução fique gelada. NOTA: Se a solução não estiver gelada, a cúpula não manterá a estrutura adequada quando chapeada. Evite a introdução de bolhas ao pipetar cúpulas de hidrogel à base de ECM, pois as bolhas impedirão a aderência adequada ao fundo da placa.</li>
		<li>Adicione 600 μL de hidrogel gelado à base de ECM para suspender o pellet celular e misture bem com uma pipeta de 200 μL.</li>
		<li>Retire a placa de 24 poços da incubadora e coloque-a sobre um aquecedor de placas a 37 °C. Pipetar 50 μL de mistura gelada de hidrogel à base de HOGMY/ECM para o centro de 24 poços de uma placa de cultura de 24 poços (50 μL por cúpula).</li>
		<li>Uma vez chapeadas, deixe as cúpulas assentarem numa placa de 37 °C mais quente durante 1 min para permitir a aderência ao fundo da placa. Inverta cuidadosamente a placa, certifique-se de que não se acumulou condensação no fundo da placa e coloque a placa invertida na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Após 15 min, vire a placa do lado direito para cima e pipete 750 μL de HOGMY à temperatura ambiente em cada poço. NOTA: Pipeta de mídia lentamente na parede lateral dos poços, tomando cuidado para não interromper a recém-formada cúpula de hidrogel à base de ECM 3D.</li>
		<li>Uma vez que todos os poços tenham sido preenchidos com meios, coloque a placa na incubadora e troque o meio a cada 3 dias com 750 μL de HOGM. Enteróides de passagem a cada 7-10 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Passagem enteróide intestinal NOTA: O protocolo a seguir é para uma placa de cultura de 24 poços contendo enteróides NHP a uma taxa de divisão de 1:2.<ol><li>Remova o meio enteróide de cada poço, tomando cuidado para não interromper a cúpula de ECM contendo enteróides, adicione 500 μL de reagente de dissociação celular gelado a cada poço usando uma pipeta de 1.000 μL e incube à temperatura ambiente por 1 min.</li>
		<li>Interrompa manualmente o ECM pipetando para cima e para baixo 8-12x. Transfira o conteúdo de 12 poços para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Uma vez que toda a solução tenha sido coletada da placa de cultura de 24 poços, adicione 250 μL de reagente de ruptura celular a cada poço para garantir que todos os enteróides NHP tenham sido removidos de cada poço, adicionando este último enxágue aos tubos cônicos de 15 mL existentes.</li>
		<li>Colocar sobre uma plataforma de balanço a 40 rpm durante 15 min à temperatura ambiente (20 °C). Alternativamente, agite manualmente os tubos por 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após 15 min, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante dos tubos de 15 mL até que apenas o pellet permaneça.</li>
		<li>Adicione 8 mL de DMEM gelado + antibióticos de amplo espectro a um tubo cônico de 15 mL, certificando-se de que o pellet esteja suficientemente interrompido. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 600 μL de HOGMY e interrompa o pellet pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL. Coloque o tubo no gelo até que a solução fique gelada. Quando a solução estiver gelada, adicione 600 μL de ECM gelado para suspender o pellet celular e misture bem com uma pipeta de 1.000 μL. Repita as etapas 1.3.2.-1.3.7. para os restantes 12 poços.<ol><li>Para as etapas restantes, consulte as etapas 1.2.11.-1.2.16.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Estabelecimento de monocamada enteróide e ensaio de ferida de arranhão
<ol><li>Preparação de meios e tratamentos<ol><li>Arrefecer 5 ml de PBS sem cálcio ou magnésio até gelar.</li>
		<li>Prepare o tampão de lavagem DMEM-F12 adicionando 1 mL dos antibióticos de amplo espectro (100 μg/mL) a 500 mL de DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mix F12 + 15 mM HEPES buffer). Mantenha gelado.</li>
		<li>Preparar 100 ml de HOGMY, conforme descrito no passo 1.1.1., e aquecê-lo na bancada até à temperatura ambiente.</li>
		<li>Aquecer 25 ml de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% em banho-maria a 37 °C.</li>
		<li>Preparar concentrações de 50 μg/mL, 100 μg/mL e 200 μg/mL de HA35 para tratamento celular, utilizando PBS estéril sem cálcio ou magnésio como solvente. A diluição final do HA35 utilizará HOMGY como solvente. NOTA: A preparação de HA35 pode requerer várias diluições, uma vez que o HA35 geralmente sai da solução a uma concentração superior a 5 mg/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Formação de monocamada enteróide NOTA: O procedimento a seguir fornece volumes suficientes para a geração de uma placa de 24 poços de monocamadas enteróides. Ajuste os volumes para o número desejado de monocamadas.<ol><li>Descongelar 96 μL de hidrogel BME (sem fenol vermelho) à base de ECM durante a noite no gelo a 2-8 °C. Diluir hidrogel à base de ECM em PBS gelado sem cálcio ou magnésio na proporção de 1:50. Revestir cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços com 200 μL de hidrogel à base de ECM diluído a frio.</li>
		<li>Incubar a placa revestida de hidrogel à base de ECM durante um mínimo de 1 h a 37 °C e 5% de CO2. Aspirar meios da placa de cultura de 24 poços contendo os enteróides 3D destinados a monocamadas e substituir por 500 μL de reagente/poço de dissociação celular.</li>
