Name: Extração de Aminoácidos Não Proteicos de Cianobactérias para Cromatografia Líquida - Análise de Espectrometria de Massas em Tandem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a extrair aminoácidos não proteicos de cianobactérias usando precipitação com TCA e cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem. Este método validado permite detectar BMA e seus isômeros com resultados consistentes.

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D.P.B., K.J.R. e S.M.M. são apoiados pela Fundação Ian Potter, e J.P.V. é o destinatário de um Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano, Stipend.

A espécie de cianobactérias Merismopedia foi utilizada para o presente estudo38.
1. Preparação bruta da amostra
<ol><li>Recolher a escória de algas da fonte aquática de interesse ou de um balão cultivado com cianobactérias e colocá-la num tubo de centrífuga de 50 ml38. NOTA: A amostra deve ser congelada a -20 °C para extrações posteriores e descongelada antes da etapa seguinte.</li>
	<li>Centrifugar os tubos que contêm a amostra a 3,500 x g durante 10 min a 25 °C. Decantar o sobrenadante em um recipiente de resíduos e descartá-lo em resíduos biológicos. NOTA: O sobrenadante pode ser reservado para análise futura do exossomo.</li>
	<li>Cubra o tubo que contém o pellet de amostra com segurança com uma película de vedação (ver Tabela de Materiais) e perfure alguns orifícios no filme usando um pinçador de nariz longo e afiado. Conservar o tubo na posição vertical a -80 °C durante 30 minutos.</li>
	<li>Ligue e equilibre o liofilizador a 0,1 mbar e a -80 °C (~30 min). NOTA: Os parâmetros (etapa 1.4) são otimizados para o liofilizador utilizado para o presente estudo (ver Tabela de Materiais). Siga os procedimentos operacionais padrão de acordo com o modelo de liofilizador disponível no laboratório ou defina a temperatura mais baixa possível se o modelo de liofilizador não for tão baixo quanto -80 °C.<ol><li>Coloque o(s) tubo(s) de centrífuga na posição vertical em um recipiente de vidro do liofilizador e coloque-o dentro do congelador a -80 °C por 5 minutos para resfriar o frasco.</li>
		<li>Retire o recipiente de vidro do congelador e prenda a tampa de borracha.</li>
		<li>Certifique-se de que a alça na saída da válvula de borracha do liofilizador esteja ventilada para a atmosfera (apontando para cima) e prenda o recipiente de vidro com firmeza.</li>
		<li>Gire a alça da saída da válvula de borracha muito lentamente para a posição apontando para baixo para expor o frasco ao vácuo e permita até 24 h de liofilização para garantir a sublimação de todo o líquido.</li>
		<li>Para liberar o vácuo no frasco, gire a alça para a posição apontando para cima, retire o recipiente de vidro e remova as amostras liofilizadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Use uma balança analítica para pesar 15-50 mg de pellets de amostra seca em um tubo de centrífuga de 15 mL. NOTA: As amostras podem ser colocadas em armazenagem a -80 °C se não forem posteriormente processadas nesta fase.</li>
</ol>2. Lisamento celular e fracionamento de NPAAs livres
<ol><li>Adicionar 100 μL de 100 ng/ml de D5-2,4-DAB (ver Tabela de Materiais) de série utilizando uma micropipeta ao tubo de amostra (opcional).</li>
	<li>Adicionar 300-600 μL de tricloroacético aquoso a 10% p/v (TCA, ver Tabela de Materiais) ou 300-600 μL de TCA 11,7%-13,3%, respetivamente, se adicionar o padrão D5-2,4-DAB. NOTA: Escolha um volume de TCA aquoso que cubra totalmente o pellet.</li>
	<li>Coloque os tubos de amostra em um recipiente cheio de gelo triturado.</li>
	<li>Use um sonicator de sonda (consulte Tabela de Materiais) em potência média-alta (70%) e lise a amostra por 1 minuto seguindo as etapas abaixo. CUIDADO: Garanta um EPI adequado com o uso de protetores auriculares com cancelamento de ruído.<ol><li>Siga os protocolos de segurança apropriados em preparação para o uso do sonicador de sonda, colocando sinalização em uso na porta, realizando sonicação no exaustor de fumaça e usando protetores auriculares com cancelamento de ruído.</li>
		<li>Ligue o sonicator e insira os seguintes parâmetros: amplitude, 70%; tempo, 1 min.</li>
		<li>Pulverize 70% de etanol em um lenço de papel sem fiapos (consulte Tabela de materiais) e limpe a sonda.</li>
		<li>Mergulhe totalmente a extremidade da sonda na amostra e pressione start.</li>
		<li>Quando o sonicator da sonda parar, coloque o tubo de centrífuga contendo a amostra no gelo por 1 min.</li>
		<li>Para garantir que as células sejam lisadas, repita as etapas 2.4.3-2.4.5 mais uma vez.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar a amostra num frigorífico a 4 °C durante 12-24 h para permitir a precipitação proteica.</li>
	<li>Centrifugar a amostra aquosa de TCA a 10% a 3.500 x g durante 15 min a 8 °C.</li>
	<li>Use uma micropipeta para transferir o sobrenadante para um tubo de 2 mL rotulado como "Fração Livre".</li>
	<li>Micropipeta 400 μL de TCA aquoso a 10% para o tubo de centrífuga que contém o pellet de amostra restante e quebre o pellet por agitação de vórtice ou com a ponta da micropipeta.</li>
	<li>Repita os passos 2,6-2,7, transferindo o sobrenadante para o mesmo tubo de "Fração Livre" de 2 mL.</li>
	<li>Micropipeta 400 μL de TCA/acetona a 10% para o tubo de centrífuga com o pellet restante e quebre o pellet com vórtice ou a ponta da micropipeta.</li>
	<li>Centrifugar a amostra de TCA/acetona a 10% a 3.500 x g durante 15 min a 8 °C. Use uma micropipeta para transferir o sobrenadante para o tubo de 2 mL rotulado como "Fração Livre".</li>
	<li>Colocar o tubo de "fracção livre" com a tampa aberta num evaporador centrífugo (ver Tabela de Materiais) até que todos os líquidos voláteis sejam removidos (pelo menos 1 h).</li>
	<li>Uma vez que a amostra esteja livre de líquidos voláteis, cubra o tubo com segurança com filme de vedação e perfure o filme com alguns orifícios usando um pinçador de nariz longo e afiado. Colocar a amostra num congelador a -80 °C.</li>
	<li>Liofilizar a amostra de "Fração Livre" repetindo todas as etapas da etapa 1.4.</li>
	<li>Micropipeta de 200 μL de ácido clorídrico (HCl) a 20 mM para o tubo de "Fração Livre" para reconstituir a amostra liofilizada e colocá-la em armazenamento congelador a -80 °C. NOTA: A "Fração livre" da amostra está pronta para filtração na etapa 4. O pellet restante será processado nas etapas seguintes para fracionamento de proteínas.</li>
</ol>3. Fracionamento dos NPAAs ligados às proteínas
<ol><li>Use um gravador de vidro para rotular frascos de casca de vidro com os detalhes da amostra para identificação. NOTA: O ácido forte pode dissipar a etiquetagem da tinta; portanto, recomenda-se gravar os rótulos em vidro.</li>
	<li>Micropipeta 100 μL de 100 ng/mL padrão D5-2,4-DAB no pellet da amostra (opcional).</li>
	<li>Micropipeta 400 μL de acetona a 100% sobre o pellet da amostra e quebre o pellet usando a agitação do vórtice ou a ponta da micropipeta.</li>
	<li>Use uma micropipeta de 1 mL ajustada a 1.000 μL para transferir o pellet lavado e ressuspenso para o frasco para injetáveis de casca de vidro correspondente. NOTA: Outros 400 μL de acetona a 100% podem ser adicionados ao pellet agitado para ajudar na transferência completa do pellet para o frasco para injetáveis de casca de vidro. Isso pode ser repetido uma terceira vez, se necessário.</li>
	<li>Centrifugar a 8 000 x g durante 5 min a 25 °C e decantar o líquido em resíduos biológicos.</li>
	<li>Coloque o pellet restante em um evaporador centrífugo até que todo o líquido seja removido e o pellet esteja seco (~ 1 h).</li>
