Uma triagem multiplexada de alto rendimento para diabetes tipo 1, doenças celíacas e COVID-19
5 de julho de 2022
Em linha com a necessidade urgente de triagem para diabetes tipo 1, doença celíaca e doença por coronavírus 2019, desenvolvemos um ensaio de eletroquimioluminescência 6-Plex de alto rendimento para detectar simultaneamente todos os quatro autoanticorpos de ilhotas, autoanticorpos de transglutaminase tecidual e anticorpos para o domínio de ligação ao receptor do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave.
O novo ensaio ECL 6-Plex é o primeiro ensaio multiplex validado e agora aplicado em ensaios clínicos para triagem da população em geral. Ele combina simultaneamente seis ensaios de autoanticorpos adequados para a triagem de diabetes tipo 1, doença celíaca e COVID-19 em uma grande população. Em comparação com o atual ensaio padrão de autoanticorpos, essa técnica pode rastrear de forma mais eficiente vários autoanticorpos para múltiplas doenças autoimunes simultaneamente.
A implicação dessa técnica tornará o rastreamento em larga escala mais viável e específico da doença, levando à predição precoce da doença para prevenção e diagnóstico mais preciso para a terapia. Para começar, adicione quatro microlitros de proteína de antígeno biotinilado GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e proinsulina em um tubo contendo 156 microlitros de 1% de BSA e misture com 240 microlitros de ligantes conjugados com treptavidina correspondentes, 1, 2, 3, 8, 9 e 10. Em seguida, incubar a mistura por 30 minutos à temperatura ambiente.
Aliquot 160 microlitros de solução de parada em cada tubo e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos. Agora, pegue 400 microlitros da solução de mistura de cada tubo e combine-os. Adicione quatro microlitros de GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e antígeno proinsulina marcados com rutênio à mistura.
Em seguida, adicione 1,6 mililitros de solução de parada e 3,2 mililitros de PBS. Misture bem todos os componentes. E agora, a solução de antígeno está pronta para uso no ensaio.
Para uma placa de PCR de 96 poços, alíquota de sete microlitros de soro por poço e cubra a placa com um filme de vedação. Em seguida, pré-aqueça os soros a 56 graus Celsius por 30 minutos em uma máquina de PCR e centrifugar brevemente a placa a 100 vezes G por um minuto. Adicione 63 microlitros de solução de antígeno preparada por poço, misture com os soros e cubra a placa de PCR com folha de vedação para evitar a luz.
Agite a placa num agitador a uma velocidade de 450 rpm durante duas horas à temperatura ambiente. E então, incube a placa a quatro graus Celsius por 18 a 24 horas. Pegue uma placa de 6 Plex da geladeira de quatro graus Celsius, permitindo que a placa atinja a temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 150 microlitros de 3%Blocker A a cada poço da placa 6-Plex. Cubra a placa com papel alumínio para evitar a luz. Coloque a placa de volta em uma geladeira de quatro graus Celsius e incube durante a noite.
No final da incubação, uma vez que a placa é removida da geladeira, remova todo o tampão da placa. Coloque o prato nas toalhas de papel para secar e lave-o três vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem por poço de cada vez. Seque a placa na toalha de papel e alíquota 30 microlitros de antígeno sérico incubar de cada poço da placa de PCR de incubação durante a noite em dois poços da placa de 6-Plex.
Cubra a placa com papel alumínio, depois coloque a placa num agitador de placas e agite com uma velocidade de 450 rpm à temperatura ambiente durante uma hora. Despeje a solução presente na placa 6-Plex e lave a placa três vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem de cloreto de sódio 0,4 M por poço. Após a conclusão da terceira lavagem, seque o prato contra o papel toalha e adicione 150 microlitros de tampão de leitura em cada poço.
Os níveis de seis autoanticorpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA e COVID-19A do ensaio de ECL 6-Plex foram bem correlacionados com seus seis ensaios de ECL únicos correspondentes e o ensaio padrão de ligação por rádio atual. Os valores do índice para cada amostra para todos os seis anticorpos foram calculados em relação aos controles positivos e negativos correspondentes. Observou-se um valor de índice maior que o valor de corte, o que indicou um resultado positivo.
Os autoanticorpos no soro romperam o antígeno marcado com rutênio para o antígeno biotinilado, formando um complexo com um ligador específico para construir uma plataforma de multiplexação. Essa tática torna o rastreamento em larga escala mais viável e mais eficiente na população em geral para diabetes tipo um e doenças concomitantes, levando à previsão precoce e prevenção das doenças.