		<li>Interrompa manualmente as cúpulas de hidrogel à base de ECM pipetando para cima e para baixo 8x-12x e transfira o conteúdo de 12 poços para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Lave os 12 poços vazios com 250 μL de reagente de dissociação celular para garantir que todos os enteróides foram removidos e transfira o conteúdo para um tubo cônico de 15 mL. Repita a etapa 2.2.5. e passo 2.2.6. para os 12 poços restantes usando um segundo tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugar os tubos cónicos a 300 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante. Adicione 10 mL de tampão de lavagem DMEM-F12 gelado a tubos cônicos de 15 mL e suspenda os pellets enteróides invertendo os tubos. Centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets celulares em 12 mL de tripsina-EDTA a 37 °C. Colocar os tubos em banho-maria a 37 °C durante 10 minutos ou até que as células pareçam solúveis. Adicione 3 mL de tampão de lavagem DMEM-F12 a cada tubo para diluir a tripsina-EDTA, misture invertendo os tubos e coloque no gelo.</li>
		<li>Filtrar os enteróides dissociados através de um filtro de células de malha de 37 μM, recolhendo o conteúdo em tubos cónicos limpos de 15 ml. Centrifugar os tubos a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Enquanto as células estão peletizando na centrífuga, remova a placa revestida de hidrogel à base de ECM da incubadora e aspire qualquer solução de hidrogel à base de ECM em excesso sem arranhar a superfície revestida ou deixar a placa secar completamente.</li>
		<li>Remova o sobrenadante dos tubos cônicos e ressuspenda os pellets celulares com 6 mL de HOMGY. Adicionar 500 μL da suspensão combinada de 12 ml de células HOMGY em cada poço da placa de 24 poços revestida com hidrogel à base de ECM a uma densidade de semeadura de aproximadamente 3 x 105 células/poço. Gire a placa com uma tampa para garantir uma distribuição uniforme das células dentro dos poços.</li>
		<li>Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO 2, trocando meios HOMGY a cada2 dias até que as monocamadas atinjam &gt;90% de confluência.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento monocamada e ensaio de arranhões<ol><li>Uma vez que as monocamadas atinjam &gt;90% de confluência, aspirar o meio para remover quaisquer células que não se liguem. Tratar as células com 500 μL de HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou PBS, dissolvidas em HOMGY, por 24 h.</li>
		<li>Após 24 h, remova o meio, tomando cuidado para não interromper a superfície da monocamada. Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, faça um arranhão linear em todo o diâmetro da superfície da monocamada em cada poço, tomando cuidado para não deixar as monocamadas secarem.</li>
		<li>Lave as monocamadas riscadas 1x com 500 μL de 1x PBS. Adicionar 500 μL de HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou PBS dissolvido em HOMGY e transferir a placa para o instrumento de análise de células vivas (Tabela de Materiais) dentro de uma incubadora de 37 °C e 5% de CO2 .</li>
		<li>No ícone Agendar no software de análise de células vivas (Tabela de Materiais), clique no ícone Iniciar Assistente para Adicionar Nova Embarcação e defina a frequência de varredura para digitalizar de acordo com uma programação. Crie uma nova embarcação de Poço Inteiro em Tipo de Digitalização, especifique as configurações de digitalização (ou seja, Fase para Canais de Imagem e 4x para Objetivo) e clique em Avançar.</li>
		<li>Selecione o fabricante da placa e o número de catálogo na lista fornecida. No ícone Agendamento , escolha o símbolo de adição onde a placa será colocada dentro do instrumento de análise de células vivas. Selecione o Padrão de digitalização desejado e, em seguida, crie um mapa de placa selecionando "+" na página Layout de placa. Selecione Adiar análise para mais tarde e, em seguida, defina a programação de varredura para cada 4 horas por 24 horas e verifique as configurações de aquisição na página Resumo do Assistente de embarcação . Por fim, selecione Adicionar à programação.</li>
		<li>Quando o ensaio 24 estiver concluído, no ícone Exibir, clique duas vezes em Nome da embarcação e exporte imagens e filmes. Selecione poços e uma série de imagens para exibir e exportar como um JPEG. Analise imagens para obter a porcentagem de cicatrização de feridas usando o plug-in Wound Healing Size para ImageJ21, de acordo com a etapa 2.4. abaixo.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de arranhões<ol><li>Abra o software ImageJ. Carregue as imagens do ensaio de arranhões (. TIFF ou .JPG).</li>
		<li>Selecione Imagem &gt; Tipo &gt; 8 bits para alterar a imagem de RGB de 24 bits para 8 bits. Instale o Plug-in de Tamanho de Cicatrização de Feridas selecionando Plug-ins &gt; Macros &gt; Instalar &gt; Plug-in de Tamanho de Cicatrização de Feridas.</li>
		<li>Gire a imagem para que o rascunho fique vertical e inicialize o plug-in Wound Healing Size Tool.</li>
		<li>Selecione os parâmetros do plug-in na caixa de diálogo para melhor se ajustar à ferida do arranhão. Defina o valor dos parâmetros para as opções de tamanho de cicatrização de feridas da seguinte maneira: Raio da janela de variância em 20, Valor limite em 100 e Porcentagem de pixels saturados em 0,001 e escolha Sim para Definir escala global. Finalize a seleção clicando no botão OK . Verifique se a área selecionada é a área da ferida. Os parâmetros acima podem exigir padronização de laboratório para laboratório.</li>
		<li>Repita as etapas 2.4.2.-2.4.4. para os pontos de tempo restantes para cada arranhão.</li>
		<li>Calcule a porcentagem de cicatrização de feridas na área de arranhões de células migratórias ou proliferantes ao longo de 24 horas da seguinte forma: % Cicatrização de Feridas = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63758/63758eq01.jpg" style="margin: auto;"> onde T 0 = % Área no tempo 0 h e Tc = % Área em 0 h, 4 h, 12 h ou 24 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar e nenhum conflito de interesses.