	<li>Prepare o frasco para injetáveis de hidrólise a vácuo adicionando 1 ml de HCl 6 M no fundo do frasco para injetáveis de hidrólise.</li>
	<li>Use pinças para inserir cuidadosamente os frascos para injetáveis com casca rotulados contendo as amostras secas no frasco para injetáveis de hidrólise, garantindo uma posição vertical e estável. NOTA: Podem ser utilizados frascos para injetáveis com casca vazia para ajudar a manter os frascos para injetáveis de amostra na posição vertical se o número de amostras for inferior à capacidade do frasco para injetáveis de hidrólise.</li>
	<li>Fixe a tampa ao frasco para injetáveis de hidrólise e empurre o botão vermelho na tampa para fechar a válvula.</li>
	<li>Ligue a bomba de vácuo, prenda o tubo de vácuo à cabeça da tampa do frasco para injetáveis de hidrólise e pressione o botão verde na tampa para abrir a válvula.</li>
	<li>Deixe a bomba de vácuo (ver Tabela de Materiais) remover o ar do frasco para injetáveis durante 1 min.</li>
	<li>Feche o frasco para injetáveis pressionando o botão vermelho na tampa do frasco para injetáveis de hidrólise, desligue a bomba de vácuo e remova o tubo de vácuo.</li>
	<li>Fixe um tubo de borracha à torneira de gás nitrogênio na bancada do laboratório e abra a torneira ligeiramente. Coloque o polegar na extremidade do tubo, sele-o e conte até que o gás comece a escapar à medida que a pressão se acumula. Este será o prazo para a próxima etapa. Ajuste o fluxo de gás para um período de tempo adequado.</li>
	<li>Fixe a outra extremidade do tubo de borracha à cabeça da tampa do frasco para injetáveis de hidrólise e, em seguida, empurre imediatamente o botão verde da tampa. Conte até ao tempo determinado no passo 3.13 e empurre rapidamente o botão vermelho da tampa e remova o tubo de borracha.</li>
	<li>Repita os passos 3.10-3.14 duas vezes para garantir que o frasco para injetáveis de hidrólise de vidro está livre de ar e cheio de gás azoto.</li>
	<li>Colocar o frasco para injetáveis de hidrólise num forno pré-aquecido regulado a 110 °C durante 16-18 h.</li>
	<li>Use luvas de forno para remover o frasco de hidrólise de vidro do forno e deixe-o esfriar dentro do exaustor por 10 min. Dentro do exaustor, enquanto o encara para longe de você, empurre o botão verde para liberar pressão e gás.</li>
	<li>Use pinças para remover os frascos para injetáveis com casca do frasco para injetáveis de hidrólise.</li>
	<li>Reconstituir os pellets de amostra hidrolisados por micropipetagem de 200 μL de HCl de 20 mM no frasco para injetáveis com casca. Certifique-se de que o pellet seja ressuspenso por vórtice ou usando uma ponta de pipeta.</li>
	<li>Centrifugar os frascos para injetáveis contendo os pellets de amostra reconstituídos durante 2 minutos a 5,300 x g e 25 °C.</li>
</ol>4. Filtragem de amostras
<ol><li>Rotular tubos filtrantes de 2 ml (ver Tabela de Materiais) contendo filtros de membrana de poros de 0,2 μm como "Fração Livre" e "Fração de Proteína".</li>
	<li>Transferir as amostras reconstituídas das etapas 2.15 (fracção livre) e 3.20 (fracção proteica) para os tubos filtrantes correspondentes.</li>
	<li>Colocá-los na centrífuga durante 30 minutos a 5.000 x g e a 25 °C.</li>
	<li>Remova os filtros dos tubos de filtro e tampa-os. As amostras estão agora prontas para a derivatização de aminoácidos na etapa 5. NOTA: As amostras podem ser colocadas no congelador a -80 °C para armazenamento para posterior derivatização e análise.</li>
</ol>5. Derivatização de aminoácidos
<ol><li>Derivatizar as amostras utilizando cloroformiato de propilo (PCF)39 ou 6-aminoquinolilo-N-hidrossuccinimidil carbamato (AQC)40 de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo de extração descrito aqui para a análise de NPAAs aplica-se à análise de quaisquer aminoácidos em amostras biológicas. Para guias sobre isolamento e cultivo de cepas cianobacterianas, pode-se consultar os métodos apresentados no estudo de Violi et al.38. A primeira etapa do protocolo leva a amostra a um ponto em que a normalização entre as amostras em relação ao peso seco pode ser alcançada. O segundo passo é a lise celular para liberar os analitos e pode ser realizada usando uma série de técnicas, incluindo rupturas mecânicas / lises, como sonicação da sonda, conforme descrito neste protocolo, ciclos de congelamento / descongelamento, moagem e moagem de contas e rupturas não mecânicas, como lise enzimática, detergente e / ou química. Sabe-se que a ruptura mecânica é vantajosa em relação à não mecânica, pois permite uma maior capacidade da amostra de lisar, permitindo que as ligações intracelulares e as proteínas permaneçam intactas41, embora a matriz da amostra possa ditar o método ideal para a lise celular.
A precipitação de proteínas é o terceiro passo crítico deste protocolo ao extrair aminoácidos para análise. O TCA é o solvente mais comumente usado; no entanto, ácido perclórico, acetona, éter metil-terc-butílico (MTBE), metanol e/ou acetonitrila 8,42 também foram utilizados, onde cada solvente de extração é destinado a extrair e precipitar diferentes substratos. O modelo aqui descrito extrai o NPAA BMAA e seus isômeros de uma matriz cianobacteriana e, embora uma gama de solventes diferentes tenha sido utilizada, os dois mais comuns são 10% de TCA em água (aquosa) e 10% de TCA em acetona. Em geral, a precipitação de proteínas com TCA é comumente usada para extrair aminoácidos para fracionar aminoácidos livres dos aminoácidos ligados à proteína. Além disso, a extração de TCA permite determinar o teor de proteína total, reduzindo os contaminantes para a fração livre e reduzindo a atividade das proteases com degradação proteica mínima43. A extração de TCA da fração livre funciona enxaguando inicialmente substâncias orgânico-solúveis, deixando para trás proteínas e compostos insolúveis, como restos de parede celular no precipitado, que é seguida pela extração de hidrólise térmica dos aminoácidos ligados à proteína (fração ligada) usando um ácido forte.
O fracionamento da fração livre com 10% de TCA aquoso mais sonicação produz a precipitação proteica mais extensa em comparação com outros solventes orgânicos44 e as melhores recuperações de aminoácidos42. Alguns estudos optam por usar um ácido combinado com um solvente orgânico (ou seja, 10%-20% de TCA na acetona 43) para precipitar mais moléculas, incluindo peptídeos / biomoléculas menores, minimizar a degradação de proteínas e reduzir contaminantes, como sais43. Outra vantagem do TCA de 10% na acetona é sua taxa de secagem mais rápida na preparação do pellet para hidrólise, minimizando o resíduo de umidade para evitar a modificação de aminoácidos. No entanto, 10% de TCA aquoso mais sonicação tem melhores eficiências de extração de aminoácidos livres quando comparado a 10% de TCA na acetona44 sozinha. Além disso, a precipitação aquosa de TCA a 10% apresenta limitações como um longo tempo de secagem, não sendo capaz de precipitar todas as proteínas ou pequenos peptídeos/biomoléculas, e dependendo do analito de interesse (ou seja, proteínas ou aminoácidos), necessitando de aditivos e agentes redutores para prevenir a oxidação e degradação45,46.
Este protocolo usa uma combinação de 10% de TCA aquoso e 10% de TCA em acetona para aumentar a precipitação de proteínas, garantir que peptídeos/biomoléculas menores sejam precipitados, permitir tempos de secagem de pellets mais rápidos e aumentar a eficiência da extração, aproveitando ambas as propriedades de extração com solvente. No entanto, a combinação de 10% de TCA aquoso e 10% de TCA em acetona pode precipitar pequenos peptídeos/biomoléculas na fração livre após o 10% de TCA no sobrenadante de acetona ser combinado com a fração livre aquosa. Neste caso, os precipitados devem ser transferidos para a fração ligada para hidrólise.
