Análise por Citometria de Fluxo de Biomarcadores para Detecção de Defeitos Funcionais do Espermatozoide Humano

Esta técnica apresenta uma abordagem prática para estimar múltiplos biomarcadores funcionais de espermatozoides humanos por citometria de fluxo sem comprometer substancialmente a qualidade do experimento induzida por tempos de espera prolongados. Essa técnica pode ser uma ferramenta prática e confiável para o diagnóstico de infertilidade e avaliação da função espermática tanto na bancada quanto na cama, além de complementar o exame de rotina dos espermatozoides. Este procedimento é realizado com a plataforma Accuri C6 e pode ser aplicado a outras plataformas comerciais com pequenas modificações.

Para começar, incube a amostra de sêmen a 37 graus Celsius e liquefaça completamente a amostra por uma hora. Para contar os espermatozoides, misture a amostra de sêmen liquefeito completamente, adicione 10 microlitros de sêmen em uma câmara de contagem de espermatozoides e digitalize a lâmina em um analisador de classe de espermatozoides. Conte pelo menos seis áreas e 400 espermatozoides para estimar a concentração espermática.

Para detecção de apoptose espermática, usando a coloração FITC PI de anexina-5, adicione 10 ao sexto espermatozoides a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Lave as células com 500 microlitros de PBS frio. Em seguida, centrifugar a suspensão de espermatozoides e descartar o sobrenadante antes de ressuspender as células em 200 microlitros de tampão de ligação.

Em seguida, adicione dois microlitros de FITC anexina-5 e dois microlitros de PI. Vórtice suavemente as células e incube por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro antes de colocá-las no citômetro de fluxo para análise. Para análise do potencial de membrana mitocondrial, ou MMP, usando a sonda JC-1, adicione duas vezes 10 ao sexto espermatozoide a um tubo de 1,5 mililitro e centrífuga. Após a centrifugação, ressuspenda a suspensão de espermatozoides em uma solução de trabalho JC-1 de um mililitro.

Vórtice suavemente as células e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Novamente, centrifugar a suspensão, descartar o sobrenadante e lavar o pellet duas vezes com um mililitro de PBS. Em seguida, ressuspenda os espermatozoides tingidos em um mililitro de PBS em um tubo de citômetro de fluxo e coloque imediatamente o tubo no citômetro de fluxo para análise.

Em seguida, use cianeto de carbonila m-clorofenilhidrazona, ou CCCP como um controle positivo. Ressuspenda os espermatozoides em um mililitro de solução de trabalho CCCP e vomite suavemente antes de incubar à temperatura ambiente por 20 minutos. Após a incubação, centrifugar a suspensão, descartar o sobrenadante e executar as etapas de análise da MMP usando a sonda JC-1, conforme demonstrado.

Para o ensaio de estrutura da cromatina espermática, ou SCSA, descongelar a amostra de sêmen em banho-maria de 37 graus Celsius e diluir com tampão TNE para uma concentração de uma a duas vezes 10 para a sexta célula por mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros da amostra diluída a um tubo de ensaio de citômetro de fluxo e misture com 400 microlitros de solução ácida. Manchar a amostra com 1,2 mililitros de solução de laranja de acridina.

Use uma amostra de referência como padrão interno para a configuração e calibragem do citômetro de fluxo. Diluir a amostra com quatro graus Celsius TNE Buffer para uma concentração de uma a duas vezes 10 a sexta células por mililitro, e executar os passos para SCSA, conforme demonstrado. Abra o software do citômetro de fluxo e inicie o citômetro.

Para coletar dados de amostra, carregue uma amostra de controle no citômetro de fluxo e clique em Executar para iniciar a coleta de dados. Crie gráficos de pontos para exibir dados. Selecione os parâmetros do eixo XY e exiba linear para especificar dados.

Em seguida, selecione e aplique uma porta poligonal para delinear a população de espermatozoides para análise. Para apoptose espermática, defina FL1 como eixo X e FL2 como eixo Y. Em seguida, para isolar as células apoptóticas ou necróticas vivas, toque e arraste a porta do quadrante para subdefinir as populações de espermatozoides para quatro populações específicas.

Para MMP, defina FL1 como o eixo X e FL2 como o eixo Y. Em seguida, crie uma porta poligonal para subdefinir as populações de espermatozoides em duas populações específicas. Para SCSA, defina o FL4 como o eixo X e FL1 como o eixo Y.

Desenhe o portão, defina um ângulo de 45 graus para excluir sinais de detritos celulares. Calcular 10.000 espermatozoides para cada amostra para apoptose espermática, análises de MMP e SCSA, definir um limite de execução para indicar quando parar de coletar dados, taxa fluídica, dependendo do número de células e limiar para eliminar detritos e ruído. Aplique essas configurações a todos os exemplos.

Se necessário, defina a compensação de cor para corrigir o transbordamento fluorescente. Volte suavemente a pipetar a amostra antes de carregá-la no citômetro de fluxo. Em seguida, digite o nome do exemplo e clique em Executar.

Quando a execução estiver concluída, salve os dados de exemplo como arquivo FCS fornecendo um nome de arquivo para análise adicional. A medida da apoptose espermática usando a coloração FITC PI de anexina-cinco é mostrada aqui. Esta análise incluiu controle negativo de espermatozoides não corados para definir compensação e quadrantes.

Em uma amostra com apoptose espermática, os resultados foram expressos como as porcentagens de células apoptóticas ou apoptóticas precoces viáveis ou vivas, apoptóticas tardias e necróticas. A subpopulação espermática com alta e baixa MMP é mostrada aqui. Uma amostra de sêmen de boa qualidade apresentou alta fluorescência laranja e baixa fluorescência verde.

Por outro lado, uma amostra de sêmen de baixa qualidade demonstrou baixa fluorescência laranja e alta fluorescência verde. Os citogramas SCSA de um homem fértil e infértil são mostrados aqui. A população de espermatozoides foi identificada como normal, com alta estabilidade do DNA, índice de fragmentação do DNA e debris celulares.

A amostra de sémen deve ser incubada a 37 graus Celsius e completamente liquefeita até uma hora.