O trato gastrointestinal de um prematuro está sob pressão regenerativa contínua de exposições repetidas a insultos ambientais associados à disbiose, metabólitos e toxinas bacterianas inflamatórias e hipóxia intermitente23,24. Infelizmente, o epitélio intestinal do prematuro é incapaz de estabelecer rapidamente a integridade funcional23, resultando em disfunção de barreira, aumento da permeabilidade intestinal e, em casos graves, inflamação...

A enterocolite necrosante (NEC) é uma das emergências gastrointestinais mais comuns em prematuros1. A doença é caracterizada por inflamação intestinal grave que pode se deteriorar rapidamente para necrose intestinal, sepse e potencialmente morte. Embora a etiologia não seja clara, as evidências sugerem que a NEC é multifatorial e o resultado de uma complexa interação de alimentação, colonização bacteriana anormal e epitélio intestinal imaturo 2,3. Prematuros apresentam aumento da permeabilidade intestinal, colonização bacteriana anormal e baixa capacidade regenerativa de enterócitos4,5, aumentando o risco de disfunção da barreira intestinal, translocação bacteriana e desenvolvimento de NEC. Portanto, identificar estratégias ou intervenções para acelerar a maturação epitelial intestinal e promover a regeneração ou cicatrização do epitélio intestinal é fundamental na prevenção dessa doença mortal.
Estudos têm demonstrado que o leite humano (HM) é protetor contra a NEC em prematuros 6,7,8,9,10,11. Estudos em humanos e animais mostraram que a fórmula à base de bovinos aumenta a permeabilidade intestinal e é diretamente tóxica para as células epiteliais intestinais 2,12. Embora não totalmente elucidada, as evidências sugerem que os efeitos protetores da HM são mediados por componentes bioativos, como lactoferrina, imunoglobulina A (IgA) e oligossacarídeos HM13. O HM também é rico em hialuronano (AH), um glicosaminoglicano exclusivamente não sulfatado com repetição de ácido D-glucurônico e dissacarídeos N-acetil-D-glucosamina14,15. É importante ressaltar que mostramos que o 35 kDa HA oral (HA35), um HM HA mímica, atenua a gravidade da lesão intestinal, previne a translocação bacteriana e diminui a mortalidade em um modelo de lesão intestinal murina semelhante ao NEC16,17. 
Aqui, os efeitos do HA35 na cicatrização e regeneração intestinal in vitro são investigados mais adiante. Atualmente, o ensaio in vitro mais utilizado para feridas intestinais e reparo é um ensaio de arranhão realizado em monocamadas celulares de câncer colorretal (CCR). A relevância fisiológica de tal modelo para o intestino infantil prematuro é limitada, uma vez que o reparo de feridas de células CRC depende fortemente da natureza altamente proliferativa das células cancerígenas, em vez de processos de reparo orientados por células-tronco18. Para superar essa limitação, o estabelecimento de um modelo de arranhão enteróide 2D, incluindo o procedimento de isolamento e manutenção de enteroides intestinais delgados derivados de células-tronco primárias de primatas não humanos (PNH) prematuros, é descrito aqui. Dado que a NEC pré-termo é mais frequentemente relatada no intestino delgado distal, o uso de organoides primários de células epiteliais em um modelo de dano e reparo intestinal fornece um modelo in vitro mais fisiologicamente traduzível em comparação com os modelos existentes que utilizam monocamadas colorretais tradicionais18,19.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Sorológica de 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-49</td><td></td></tr><tr><td>100x21mm Prato, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>24-Well, TC-Treated, Placa de Fundo Plano</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; Filtro de Células Reversível M</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtros de Células Estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, Bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensaio de Viabilidade de Células 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco/Nutriente Mistura de Presunto F-12 (DMEM-F12) com tampão HEPES de 15 mM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Reagente de dissociação</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Incucyte S3 Instrumento de Análise de Células Vivas</td><td>Sartorius</td><td>4647</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de Software de Análise de Feridas por Arranhões Incucitários</td><td>Sartorius</td><td>9600-0012</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento Organoide IntestiCult (Humano)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td>Este é o HOGMY, mas sem o Y-27632 ou antibióticos. Também usado como base para HOGM, mas faltando apenas os antibióticos.</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O111:B4, purificados por cromatografia de filtração em gel</td> Matriz de membrana basal <td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Redução do fator de crescimento (TFG),</td> 356231 <td>de Corning</td> sem vermelho de fenol <td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>MicroWell 96 poços, Nunclon tratado com delta, microplaca de fundo plano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato), 1X [-] Cálcio, Magnésio, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Este é um antibiótico de amplo espectro</td></tr><tr><td>Hialuronato de sódio, grau de pesquisa, HA20K</td><td>Lifecore Biomedical</td><td>HA20K-1</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Empresa: Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 1X, 0,25% de tripsina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