A segunda metade deste protocolo envolve a liberação de aminoácidos (ou seja, BMAA) do pellet de proteína via hidrólise ácido-vapor a temperaturas elevadas em um ambiente livre de oxigênio. O fator predominantemente limitante para a etapa de hidrólise é que é demorado e trabalhoso de preparar. A incubação durante a noite impede a preparação e análise de amostras rápidas e eficientes em termos de tempo. Além disso, a transferência quantitativa do pellet de um tubo de centrífuga para um frasco para injetáveis (passo 3.4) é um processo árduo que requer diligência e paciência para garantir um ponto preciso de normalização para o peso seco. Possíveis problemas que o usuário pode enfrentar são a transferência incompleta do pellet, proteínas precipitadas úmidas aderindo às pontas da pipeta e ao tubo original e partículas sólidas do pellet bloqueando a ponta da pipeta. Uma sugestão prática para ajudar a uma transferência mais fácil do pellet é remover cerca de 0,3-0,5 mm da extremidade da ponta da pipeta com um par de tesouras, permitindo que partículas maiores de pellets sejam retiradas e liberadas no frasco para injetáveis da casca. Este método de transferência é uma prática comum para a extração de proteínas para todas as análises de aminoácidos. No entanto, devem ser investigadas modificações para melhorar a eficiência e a precisão da transferência quantitativa do pellet para o frasco para injetáveis de concha.
Duas formas de técnicas de hidrólise podem ser empregadas para liberar aminoácidos de seu estado ligado às proteínas: hidrólise em fase líquida e hidrólise ácido-vapor. A hidrólise em fase líquida, que envolve a adição de HCl 6 M à amostra, que é então colocada em forno a 110 °C durante a noite, é uma alternativa à hidrólise ácido-vapor descrita neste protocolo. Técnicas de extração que empregam hidrólise em fase líquida podem exigir processamento adicional, como a dessalinização, especialmente se a derivatização de AQC for escolhida, pois requer condições básicas para a marcação40. A hidrólise ácido-vapor evita a dessalinização e permite ao usuário a liberdade de escolher a técnica de derivatização após a reconstituição do pellet final antes da filtração. Além disso, independentemente do método de hidrólise escolhido, as amostras podem necessitar de processamento adicional, como SPE para purificação e concentração da matriz 29,47,48, dependendo da escolha da técnica de derivatização e/ou análise analítica (por exemplo, fase reversa LC-MS/MS vs. cromatografia líquida de interação hidrofílica [HILIC] LC-MS/MS 37 ). A reconstituição do pellet final em HCl 20 mM neste protocolo é apropriada para derivatização usando reagentes PCF48através de um kit de hidrólise de aminoácidos39 comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Tanto o AQC quanto o PCF derivarão todos os aminoácidos, proteínas e não proteínas de origem presentes na amostra, e a seletividade dos analitos é obtida através do uso de LC-MS/MS e sua combinação de correspondência de tempo de retenção e seleção cuidadosa do quantificador e qualificador MRMs38. 
Os protocolos atuais de hidrólise não são otimizados para a liberação de BMAA, 2,4-DAB e AEG, mas para os 22 aminoácidos proteicos baseados nos métodos existentes para hidrólise proteica 32, onde a incubação por mais de 18 h resulta na degradação e modificação de certos aminoácidos, afetando a análise LC-MS/MS e, portanto, as concentrações obtidas32. Beach et al.49 investigaram a hidrólise ao longo do tempo (0,5-120 h) para otimizar a hidrólise para análise do BMAA e dos aminoácidos proteinogênicos. Eles descobriram que, embora tenha havido uma liberação rápida precoce de BMAA durante os primeiros 0,5 h da hidrólise, os níveis de BMAA continuaram a aumentar à medida que o tempo de hidrólise aumentava, sem degradação, mesmo após 5 dias49. Há também ainda diferentes visões e questões sobre a verdadeira natureza do BMAA ligado e seus isômeros, com alguns estudos sugerindo que, em vez de ligação BMAA 50,51 ou má incorporação em proteínas14, a associação BMAA-proteína é superficial52. No entanto, o consenso atual na análise do BMAA "ligado" requer a etapa de hidrólise validada e amplamente aceita que separa peptídeos / proteínas para liberar aminoácidos e, portanto, BMAA e seus isômeros.
As taxas de recuperação de 20 aminoácidos proteicos foram determinadas em um estudo de Sedgwick et al.42 utilizando a extração de TCA, resultando em aproximadamente 100% de recuperação. No caso do BMAA e seus isômeros de matrizes de algas, estudos comparando a eficiência da extração de BMAA utilizando vários solventes de extração encontraram 10% de TCA como o mais eficiente para BMAA livre27. As taxas de recuperação do BMAA ligado à proteína extraído por hidrólise em fase líquida foram estabelecidas em estudos de Glover et al.25 e de Faassen et al.53, onde a acurácia foi determinada por métodos de recuperação spiked, com uma taxa média de recuperação do BMAA de 108,6% e 70%, respectivamente. Faassen et al. descreveram procedimentos para experimentos de recuperação de spike e ilustraram como a recuperação difere dependendo do estágio do processo de extração que o spike foi feito53. Faassen e col. determinaram adicionalmente a eficiência do protocolo ácido-vapor aqui apresentado, com taxas de recuperação de 83,6% para os isômeros BMAA cravados antes da extração e 68,6% para aqueles cravados antes da hidrólise24. Essas recuperações, métodos de extração e análises foram validados por Banack 26, com taxas de recuperação de 94%-106% para BMAA em uma matriz cianobacteriana e um %Desvio Padrão Relativo (%RSD) entre 5,6% e20%, atendendo aos critérios de precisão da FDA54. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça inicialmente suas taxas de recuperação e precisão antes de utilizar este protocolo por meio de experimentos de recuperação de pico. Os métodos de recuperação apresentados em Faassen et al.53 e Glover et al.25 podem ser seguidos como guia.
Formas alternativas de técnicas de hidrólise podem ser utilizadas em vez de hidrólise em forno durante a noite para uma extração mais rápida ligada às proteínas do analito. Por exemplo, um extrator de micro-ondas poderia reduzir significativamente o tempo de hidrólise de 24 h para apenas 10 min55. A hidrólise de micro-ondas para aminoácidos usa os mesmos princípios que o método térmico convencional, usando um porta-luvas para preparar e montar o recipiente de micro-ondas em um ambiente livre de oxigênio e adicionando 6 M HCl. Uma vez hermético, o recipiente que contém a amostra sofre radiação de micro-ondas. A hidrólise de micro-ondas tem sido utilizada para extrair aminoácidos de várias matrizes de amostras56,57,58; no entanto, a hidrólise de micro-ondas ainda não foi desenvolvida e validada para a análise do BMAA.
Em conclusão, a precipitação aquosa de 10% da proteína TCA é o método ideal para extrair aminoácidos livres não proteicos de matrizes cianobacterianas27, e a hidrólise térmica fornece uma extração confiável e reprodutível da fração ligada à proteína. Este protocolo para extrair o NPAA BMAA e seus isômeros de cianobactérias é validado e amplamente aceito. Direções futuras para otimizar ainda mais a extração de BMAA se concentrarão na etapa de hidrólise, que é realizada de acordo com as especificações dos 22 aminoácidos proteicos. No entanto, o protocolo de extração aqui apresentado ainda deve ser considerado eficiente e eficaz para a análise do BMAA e seus isômeros via LC-MS/MS.

