Name: Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a caracterizar o tráfego intracelular e secreção de proteínas da membrana basal em células epiteliais de Drosophila usando microscopia confocal e super-resolução Airyscan. Este método permite visualização de alta resolução.

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Os autores são gratos a Julie Merkle por seus comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R15GM137236 para O.D. As imagens confocal e super-resolução foram adquiridas utilizando um Zeiss LSM 900 com Airyscan 2, comprado com 2018748 de subvenção de ressonância magnética da NSF.

Os autores não têm nada a revelar.

O BM é fundamental para morfogênese embrionária e de órgãos, e funções fisiológicas adultas. Além disso, o BM atua como uma plataforma de sinalização para o estabelecimento e manutenção da polaridade epitelial e fornece tecidos com suporte2. No entanto, os mecanismos que regulam a colocação adequada das proteínas BM são mal compreendidos. Uma melhor compreensão das vias biológicas dedicadas ao tráfico intracelular e à secreção polarizada das proteínas BM requer uma análise cuidadosa dos componente...

A membrana do porão (BM) é uma fina folha de matriz extracelular aderente a células em camadas (ECM) crítica para estrutura epitelial e morfogênese1. Compreende ~50 proteínas e é encontrado onipresentemente subjacente às células epiteliais e endoteliais, e células esqueléticas, lisas e cardíacas e adipócitos 1,2,3. Os três principais componentes do BM no lado basal das células epiteliais são Colágeno IV, Perlecan e Laminins. O BM está por trás das células epiteliais e é responsável por muitas funções, incluindo separação e barreira tecidual, crescimento e suporte, e polarização celular 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Seu papel como plataforma de sinalização regula a morfologia e diferenciação de células e tecidos epiteliais durante o desenvolvimento 3,13,14. Além disso, a má regulação do BM e/ou uma violação de sua integridade são as principais causas de muitas condições patológicas, incluindo a metástase tumoral 2,15,16. Apesar das funções essenciais desempenhadas pelo MMC durante a morfogênese tecidual e de órgãos, os componentes da via biológica dedicada ao tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas BM são vagamente conhecidos.
Para estudar o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e a secreção de proteínas BM por células epiteliais, o epitélio folicular (FE) do ovário de Drosophila é um poderoso sistema modelo (Figura 1). Um ovário de Drosophila compreende 16-20 estruturas longas, semelhantes a tubos, chamadas ovários (Figura 1A,B)17,18,19. Cada ovário pode ser considerado como uma linha de montagem de ovos, com a progressão de idade das câmaras de ovos (que cada uma dá origem a um ovo) que começa na extremidade anterior e se move posteriormente, até que o ovo maduro saia através do oviduto. Cada câmara de ovo é encapsulada pela FE, uma monocamada de células folículos somáticas (FCs), que circunda as células germinais centrais (GCs). O FE é altamente polarizado com uma distinta polaridade apical-basal onde o domínio apical enfrenta a germinal, e as proteínas BM são secretas basally 18,19. Os FCs secretam ativamente todos os principais componentes do BM, incluindo Colágeno IV, Perlecan e Laminins20,21. Em células epiteliais como FCs, os componentes de BM são produzidos e requerem um caminho de secreção polarizada especializada para sua deposição extracelularmente. Por exemplo, no caso do componente mais abundante do BM, Colágeno IV (Coll IV), os detalhes em torno de seu tráfico intracelular polarizado e secreção são vagos, apesar de sua produção e deposição serem o foco de muitos estudos. A coll IV é traduzida no ânticulo endoplasmático (ER), que também é onde cada fibril - composto por três polipeptídeos (duas cadeias α1 e uma cadeia α2) - é montado em uma hélice tripla22. A dobra e a função adequadas coll IV requerem acompanhantes e enzimas ER, incluindo lysyl e prolyl-hidroxilases como Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Essas enzimas pós-transacionais regulam a classificação do ER de Coll IV, pois a perda de cada uma faz com que o Coll IV fique preso no ER basal 20,23,24,25,26. Em seguida, o recém-sintetizado Coll IV sai do ER para o Golgi em vesículas revestidas de COPII. O receptor de carga Tango1 auxilia na embalagem de collagens em vesículas consideráveis ligadas a Golgi que podem acomodar grandes proteínas multiméricas20,27. Uma vez que Coll IV é embalado em vesículas exocóis exocóis intracelulares, é especificamente secretado basalmente de células epiteliais. Para direcionar a deposição de BM para o lado basal, as células epiteliais requerem outro conjunto de fatores especificamente dedicados à secreção polarizada de BM. Usando o FE do ovário Drosophila, alguns componentes deste novo processo celular foram caracterizados, incluindo os fatores de troca de nucleotídeos (GEFs) Crag e Stratum, os GTPases Rab8 e Rab10, bem como os níveis do fosfoinostito PI(4,5)P2, e Kinesin 1 e 3 proteínas motoras 20,28,29, 30,31 . Esses componentes são fundamentais para garantir a distribuição polarizada das proteínas BM.