efeito do ácido hialurônico 35 kda em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Ensaios de feridas de arranhões in vitro são comumente usados para investigar os mecanismos e características da cicatrização epitelial em uma variedade de tipos de tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para gerar uma monocamada bidimensional (2D) a partir de enteroides de primatas não humanos tridimensionais (3D) derivados de criptas intestinais do íleo terminal. Essas monocamadas derivadas de enteroides foram então utilizadas em um ensaio de arranhão in vitro para testar a capacidade do hialuronano 35 kDa (HA35), um HA de leite humano, para promover a migração e proliferação celular ao longo da borda da ferida epitelial. Após o cultivo das monocamadas até a confluência, elas foram raspadas manualmente e tratadas com HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou controle (PBS). A migração celular e a proliferação para a lacuna foram fotografadas usando um microscópio de luz transmitida equipado para imagens de células vivas. O fechamento da ferida foi quantificado como porcentagem de cicatrização de feridas usando o Wound Healing Size Plugin no ImageJ. A área de arranhão e a taxa de migração celular e a porcentagem de fechamento da ferida foram medidas ao longo de 24 h. O HA35 in vitro acelera a cicatrização de feridas em monocamadas enteroides do intestino delgado, provavelmente através de uma combinação de proliferação celular na borda da ferida e migração para a área da ferida. Esses métodos podem potencialmente ser usados como um modelo para explorar a regeneração intestinal no intestino delgado humano prematuro.