Os aminoácidos são compostos químicos que contêm pelo menos uma amina e um grupo funcional carboxílico. Alguns aminoácidos também contêm um grupo imino, um grupo ácido funcional diferente do carboxílico; outros aminoácidos têm grupos amina que não estão ligados ao grupo α-carbono1. Existem mais de 500 aminoácidos2, 22 dos quais são conhecidos como aminoácidos proteicos utilizados para codificação genética na síntese de proteínas ribossomais3. Estes 22 aminoácidos podem ainda ser subdivididos em essenciais e não essenciais. Os aminoácidos essenciais são necessários para que um organismo funcione corretamente e só podem ser adquiridos por fontes externas. Os aminoácidos não essenciais podem ser sintetizados dentro do organismo. A classificação dos 22 aminoácidos em essenciais/não essenciais é exclusiva de espécies individuais. Todos os outros aminoácidos são aminoácidos não proteicos (NPAAs) que não são codificados para a síntese de proteínas. Os aminoácidos, sejam eles proteicos ou não proteicos, também podem desempenhar um papel de sinalização dentro de um organismo e atuar como intermediários metabólicos4. Devido aos seus papéis importantes e variados, os níveis de aminoácidos podem fornecer uma visão sobre a condição do organismo, funcionalidade e vias metabólicas, etc. Existem dois mecanismos principais pelos quais os aminoácidos podem ser incorporados em uma cadeia polipeptídica: a síntese proteica ribossomal, que utiliza os 22 aminoácidos na codificação, e a síntese de peptídeos não ribossômicos, que, juntamente com os aminoácidos proteicos, permite o uso de alguns NPAAs na síntese. Certos NPAAs podem imitar aminoácidos proteicos, potencialmente levando à sua má incorporação em peptídeos e proteínas. A má incorporação provoca um desdobramento de proteínas, que, por sua vez, tem efeitos prejudiciais5, como a má incorporação da NPAA L-3,4 di-hidroxifenilalanina (L-DOPA) no lugar da tirosina, impactando negativamente a função celular e a saúde 6,7. Uma fonte adicional de NPAAs incorporados é através da modificação pós-translacional (PTM) de resíduos de aminoácidos. Os resíduos de aminoácidos são modificados por várias razões, incluindo alterações na conformação, estabilidade e funcionalidade do peptídeo ou da proteína. Após a hidrólise de proteínas ou peptídeos contendo PTM, esses resíduos de aminoácidos modificados são liberados em sua forma livre de NPAA 8,9.
A NPAA β-metilamino-L-alanina (BMAA) produzida por cianobactérias, diatomáceas e dinoflagelados 10 é uma neurotoxina suspeita que está implicada como fator contribuinte para várias doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica/complexo parkinsonismo-demência (ALS-PDC)11,12, esclerose lateral amiotrófica e doença de Alzheimer13 . Sugere-se que o BMAA é erroneamente incorporado na cadeia polipeptídica de proteínas no lugar da L-serina14 e / ou outros aminoácidos proteicos. A má incorporação do BMAA pode levar ao desdobramento das proteínas, resultando na deposição de agregados proteicos nos neurônios14. Na última década, o interesse no BMAA aumentou significativamente. Descobriu-se que uma ampla gama de espécies de cianobactérias de ambientes de água doce, marinha e salobra produz BMAA15, levando à sua ampla distribuição em vários ecossistemas16,17. Além disso, o BMAA demonstrou biomagnificar através da cadeia alimentar até a cadeia alimentar humana18,19. Devido aos potenciais efeitos na saúde, falta de compreensão e incongruências da toxicidade do BMAA, é imperativo continuar a pesquisa até que a toxicidade do BMAA seja finalmente compreendida ou o BMAA seja considerado seguro20,21.
A análise de aminoácidos em amostras biológicas pode ser dividida em quatro etapas principais: preparação da amostra, derivatização de aminoácidos, separação e detecção, e identificação e quantificação. Cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) é o método de análise preferido, pois fornece uma separação e análise direcionadas e reprodutíveis de aminoácidos.
As técnicas de preparação de amostras para análise de cianobactérias e outras amostras de algas envolvem predominantemente um método de extração de aminoácidos em suas formas livres e ligadas a proteínas. Ao longo dos anos, os métodos de extração permaneceram relativamente consistentes com elementos comuns, incluindo a desolvação da amostra para separar os aminoácidos livres de sua forma ligada, seguida de precipitação de proteínas e liberação dos aminoácidos ligados através da hidrólise com ácido clorídrico (HCl) a temperaturas elevadas22 . Esta forma de extração foi otimizada para aminoácidos proteicos e empregada para NPAAs. Entretanto, a detecção e quantificação do BMAA e seus isômeros (Figura 1), aminoetilglicina (AEG) e ácido 2,4-diaminobutírico (2,4-DAB), em uma mesma espécie de cianobactérias, têm mostrado resultados inconsistentes na literatura, com uma possível explicação residindo em diferenças nas condições de crescimento e/ou na cepa de algas produtoras de quantidades variáveis ou inexistentes de BMAA23 . Argumentou-se que uma explicação mais provável para as inconsistências na detecção e quantificação do BMAA e seus isômeros se deve a protocolos experimentais não validados, ao uso de uma ampla gama de técnicas analíticas e ao detalhamento experimental insuficiente nos métodos relatados16,24, levando a dados interlaboratoriais irreprodutíveis. No entanto, Glover et al.25 e Banack26 desenvolveram e validaram recentemente uma técnica analítica para a detecção e quantificação do BMAA e seus isômeros usando cromatografia líquida de ultraeficiência (UPLC)-MS/MS de acordo com as diretrizes da International Society of Analytical Chemists (AOAC), da Farmacopeia dos EUA e da FDA necessárias para a validação de laboratório único.
Esses experimentos de validação se concentraram na separação e detecção de BMAA e seus isômeros e não abordaram as inconsistências nos protocolos de preparação de amostras. Lage et al.27 compararam o desempenho de três métodos comuns de extração para quantificação do BMAA e seus isômeros em amostras de cianobactérias via LC-MS/MS: extração em fase sólida (SPE) de aminoácidos livres28,29; um método de precipitação de proteínas que envolva uma extracção de metanol e precipitação de acetona30; e o método de extração mais utilizado para o BMAA, a precipitação proteica com ácido tricloroacético (TCA)31. Eles concluíram que a precipitação da proteína TCA foi o protocolo ideal, produzindo maiores concentrações de BMAA nas amostras de teste em comparação com os outros métodos de extração. Seu estudo validou a extração de TCA com derivatização de BMAA usando 6-aminoquinolilo-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) em uma matriz de cianobactérias, fornecendo um guia estabelecido para obter dados confiáveis e reprodutíveis de BMAA. A extração de aminoácidos TCA é uma técnica de preparação de amostras aceita e comum que também pode ser aplicada a outras matrizes. No entanto, a estabilidade do aminoácido durante a hidrólise precisa ser considerada para evitar a degradação ou oxidação, que pode ser superada com o uso de modificadores químicos e agentes redutores32. A extração de TCA é rotineiramente utilizada e ensinada a novos alunos de pesquisa e, embora o protocolo seja amplamente divulgado, um auxílio visual na aplicação desse método é um recurso valioso, garantindo uma execução adequada e consistente.
A cromatografia de fase reversa é comumente usada para separar aminoácidos, exigindo uma etapa de derivatização antes das análises. A derivatização de aminoácidos como o BMAA permite a retenção cromatográfica e pode aumentar a resolução entre isômeros. Também aumenta a massa molecular e melhora a ionização no espectrômetro de massa. Vários reagentes derivatizantes têm sido utilizados para a análise de aminoácidos via LC-MS/MS, incluindo cloroformiato de propila (PCF)33, 6-aminoquinolilo-N-hidrossiciuccinimidil carbamato (AQC)27, 9-fluorenilmetil cloroformato (FMOC)34 e cloreto de dansila (DC)35. No entanto, as únicas técnicas validadas para análise do BMAA utilizaram o PCF 36 ou o AQC 24,26,37 como reagente derivatizante.
O escopo deste protocolo está focado na extração de TCA de NPAAs de matrizes cianobacterianas. É um método intensivo em mão-de-obra que é rotineiramente usado e ensinado em laboratórios de pesquisa acadêmicos e industriais com base em manuscritos que podem ser curtos em detalhes; portanto, este protocolo fornece detalhes do procedimento e das técnicas envolvidas no preparo de amostras para a análise de BMAA livre e ligado como aminoácido modelo.