Visão Geral
Este estudo apresenta um novo ensaio eletroquimioluminescente 6-Plex projetado para a detecção simultânea de autoanticorpos relacionados ao diabetes tipo 1, doença celíaca e COVID-19. O ensaio tem como objetivo aumentar a eficiência do rastreamento em larga escala para essas doenças autoimunes.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Autoimunidade
- Diagnóstico clínico
- Ensaios de eletroquimioluminescência
Antecedentes
- A diabetes tipo 1 e a doença celíaca são distúrbios autoimunes que exigem detecção precoce.
- A COVID-19 introduziu novos desafios no rastreamento de doenças autoimunes.
- Os métodos atuais de rastreamento são frequentemente ineficientes e demorados.
- Ensaios multiplexos podem melhorar as capacidades de rastreamento ao testar múltiplos anticorpos simultaneamente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio de alto rendimento para detecção simultânea de múltiplos autoanticorpos.
- Validar o ensaio para uso em ensaios clínicos.
- Facilitar a predição e prevenção precoces da doença.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções de antígeno utilizando proteínas biotiniladas e marcadas com rutênio.
- Incubação de amostras de soro com as soluções de antígeno preparadas.
- Uso de uma placa de PCR de 96 poços para o processamento das amostras.
- Correlação dos resultados com ensaios padrão para validar a abordagem multiplex.
Resultados Principais
- O ensaio ECL 6-Plex demonstrou forte correlação com os ensaios tradicionais individuais.
- Os valores de índice indicaram resultados positivos para autoanticorpos em amostras de soro.
- O ensaio permite o rastreamento eficiente de múltiplas doenças autoimunes.
- Os resultados apoiam a viabilidade do rastreamento populacional em larga escala.
Conclusões
- O ensaio ECL 6-Plex é uma ferramenta promissora para a detecção precoce de doenças autoimunes.
- Este método aumenta a eficiência dos processos de triagem.
- Ele possui potencial para melhorar os resultados em pacientes por meio de intervenção precoce.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio ECL validado com painel de 6 analitos permite a detecção multiplex em alto rendimento de autoanticorpos para diabetes tipo 1, doença celíaca e COVID-19, atendendo à necessidade de triagem populacional eficiente e específica para cada doença. Esta plataforma aumenta a confiança preditiva no ponto de inflexão mais precoce do continuum entre descoberta e diagnóstico, apoiando decisões de portfólio ajustadas ao risco em pesquisas sobre doenças autoimunes e infecciosas. Sua adoção como ferramenta primária de triagem demonstra um impacto em nível corporativo sobre fluxos de trabalho translacionais e pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a análise simultânea de múltiplos alvos autoimunes e virais em um único formato de ensaio.
- Aprimora a desmistificação biológica ao distinguir perfis de autoanticorpos específicos da doença.
- Oferece suporte à confiança preditiva em estratégias de previsão e prevenção precoces da doença.
- Facilita a triagem de portfólios ao fornecer leituras multiplexadas e quantitativas para validação de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas multiplexados validados para triagens e fluxos de trabalho de biomarcadores posteriores.
- Padroniza as condições do ensaio para garantir reprodutibilidade e comparabilidade quantitativa entre amostras.
- Permite triagem escalonável e de alto rendimento com requisitos mínimos de volume de soro.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos ou intervenções sobre múltiplos biomarcadores relevantes para doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a estratégias de biomarcadores relevantes para doenças, garantindo continuidade translacional desde a descoberta até a validação clínica.
- Fornece resultados quantitativos que orientam decisões de avanço ajustadas ao risco em pipelines pré-clínicos.
- Aprimora a desvinculação preditiva ao correlacionar perfis multiplexados de autoanticorpos com o início e a progressão da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio ECL 6-Plex integra-se na interface entre descoberta inicial, identificação de compostos promissores e pesquisa translacional, permitindo uma progressão contínua desde a verificação de hipóteses até a validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses robustos e a clarificação de vias por meio da detecção multiplexada de autoanticorpos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis, adequados para ambientes de triagem de alto rendimento.
- Análises: Oferece valores de índice e pontos de decisão baseados em limiares para comparação entre condições e análise estatística.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à validação clínica ao alinhar a detecção de biomarcadores com desfechos relevantes para a doença.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável e escalável para futuras iniciativas de triagem multiplexada.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de doenças autoimunes e infecciosas em estágios iniciais.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho por meio de padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital, fornecendo dados multiplexados e acionáveis.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos com base em evidências robustas e multiplexadas de biomarcadores.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no desenvolvimento de ensaios imunológicos multiplexados e na detecção por eletroquimioluminescência.
- Exige acesso a instrumentação especializada para leituras de ECL e manipulação de placas de alto rendimento.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de ensaio e dos fluxos de análise de dados.
- Pode exigir adaptação para uso com diferentes tipos de amostras ou modelos de doenças conforme as necessidades da carteira evoluem.
- As limitações práticas incluem a necessidade de validação rigorosa frente a ensaios consagrados de radioimunoensaio e ensaios monoanalíticos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