Os efeitos do AH no reparo tecidual e cicatrização de feridas em vários tecidos e órgãos estão bem documentados; no entanto, os efeitos específicos do AH com um peso molecular de 35 kDa na cicatrização e regeneração do intestino delgado fetal ou neonatal são atualmente desconhecidos. Para testar a capacidade do HA35 de promover a cicatrização de feridas em um modelo do intestino delgado fetal ou neonatal, geramos enteroides intestinais 3D a partir do tecido ileal NHP e dissociamos ainda mais esse tecido em células únicas...

Este protocolo descreve um método para estabelecer e executar um ensaio de arranhão em monocamadas bidimensionais (2D) derivadas de enteróides tridimensionais (3D) isolados de íleo de primatas não humanos.

Efeito do ácido hialurônico 35 kDa em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Este protocolo estende o ensaio de ferida de arranhão muito comum usado para estudos de regeneração com monocamadas derivadas de enteróides representando todos os principais tipos de células do intestino delgado. Esta técnica permite a visualização em tempo real do fechamento da ferida em um modelo de monocamada enteróide 2D pré-termo de regeneração intestinal. Nossa técnica pode ser aplicada ao estudo do intestino de mamíferos prematuros, que normalmente é mal modelado usando linhas celulares de câncer colorretal transformadas.Comece descongelando 96 microlitros de matriz extracelular, ou hidrogel BME à base de ECM, durante a noite no gelo a dois a oito graus Celsius. Diluir o hidrogel à base de ECM e o PBS gelado sem cálcio ou magnésio numa proporção de um para 50. Revestir cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços com 200 microlitros de hidrogel à base de ECM diluído a frio e incubar a placa revestida por um mínimo de uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, aspirar o meio da placa de cultura de 24 poços contendo os enteróides 3D destinados a monocamadas e substituí-lo por 500 microlitros de reagente de dissociação celular por poço. Interrompa manualmente as cúpulas de hidrogel à base de ECM pipetando para cima e para baixo de oito a 12 vezes e transferindo o conteúdo de 12 poços para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os 12 poços vazios com 250 microlitros de reagente de dissociação celular para garantir que todos os enteróides tenham sido removidos e transfira o conteúdo para tubos cônicos de 15 mililitros.Centrifugar os tubos cônicos a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de tampão de lavagem DMEM/F-12 gelado aos tubos cônicos e suspenda os pellets enteróides invertendo os tubos. Centrifugar a 300g durante cinco minutos a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante.Ressuscite os pellets de células em 12 mililitros de 37 graus Celsius Tripsina-EDTA e coloque os tubos em banho-maria de 37 graus Celsius por 10 minutos ou até que as células pareçam solúveis. Adicione três mililitros de tampão de lavagem DMEM/F-12 a cada tubo para diluir a tripsina-EDTA. Misture invertendo os tubos e coloque no gelo.Filtre os enteróides dissociados através de um filtro de células de malha de 37 micrômetros. Recolha o conteúdo em tubos cónicos limpos de 15 mililitros e centrifugar os tubos a 300g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante dos tubos cônicos e ressuspenda os pellets celulares com seis mililitros de HOMGY.Em seguida, remova a placa revestida de hidrogel à base de ECM da incubadora e aspirar qualquer solução de hidrogel à base de ECM em excesso sem arranhar a superfície revestida ou secar completamente a placa. Adicione 500 microlitros da suspensão combinada de células HOMGY de 12 mililitros em cada poço da placa de 24 poços revestida com hidrogel à base de ECM. Gire a placa com a tampa para garantir uma distribuição uniforme das células dentro dos poços.Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, trocando o meio HOMGY a cada dois dias até que as monocamadas atinjam uma confluência superior a 90%. Uma vez que as monocamadas atinjam mais de 90% de confluência, aspirar o meio para remover quaisquer células que não se liguem. Trate as células com 500 microlitros de HA35 ou PBS dissolvidos em HOMGY por 24 horas.Depois disso, remova a mídia sem interromper a superfície da monocamada. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, faça um arranhão linear em todo o diâmetro da superfície da monocamada em cada poço, tomando cuidado para não deixar as monocamadas secarem. Lave as monocamadas riscadas uma vez com 500 microlitros de 1X PBS e adicione 500 microlitros de HA35 ou PBS dissolvidos em HOMGY.Transfira a placa para o instrumento de análise de células vivas dentro de uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No ícone Agendar no software de análise de células ativas, clique no ícone Iniciar Assistente para Adicionar Nova Embarcação. Selecione Fazer varredura no cronograma e clique em Avançar.Selecione Novo em Criar vaso e clique em Avançar, selecione Poço inteiro em Tipo de varredura e clique em Avançar. Escolha Fase para canais de imagem e 4x para o objetivo. Selecione o fabricante da placa e o número de catálogo na lista fornecida e clique em Avançar.Selecione um local de recipiente vazio seguido pelo padrão de varredura desejado. Insira o nome da placa em Nome e selecione mais para criar um layout de placa. Selecione pequeno mais para criar um nome de tratamento.Digite o nome abreviado e, em seguida, OK. Destaque os poços de placa correspondentes a esse tratamento e acerte grande vantagem para designar poços com esse tratamento. Insira a concentração composta e clique em OK. Quando a placa estiver concluída, selecione OK, Avançar. Selecione Adiar análise para mais tarde, seguido de Criar nova agenda com varreduras em intervalos de quatro horas.Pare a varredura em um dia, zero horas. Verifique se o resumo está correto e, em seguida, adicione à programação. No software de análise de células ao vivo, selecione Exibir na parte superior da tela.No menu Nome da embarcação, navegue até a verificação concluída de 24 horas e clique duas vezes no nome da embarcação. Selecione o ícone Exportar imagens e filmes à esquerda, seguido pela opção Como exibido. Realce os poços de interesse e, em seguida, selecione os pontos de interesse de tempo e a Série de Imagens como Exibidos.Verifique se o tipo de sequência e as varreduras estão corretos. Selecione o local da pasta de destino desejada. Escolha JPEG no menu suspenso e, em seguida, Exportar.Abra o software ImageJ e carregue a imagem do ensaio de arranhões. Selecione Imagem e digite 8 bits para alterar a imagem de RGB de 24 bits. Selecione Plugins, Macros, Install, Wound_healing_size plugin para instalar o Wound Healing Size Plugin.Depois disso, defina o raio da janela de variância como 20, o valor limite como 100, a porcentagem de pixels saturados como 0,001. Sim para Definir escala global e, em seguida, clique em OK. Verifique se a área delineada é a área da ferida e repita para riscos adicionais. Finalmente, calcule a porcentagem da cicatrização de feridas na área de arranhões de células migratórias ou proliferantes ao longo de 24 horas usando a equação mostrada na tela.Aqui, T0 é a área no tempo zero horas, e TC é a área em zero horas, quatro horas, 12 horas ou 24 horas. A geração enteróide e o procedimento de ensaio de cicatrização de feridas monocamada derivado de enteroides são mostrados nestas imagens. Uma cultura de enteroides intestinais tridimensionais de primatas não humanos é usada para dissociar em monocamadas bidimensionais.As monocamadas foram cultivadas a uma confluência superior a 90% em uma placa de 24 poços e, em seguida, tratadas com HA35 ou PBS por 24 horas. As monocamadas foram então riscadas com uma ponta de pipeta P200. Aqui são mostradas as imagens representativas do HA35 em tratamentos de controle de monocamadas enteroides de primatas não humanos.As imagens foram obtidas às zero horas, quatro horas, 12 horas e 24 horas após a realização de um arranhão com ponta de pipeta P200. O efeito do HA35 nas monocamadas andoides de cicatrização de feridas é mostrado aqui. A mudança na cicatrização de feridas ao longo do tempo em monocamadas enteróides depende da concentração de tratamento com HA35.O HA35 aumentou significativamente a cicatrização de feridas após quatro horas e 12 horas a 100 microgramas por mililitro e 200 microgramas por mililitro quando comparado ao controle, mas as taxas de cicatrização convergiram entre os tratamentos em 24 horas. Uma das coisas mais importantes a lembrar com este procedimento é que as monocamadas enteróides intestinais são de curta duração. Então, uma vez que eles são 90% confluidos, os investigadores devem procurar usá-los rapidamente.Esta técnica tornou-se o nosso modelo para a regeneração intestinal prematura in vitro, especialmente se estivermos interessados em mais lesões mecânicas do que inflamatórias.