<table><tbody><tr><td>Frascos de vidro de 1 mL</td><td>SHIMADZU</td><td>REST-24663</td><td></td></tr><tr>Solução <td></td><td></td><td>de TCA a 10%</td><td>Diluir 100% (p/v) a 10% de TCA aquoso&nbsp;</td></tr><tr>Solução <td></td><td></td><td>de TCA 100%</td><td>Dissolva o TCA em água de acordo com a seguinte proporção 2,2 g:1 mL (TCA:H2O)</td></tr><tr><td>1000 &micro; L micropipeta</td><td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td><td>Z683809</td><td></td></tr><tr>solução <td></td><td></td> de<td>TCA a 13,3%</td><td>Diluir 100% (p/v) a 13,3% de TCA aquoso&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de 2 mL</td><td>MERCK</td><td>BR780546-500EA</td><td></td></tr><tr><td>20 mM HCl</td><td>Chem-Supply Pty Ltd</td><td>7647-01-0</td><td>Feito de estoque</td></tr><tr><td>20-200 &micro; L micropipeta</td><td>Ependorf/Sigma-Aldrich</td><td>Z740441</td><td></td></tr><tr><td>6 M HCl</td><td>Chem-Supply Pty Ltd</td><td>7647-01-0</td><td>Fabricado a partir de etanol 70</td></tr><tr><td>%</td><td>Supelco</td><td>1.11727</td><td>Diluído 70:1 Etanol:</td></tr><tr><td>água-80 &deg; C Freezer</td><td>Martin CHRIST 102142</td><td></td><td>Alpha 2-4 Ldplus</td></tr><tr><td>AccQ-Tag Ultra Kit de Derivatização&nbsp;</td><td>Waters</td><td>186003836</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Chem-Supply Pty Ltd</td><td>34967-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Balança Analítica Balança</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporador Centrífugo</td><td>Thermo Scientific</td><td>13442549</td><td>DNA120-115 Centrífuga Concentradora SpeedVac</td></tr><tr><td></td><td>MERCK</td><td>EP022620100-1EA</td><td></td></tr><tr><td>D5-2,4-DAB padrão</td><td>CDN Isótopos</td><td>D-7568</td><td></td></tr><tr><td>Forno de Secagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ez:faastTM Kit de Análise de Aminoácidos</td><td>Phenomenex</td><td>CEO-8492</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de tubo Falcon Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon</td><td>MERCK</td><td>T2318-500EA</td><td>Tubos de centrífuga Greiner</td></tr><tr><td>Tubos de filtro</td> Filtros de tubo de centrífuga <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161-100EA</td><td>Corning Costar Spin-X (tamanho do poro 0.22 &mu; m)</td></tr> <tr><td>Frasco de hidrólise do gravador</td><td></td><td></td><td></td>de vidro</tr><tr><td>e Tampa</td><td>Eldex Laboratories/Waters</td><td>WAT007568 & </td><td></td>WAT007569</tr><tr><td>Gelo e recipiente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpeza de papel sem fiapos</td><td>Kimwipes/Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q água</td><td></td><td></td><td>18,2 M&Omega;. cm</td></tr><tr><td>Torneira de nitrogênio com mangueira</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Micropipeta</td><td>MERCK</td><td>EP3123000063</td><td></td></tr><tr><td>P1000 ponteiras de pipeta</td><td>MERCK</td><td>Z740127</td><td></td></tr><tr><td>P200 Micropipeta</td><td>MERCK</td><td>EP3123000055-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta P200</td><td>MERCK</td><td>Z740125</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>MERCK</td><td>P7793</td><td>Filme de vedação</td></tr><tr><td>EPI - fones de ouvido</td><td></td><td></td><td></td>com cancelamento de ruído</tr><tr><td>EPI - luvas</td><td></td><td></td><td></td>de forno</tr><tr><td>Sonda sonicadora</td><td>QSONICA Sonicators</td><td>Q125 Sonicator</td><td>Certifique-se de que todos os EPI apropriados (ou seja, fones de ouvido com cancelamento de ruído)</td></tr><tr><td>Espátula</td><td></td><td></td><td></td>de transferência de amostras</tr><tr><td>Ácido tricloroacético (TCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo com mangueira</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