Para monitorar a localização intracelular de proteínas BM no FE, proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente (armadilhas proteicas), como Viking-GFP (Vkg-GFP ou α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP) podem ser utilizadas 32,33. Estas linhas de armadilhas proteicas têm sido demonstradas para refletir com precisão a distribuição endógena das proteínas BM e permitir uma detecção mais sensível do tráfico vesicular28,30. Os componentes envolvidos na deposição polarizada de BM no FE foram caracterizados pela primeira vez utilizando linhas de armadilha de proteína para Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Armadilhas proteicas podem ser usadas em diferentes origens genéticas, incluindo mutantes e linhas Gal4 34. Além disso, armadilhas proteicas podem ser usadas em combinação com corantes fluorescentes e/ou imunostaining de fluorescência, permitindo uma caracterização precisa da localização de proteínas BM ao comparar condições do tipo selvagem e mutantes35.
Avaliar com precisão e eficiência a distribuição e localização de vesículas contendo proteínas BM, microscopia de varredura a laser confocal (CLSM) e técnicas de imagem de super resolução apresentam uma vantagem significativa para outras abordagens de imagem. Estas abordagens acoplam imagens de alta resolução com relativa facilidade de uso. CLSM é uma técnica de microscopia que permite uma melhor resolução óptica escaneando a amostra com um laser em uma maneira de varredura raster usando galvanômetros. A abertura do pinhole é um componente central de um microscópio confocal. Bloqueando os sinais fora de foco provenientes de cima ou abaixo do plano focal, a abertura do pinhole resulta em uma resolução altamente superior no eixo z36. Isso também permite obter uma série de imagens no plano z, chamada de pilha z, correspondente a uma série de seções ópticas. z-stacks posteriormente criar uma imagem 3D do espécime, através de reconstrução 3D, com o auxílio de software de imagem. Microscópios convencionais de epifluorescência (widefield), ao contrário dos microscópios confocal, permitem que a luz fora de foco contribua para a qualidade da imagem, diminuindo a resolução da imagem e o contraste36,37. Isso torna a microscopia de epifluorescência um candidato menos atraente ao estudar localização ou colocalização de proteínas.
Embora o CLSM seja uma abordagem adequada para várias aplicações, incluindo imagem e caracterização do tráfico intracelular de proteínas BM, ele ainda apresenta um problema quando amostras de imagem abaixo do limite de difração de luz de Abbe (200-250 nm). Ao fotografar tais amostras, a microscopia confocal, especialmente quando se utiliza um objetivo de óleo, pode resultar em alta resolução. No entanto, as técnicas de super-resolução ultrapassam o limite da microscopia confocal. Existem várias abordagens para alcançar microscopia de super-resolução, cada uma com limites de resolução específicos, e cada uma apropriada para diferentes análises. Essas abordagens incluem microscopia de localização fotoativada (PALM) ou microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), microscopia de esgotamento de emissões estimulada (STED), microscopia de iluminação estruturada (SIM) e microscopia airyscana (super-resolução) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Embora o Airyscan tenha uma resolução mais grosseira que PALM/STORM, STED e SIM, ele ainda pode alcançar uma resolução de até ~120 nm (cerca de duas vezes a resolução do CLSM). Além disso, essa abordagem de microscopia de super resolução tem mostrado ter uma vantagem sobre o SIM e outras técnicas de super-resolução ao fotografar amostras grossas e amostras com uma baixa relação sinal-ruído47,48.
Airyscan é uma tecnologia de microscopia confocal relativamente nova46. Ao contrário dos CLSMs tradicionais, que usam o pinhole e os detectores de ponto único para rejeitar a luz fora de foco, esta abordagem de super-resolução usa um detector de área de tubo de arsultipto de arsênio de 32 canais (GaAsP) que coleta toda a luz em cada posição de varredura45. Cada um dos 32 detectores funciona como um pequeno pinhole, reduzindo o tamanho do pinhole da tradicional Unidade Aérea 1.0 (A.U.) para um 0,2 A.U., permitindo uma resolução ainda maior e relação sinal-ruído, mantendo a eficiência de um diâmetro de 1,25 A.U., 45. Além disso, a desconvolução linear usada pelo Airyscan resulta em até um aumento de 2x na resolução45. Levando isso em consideração, o CLSM, e especificamente a microscopia de super resolução, são adequados para estudar proteínas e proteínas de BM que regulam a deposição basal das proteínas BM, pois podem produzir imagens de alta resolução para estudos de localização e colocalização, fornecendo assim novas percepções nos eventos espaciais, temporais e moleculares que controlam esses processos.
Uma abordagem alternativa à microscopia confocal que pode ser usada para realizar experimentos de localização é a desconvolução de imagens. Uma vez que a microscopia widefield permite que a luz fora de foco atinja os detectores, algoritmos matemáticos e de desconvolução computacional podem ser aplicados para remover ou recoltir a luz fora de foco das imagens obtidas pela microscopia de campo largo, melhorando assim a resolução e o contraste da imagem49. Algoritmos de desconvolução também podem ser aplicados a imagens confocal para aumentar ainda mais a resolução e o contraste, produzindo imagens finais quase comparáveis à da microscopia de super resolução50. Airyscan faz uso da desconvolução baseada em filtro Weiner, juntamente com a redesignação de pixels de Sheppard, resultando em uma resolução espacial altamente melhorada e relação sinal-ruído. Em comparação com a microscopia confocal, observa-se um aumento de 2x em resolução nas três dimensões espaciais (120 nm em x e y, e 350 nm em z) ao utilizar esta técnica de microscopia de super resolução45,51.