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Medicine

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Este vídeo demonstra o desenvolvimento da doença enterocolite necrosante em um modelo enteróide neonatal de origem humana induzido pelo tratamento com lipopolissacarídeos. Este modelo ajuda a estudar a fisiopatologia intestinal.

Indução de Enterocolite Necrosante em Modelo Enteróide Epitelial Humano

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Enteroids estão emergindo como um novo modelo no estudo de doenças humanas. O protocolo descreve como simular um modelo enteroid de humano enterocolite necrosante usando lipopolissacarídeo (LPS) tratamento do enteroids gerados a partir de tecido neonatal. Enteroids coletados demonstram alterações inflamatórias parecido com aqueles vistos em enterocolite necrosante humana.

Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante

Os organóides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) oferecem oportunidades emocionantes para modelar doenças entéricas in vitro. Nós demonstramos a diferenciação de hiPSCs em organoids intestinais (iHOs), na estimulação destes iHOs com cytokines, e na microinjeção de Salmonella typhimurium no lúmen de Iho, permitindo o estudo de uma invasão epithelial por este Patógeno.

Usando organóides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para estudar e modificar a proteção de células epiteliais contra Salmonella e outros patógenos

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Este protocolo detalha o estabelecimento de enteróides, um modelo intestinal tridimensional, a partir do tecido intestinal fetal. Imagens imunofluorescentes de biomarcadores epiteliais foram utilizadas para caracterização do modelo. A exposição apical de lipopolissacarídeos, uma endotoxina bacteriana, utilizando a técnica de microinjeção induziu a permeabilidade epitelial de forma dose-dependente medida pelo vazamento de dextrano fluorescente.

Testando a permeabilidade epitelial em enteroides derivados de tecido fetal

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

Este protocolo descreve um modelo in vitro de enterocolite necrosante (ECN), que pode ser usado para estudos mecanísticos da patogênese da doença. Apresenta um chip microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados do intestino neonatal humano, células endoteliais e o microbioma intestinal de um neonato com ECN grave.

Modelo Microfluídico de Enterocolite Necrosante Incorporando Enteróides Intestinais Neonatais Humanos e um Microbioma Disbiótico

Este protocolo tem como objetivo avaliar peptídeos biofuncionais de automontagem quanto à adesão celular, morfologia organoide e expressão gênica por imunocoloração. Usaremos uma linha celular de câncer colorretal para fornecer uma maneira econômica de obter organoides para testes intensivos.

Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta

Este estudo apresenta um protocolo para geração de monocamadas 2D intestinais bovinas a partir de organoides, oferecendo melhor acesso para o estudo das interações patógeno-hospedeiro. Inclui métodos para avaliar a integridade e funcionalidade da membrana, avançando modelos in vitro que imitam a fisiologia gastrointestinal do gado. Essa abordagem promete benefícios biomédicos e agrícolas significativos, incluindo estratégias de tratamento aprimoradas.

Avanços na tecnologia de organoides bovinos usando interfaces de monocamada de intestino delgado e grosso

Explore o ensaio de ferida por arranhão em monocamadas derivadas de enteróides para estudar regeneração intestinal em modelo de intestino prematuro. Este método permite visualização em tempo real do fechamento da ferida.

Efeito do ácido hialurônico 35 kDa em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides (Vídeo) | JoVE Journal

Efeito do ácido hialurônico 35 kDa em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides

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