extração de aminoácidos não proteicos de cianobactérias para cromatografia líquida - análise de espectrometria de massas em tandem

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Os aminoácidos não proteicos (NPAAs) são uma grande classe de aminoácidos (AAs) que não são geneticamente codificados para tradução em proteínas. A análise de NPAAs pode fornecer informações cruciais sobre a captação e/ou função celular, vias metabólicas e toxicidade potencial. β-metilamino-L-alanina (BMAA) é um NPAA neurotóxico produzido por várias espécies de algas e está associado a um risco aumentado de doenças neurodegenerativas, o que levou a um interesse significativo de pesquisa. Existem inúmeras maneiras de extrair AAs para análise, sendo a espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida a mais comum, exigindo precipitação de proteínas seguida de hidrólise ácida do pellet de proteína. Estudos sobre a presença de BMAA em espécies de algas fornecem resultados contraditórios, sendo o uso de preparação/extração e análise de amostras não validadas uma causa primária. Como a maioria dos NPAAs, a precipitação de proteínas em TCA aquoso a 10% e a hidrólise com HCl fumegante são a forma mais apropriada de extração para BMAA e seus isômeros aminoetilglicina (AEG) e ácido 2,4-diaminobutírico (2,4-DAB). O presente protocolo descreve as etapas de um método validado de extração de NPAA comumente utilizado em laboratórios de pesquisa e ensino.