Este manuscrito fornece protocolos detalhados e otimizados para manchar, adquirir e visualizar o tráfico intracelular e a deposição de proteínas BM utilizando o FE do ovário Drosophila como um sistema modelo aliado à microscopia confocal e super-resolução. As linhas de drosophila que expressam proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente, por exemplo, Vkg-GFP e Pcan-GFP, são ferramentas eficientes e precisas para visualizar o tráfico e a secreção de proteínas BM. Além disso, eles podem ser facilmente usados em diferentes origens genéticas, incluindo as linhas mutante e Gal4/UAS 34. Embora proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente sejam recomendadas, o uso de anticorpos contra proteínas BM específicas também é compatível com os protocolos descritos. Esses protocolos são particularmente úteis para cientistas interessados em estudar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas BM em tecido epitelial intacto usando imagens confocal e super-resolução. Além disso, a capacidade de combinar a análise do tecido epitelial com as ferramentas expansivas da genética drosophila torna essa abordagem especialmente poderosa. Finalmente, esses protocolos poderiam ser facilmente adaptados para estudar o tráfico vesicular e a triagem de outras proteínas de interesse.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>F-Actin Stain (1/500 de 66&micro; M)</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 647 faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>F-Actin Stain (1/100 de 66&micro; M))</td></tr><tr><td>Anti-GM130 Anticorpo</td><td>abcam</td><td>ab30637</td><td>Para Mancha de Golgi (colocalização); use como concentração de 7&micro; g / uL</td></tr><tr><td>Aqua-Polymount</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1860620</td><td>Levedura de padeiro de montagem</td></tr><tr><td>média (levedura seca ativa)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Para engordar os overies para dissecção Albumina</td>de</tr><tr><td>soro bovino (solução a 30%)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td>Para solução de bloqueio</td></tr><tr><td>de poços de depressão</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>7156101</td><td>Para dissecção (lâmina de concavidade de vidro pode ser usada em vez disso)</td></tr> <tr><td>Agulha de dissecação</td><td>Fisher scientifc</td><td>13-820-024</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Incubator</td><td>Genesee Scientific/Invictus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td><td></td><td></td><td>Morin et al., 2001</td></tr><tr><td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>33594</td><td>RNAi contra Crag</td></tr><tr><td>Estoque de mosca: Linha Viking-GFP Drosophila (CC00791)</td><td></td><td></td> <td>Buszczak et al., 2007</td></tr><tr><td>Estoque de mosca: Vkg-GFP, tj-Gal4</td><td></td><td></td><td>Devergne et al., 2017. Conduza a expressão de RNAi de Crag no Fórceps FE</td></tr><tr><td>(Dumont 5)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11251-30</td><td>Para dissecação</td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica</td> de<td>Lâmina de Concavidade de Vidro</td><td>7187804</td><td>Para dissecação (poços de depressão podem ser usados em seu lugar)</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>Anticorpo secundário (anticorpo GM130) (5 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>Hoechst (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>DNA Stain (1 ug/mL)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>Fisher Scientific: 06-666</td><td>Limpadores de limpeza de tarefa delicada</td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo Fluorescente Leica&nbsp; M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td>Para imagens de ovário</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Corning</td><td>294875X25</td><td>Lâminas de microscópio</td></tr><tr><td>Nutating plataforma rocker</td><td>Corning Life Sciences</td><td>6720</td><td>Para fixação e coloração de ovário</td></tr><tr><td>Nutri-Fly BF</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>Fly Food</td></tr><tr><td>Paraformaldeído 20% Solução</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>Fisher Científico: 15713</td><td>Para PFA 4%</td></tr> <tr><td>Phosphate Buffered Comprimidos Salinos</td><td>Fisher BP2944100 científico</td><td></td><td>Para solução</td></tr><tr><td>PBS Prolong Glass Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td>Montagem Medium</td></tr><tr><td>Square Cover Glass</td><td>Corning</td><td>285022</td><td>Vidro de cobertura para lâminas de microscópio</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>Para PBST</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900 com Airyscan 2</td><td>Microscópio confocal e de super-resolução</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico Zeiss Stemi 305 Microscópio de</td><td>dissecação</td><td>Zeiss</td><td></td></tr> Software <tr><td>Zeiss Zen versão 3.3 (Blue Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Aquisição e processamento de imagens</td></tr></tbody></table>

imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante drosophila oogenesis

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

A membrana do porão (ML) - uma folha especializada de matriz extracelular presente no lado basal das células epiteliais - é fundamental para o estabelecimento e manutenção da morfologia do tecido epitelial e da morfogênese do órgão. Além disso, o BM é essencial para a modelagem tecidual, servindo como uma plataforma de sinalização, e fornecendo forças externas para moldar tecidos e órgãos. Apesar dos muitos papéis importantes que o BM desempenha durante o desenvolvimento normal e as condições patológicas, as vias biológicas que controlam o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e como a secreção basal leva à deposição polarizada das proteínas BM são mal compreendidas. O epitélio folicular do ovário Drosophila é um excelente sistema modelo para estudar a deposição basal de proteínas de membrana BM, pois produz e secreta todos os principais componentes do ovário BM. A imagem confocal e super-resolução combinada com o processamento de imagens em tecidos fixos permite a identificação e caracterização de fatores celulares especificamente envolvidos no tráfico intracelular e na deposição de proteínas BM. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para coloração e imagem de vesículas contendo BM e BM depositado usando proteínas marcadas endogenosamente no epitélio folicular do ovário de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado para abordar questões qualitativas e quantitativas e foi desenvolvido para acomodar a triagem de alto rendimento, permitindo a identificação rápida e eficiente dos fatores envolvidos no tráfico intracelular polarizado e secreção de vesículas durante o desenvolvimento do tecido epitelial.

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para imagem eficiente e precisa e caracterizar o tráfico intracelular e secreção de proteínas BM em células epiteliais polarizadas, como a FE do ovário de Drosophila . Em seguida, fornecemos resultados antecipados obtidos usando os métodos descritos, bem como conselhos úteis e potenciais armadilhas. Para isso, é utilizado O Vkg-GFP, um Vkg com etiqueta endógena (Drosophila Col IV). No entanto, os mesmos resultados podem ser alcançados com outras proteínas B...

A membrana do porão é essencial para morfogênese tecidual e órgão durante o desenvolvimento. Para entender melhor os mecanismos que levam à colocação adequada dessa estrutura, o protocolo apresentado descreve métodos para visualizar e caracterizar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas de membrana de porão em células epiteliais utilizando microscopia confocal e super-resolução.

Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Este protocolo permite a caracterização do tráfico intracelular e secreção de proteínas de membrana de porão usando a matriz Drosophila como sistema modelo. A principal vantagem de nossa técnica é que ela permite imagens de alta resolução do tráfico intracelular de proteínas de membrana de porão usando proteínas endógenas marcadas e microscopia de super-resolução airyscan. Embora este protocolo seja desenvolvido para imaginar o tráfico intracelular de proteínas de membrana de porão, pode ser estendido para estudar o tráfico de outras proteínas de interesse e outros sistemas biológicos, incluindo cultura celular e organoides.Para começar, depois de dissecar os ovários de Drosophila em PBS sob um escopo dissecando, adicione um mililitro de solução de fixação e fixe os ovários em uma plataforma de nozes por 15 minutos. Remova a solução de fixação e realize duas lavagens rápidas, cada uma com um mililitro de PBST. Invertendo suavemente os tubos de microcentrifuuge cinco a seis vezes, em seguida, executar quatro lavagens longas de 10 minutos cada com um mililitro de PBST em um roqueiro de plataforma nutating.Depois de realizar a fixação e lavagem, remova o PBST e adicione um mililitro d

confocal-super-resolution-imaging-polarized-intracellular-trafficking

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Fonte: Wagner, K. et al., Estudando o tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas com eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra a visualização do tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas TRPL marcadas com eGFP. Ele detalha a preparação de moscas transgênicas para imagens, a captura de imagens de fluorescência de células fotorreceptoras e a quantificação do tráfego de TRPL medindo a...

Estudando o tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila

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Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

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Experimentos de imunocoloração e penetração de corantes para definir proteínas de junção septata plissada no núcleo em epitélios embrionários de Drosophila

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Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis (Vídeo) | JoVE Journal

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