Uma ilustração do protocolo de extração é fornecida na Figura 2 como um guia de referência resumido. Os resultados obtidos por Violi et al.38 foram escolhidos para representar um resultado positivo deste protocolo de extração para a análise de isômeros BMAA de cianobactérias. Dezenove espécies únicas de cianobactérias foram cultivadas em 11 locais de água doce do leste da Austrália. Usando o mesmo protocolo, os isômeros BMAA foram extraídos em frações livres e proteicas, derivatizados com PCF e analisados usando LC-MS/MS. Dezessete dos isolados de cianobactérias foram positivos para BMAA, e todos os 19 continham o isômero 2,4-DAB. Um resultado positivo é confirmado usando um método LC-MS/MS validado e observando pelo menos três transições de monitoramento de reações múltiplas (MRM), uma como íon quantificador e duas como íons qualificadores no tempo de retenção esperado. Um cromatograma MRM representativo de um padrão contendo BMAA e seus isômeros, indicado pelas linhas codificadas por cores, é mostrado na Figura 3. A presença e a concentração de BMAA e isômeros em todas as 19 amostras, seccionadas para mostrar a concentração de BMAA e isômero nas frações livre e ligada, estão resumidas na Tabela 1. Uma detecção positiva para os três isômeros foi observada na fração livre das espécies de Merismopedia coletadas no Lago Liddell (NSW, Austrália), onde a fração livre continha uma concentração de BMAA de 68,38 μg/g de peso seco (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB com concentração de 1.223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW, e AEG com concentração de 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. Os MRMs cromatográficos são mostrados na Figura 4. Para ilustrar um resultado negativo para o BMAA e seus isômeros em uma amostra, a fração ligada das espécies Microcystis flos-aquae coletadas da Walka Water Works (NSW, Austrália) é apresentada cromatograficamente na Figura 5. Enquanto a fração ligada não continha BMAA, 2,4-DAB e/ou AEG, sua fração livre continha os três isômeros, com concentrações de 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1.156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW e 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW, respectivamente.
Assim, por meio do uso desse protocolo, Violi et al.38 confirmaram a presença de isômeros BMAA em cianobactérias de água doce do leste australiano e determinaram quais cianobactérias tinham capacidades produtoras de toxinas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig01.jpg"> Figura 1: A estrutura química do BMAA e seus isômeros 2,4-DAB e AEG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama de referência resumido do protocolo de extração. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig03.jpg"> Figura 3: Cromatograma LC-MS/MS de um padrão de calibração contendo D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA e AEG para identificação de isômeros com base na retenção, indicada pelos picos destacados. Chave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z &gt; 278,10 m/z a 6,4 min (vermelho), 2,4-DAB 333,01 m/z &gt; 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z &gt; 88,00 m/z a 7,4 min (laranja) e BMAA 333,01 m/z &gt; 187,10 m/z a 7,8 min (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig04.jpg"> Figura 4: Cromatograma LC-MS/MS para detecção de D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA e AEG em espécies de Merismopedia coletadas do Lago Liddell (NSW, Austrália), indicadas pelos picos destacados. Chave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z &gt; 278,10 m/z a 6,4 min (vermelho), 2,4-DAB 333,01 m/z &gt; 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z &gt; 88,00 m/z a 7,4 min (laranja) e BMAA 333,01 m/z &gt; 187,10 m/z a 7,8 min (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63779/63779fig05.jpg"> Figura 5: Cromatograma LC-MS/MS de um controle negativo para 2,4-DAB, BMAA e AEG em uma fração ligada de espécies de Microcystis flos-aquae coletadas da Walka Water Works (NSW, Austrália). Chave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z &gt; 278,10 m/z a 6,4 min (vermelho - pico destacado), 2,4-DAB 333,01 m/z &gt; 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z &gt; 88,00 m/z a 7,4 min (laranja) e BMAA 333,01 m/z &gt; 187,10 m/z a 7,8 min (azul). As linhas tracejadas representam os tempos de retenção para 2,4-DAB, AEG e BMAA ausentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Concentrações de BMAA, AEG e 2,4-DAB em isolados de cianobactérias. As concentrações ± erro padrão da média (n = 3). ND denota não detectado. A maior concentração de cada isômero detectado é destacada em verde. A tabela é uma versão modificada de Violi et al.38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63779/63779_Table%201.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

O presente protocolo descreve a extração de aminoácidos não proteicos de matrizes biológicas via precipitação de proteínas de ácido tricloroacético (TCA) e hidrólise ácida antes da análise por cromatografia líquida e espectrometria de massa tandem.

Extração de Aminoácidos Não Proteicos de Cianobactérias para Cromatografia Líquida - Análise de Espectrometria de Massas em Tandem

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Este protocolo ajudará os usuários e ensinará aos alunos as etapas corretas na extração de BMA, AEG e 2, 4-DAB. Minimizando assim as chances de erro e produzindo resultados consistentes. Este método é um método comumente utilizado e validado para a extração de BMA e seus isômeros, AEG e 2, 4-DAB em uma matriz bacteriana de sauna.Este método pode ser utilizado para aprofundar a pesquisa sobre a toxicidade dos BMAs e fornecer uma maior compreensão sobre o BMA e seus efeitos associados à saúde. Comece por centrifusão a amostra de cianobactérias a 3.500 G por 10 minutos a 25 graus Celsius. E descartar o sobrenadante em resíduos biológicos.Cubra o tubo de centrífuga que contém o pellet com uma película de vedação e perfure alguns orifícios no filme usando um pinçador de nariz longo afiado. Em seguida, armazene o tubo ereto a menos 80 graus Celsius. Após 30 minutos, coloque o tubo na posição vertical em um recipiente de vidro liofilizador e coloque o recipiente dentro do congelador de menos 80 graus Celsius por cinco minutos para resfriamento.Retire o recipiente de vidro do congelador e prenda a tampa de borracha. Certifique-se de que a alça na saída da válvula de borracha do liofilizador está apontando para cima e ventilada para a atmosfera. Prenda o recipiente de vidro com firmeza.Gire lentamente a alça da saída da válvula de borracha para apontá-la em uma posição para baixo para expor o frasco ao vácuo. E aguarde até 24 horas de liofilização para sublimar todo o líquido. Quando terminar, pese de 15 a 50 miligramas de pellets de amostra congelados em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Usando uma balança analítica. À amostra, adicionar 300 a 600 microlitros de ácido tricloroacético aquoso a 10% ou TCA. Coloque os tubos de amostra em um recipiente cheio de gelo triturado.Limpe a sonda do sonicator com um lenço de papel sem fiapos pulverizado com etanol a 70% antes de imergir totalmente a extremidade da sonda na amostra e pressionar o início. Uma vez feito, coloque a amostra contendo o tubo de centrífuga no gelo por um minuto. E repita o processo de sonicação para garantir a lise celular.Após arrefecimento da amostra a quatro graus Celsius durante 24 horas. Centrífuga a 3.500 G por 15 minutos a oito graus Celsius. Em seguida, usando uma micropipeta, transfira o sobrenadante para um tubo de dois mililitros rotulado como fração livre.Adicione 400 microlitros de TCA 10% aquoso ao pellet da amostra e quebre o pellet por agitação de vórtice ou com a ponta da micropipeta. Centrifugar e transferir o sobrenadante para o mesmo tubo de fração livre de dois mililitros. Repita este passo uma terceira vez usando acetona 10%TCA.Coloque o tubo de fração livre com a tampa aberta em um evaporador centrífugo até que todo o líquido volátil seja removido. Uma vez que a amostra esteja livre de líquidos voláteis, cubra o tubo com segurança com o filme do teto e perfure o filme com alguns orifícios usando um pinçador de nariz longo afiado. Após liofilização demonstrada anteriormente, reconstituir a amostra com 200 microlitros de ácido clorídrico 20 milimolares e colocá-la num congelador de menos 80 graus Celsius.Adicione 400 microlitros de acetona a 100% no pellet da amostra usando uma micropipeta e quebre o pellet usando a agitação do vórtice ou a ponta da micropipeta. Transfira quantitativamente o pellet lavado e ressuspenso para o frasco para injetáveis de casca de vidro correspondente. Usando uma micropipeta de um mililitro.Adicione mais 400 microlitros de acetona ao tubo de amostra para ajudar a transferir o pellet restante. Centrifugar e decantar o líquido sobrenadante em resíduos biológicos antes de secar o pellet em um evaporador centrífugo até que o líquido seja removido e o pellet esteja seco. Para preparar o arquivo de hidrólise a vácuo, adicione um mililitro de ácido clorídrico de seis molares ao fundo do arquivo de hidrólise.Insira cuidadosamente os frascos para injetáveis com casca rotulados com amostras secas no ficheiro de hidrólise utilizando uma pinça que assegure uma posição estável na posição vertical. Fixe a tampa ao arquivo de hidrólise e empurre o botão vermelho na tampa para fechar a válvula. Depois de ligar a bomba de vácuo, prenda o tubo de vácuo à cabeça da tampa do arquivo de hidrólise e pressione o botão verde na tampa para abrir a válvula.Em seguida, deixe a bomba de vácuo remover o ar do frasco para injetáveis durante um minuto. Em seguida, feche o frasco para injetáveis pressionando o botão vermelho na tampa do frasco para injetáveis de hidrólise. Desligue a bomba de vácuo e remova o tubo de vácuo.Fixe um tubo de borracha à torneira de gás nitrogênio na bancada do laboratório. E abra a torneira ligeiramente. Coloque o polegar no final do tubo, sele-o e conte até que o gás comece a escapar à medida que a pressão se acumula.Em seguida, prenda a outra extremidade do tubo de borracha à cabeça da tampa do frasco para injetáveis de hidrólise. E empurre imediatamente o botão verde da tampa. Conte o tempo necessário para o gás escapar.Empurre rapidamente o botão vermelho na tampa e remova o tubo de borracha. Repita todo o processo de tratamento a vácuo duas vezes. Garantir que o frasco para injetáveis de hidrólise de vidro está livre de ar e cheio de gás azoto.Coloque o frasco para injetáveis de hidrólise num forno pré-aquecido regulado a 110 graus Celsius durante 16 a 18 horas. Usando luvas de forno, remova o frasco de hidrólise de vidro do forno. Deixe o frasco para injetáveis arrefecer no interior do exaustor durante 10 minutos antes de empurrar o botão verde enquanto o afasta para libertar a pressão e o gás.Reconstituir os pellets de amostra hidrolisados com 200 microlitros de ácido clorídrico de 20 molares no frasco para injetáveis com casca e ressuspender o pellet. Centrifugar os frascos para injetáveis contendo os pellets de amostra reconstituídos durante dois minutos a 5, 300 G e 25 graus Celsius. Transfira as amostras de fração livre reconstituída e a fração proteica para os tubos filtrantes de dois mililitros contendo filtros de membrana de poros de 0,2 mícron e rotulados como fração livre e fração proteica.Coloque os tubos para centrifugação por 30 minutos a 5.000 G e 25 graus Celsius. O cromatograma de monitoramento de reações múltiplas de um padrão contendo beta-metilamino-L-alanina ou BMAA e seus isômeros indicados pelas linhas codificadas por cores é mostrado aqui. Uma detecção positiva para os três isômeros, BMAA, DAB e AEG foi observada na fração livre das espécies de Merismopedia coletadas do Lago Liddel.Considerando que a fração ligada das espécies Microcystis flos-aquae coletadas da Waka Waterworks ilustrou um resultado negativo para o BMAA e seus isômeros. O pellet ressuspenso deve ser quantitativamente transferido para o frasco para injetáveis de concha correspondente para permitir um ponto preciso de normalização com base na massa de cianobactérias. Os pacientes e a devida diligência são aconselhados durante a execução desta etapa.Seguindo este procedimento. As frações extraídas terão que passar por uma etapa de desvitalização para permitir a fase reversa. Cromatografia líquida, análise por espectrometria de massas em tandem.A aplicação desta técnica expande vários campos científicos. Incluindo as ciências ambientais através da análise de cinotoxinas em amostras ambientais. E campos como toxicologia e bioquímica através da investigação da teoria da Misincorporação do BMA.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

13 C-isótopo rotulagem é uma técnica útil para determinar o metabolismo da célula central para vários tipos de microorganismos. Depois que as células foram cultivadas com um substrato específico rotulados, GC-MS medição pode revelar vias metabólicas funcionais com base em padrões de rotulagem única no proteinogénicos aminoácidos.

Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

Nível de espécies reativas de oxigênio é elevado quando as células encontrar condições de estresse. Aqui mostramos o exemplo de 3'-3 'diaminobenzidina coloração, bem como cysTMT rotulagem e espectrometria de massa para traçar o perfil do proteoma redox...

Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

Fonte: Samuels, D. J., et al. Uma abordagem baseada em cromatografia líquida tandem – espectrometria de massas para análise de metabólitos de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o uso da cromatografia líquida–espectrometria de massa para identificar e quantificar metabólitos intracelulares de S. aureus. Ele descreve as etapas envolvidas na extração de metabólitos, normalização de peptídeos, cromatografia líquida e análise espectrométrica de massas.

Uma abordagem baseada em Cromatografia Líquida e Espectrometria de Massas para Análise de Metabólitos de S. aureus

Este protocolo é para a extração e concentração de proteína e DNA de biomassa microbiana coletada da água do mar, seguida pela geração de peptídeos trípticos adequados para análise proteômica baseada em espectrometria de massa em tandem.

Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Aqui, apresentamos a quantificação imparcial de ocupação acetilação e/ou succinylation proteína site-specific (estequiometria) de um proteome inteira através de uma análise ratiometric de modificações endógenas às modificações introduzidas após quantitativa química acilação usando anidridos rotulado de isótopo estáveis. Em combinação com a espectrometria de massa sensível aquisição de dados independente, obtêm-se medições de ocupação do local exato.

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

A análise em todo o sistema de múltiplas biomoléculas é crucial para obter insights funcionais e mecanísticos em processos biológicos. Por este meio, um extenso protocolo é descrito para extração de alto débito de lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra colhida da cultura de Chlamydomonas sincronizada.

Um método de extração multi-Omics para a análise aprofundada de culturas sincronizadas da alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Uma estratégia rápida-multidisciplinar para detecção precoce de flores cianobacterianas e cianotoxinas associadas é descrita aqui. Permite a detecção de cianobactérias e cianotoxinas relacionadas em amostras de água e em matrizes orgânicas, como amostras de bivalve, em 24 h.

Detecção precoce de Flores Cianobacterianas e Cianotoxinas Associadas usando estratégia de detecção rápida

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Aprenda a extrair aminoácidos não proteicos de cianobactérias usando precipitação com TCA e cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem. Este método validado permite detectar BMA e seus isômeros com resultados consistentes.

Extração de Aminoácidos Não Proteicos de Cianobactérias para Cromatografia Líquida - Análise de Espectrometria de Massas em Tandem (Vídeo) | JoVE Journal

Extração de Aminoácidos Não Proteicos de Cianobactérias para Cromatografia Líquida - Análise de Espectrometria de Massas em Tandem

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