Name: Provocando a interação entre células assassinas naturais e neurônios nociceptores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a estudar a interação entre células NK e neurônios nociceptores usando co-cultura de células de baço e gânglios da raiz dorsal de camundongo. Este método revela como neurônios modulam funções imunes anti-tumor.

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Este trabalho foi apoiado pelo The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (162211, 461274, 461275), pela Fundação Canadense para a Inovação (37439), pelo programa Canada Research Chair (950-231859), pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (RGPIN-2019-06824) e pelo Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Université de Montréal (#22053, #22054) aprovaram todos os procedimentos para animais. Consulte a Tabela 1 para uma lista de soluções e sua composição e a Tabela de Materiais para uma lista de materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo.
1. Isolamento, cultura e estimulação de células NK
<ol><li>Gerar neurônio nociceptor intacto (controle de companheiro de ninhada; TRPV1wt::D TA fl/wt) e camundongos ablados (TRPV1 cre::D TA fl/wt) cruzando camundongos com toxina lox-stop-lox-diphtheria (DTA fl/fl) com camundongos TRPV1cre/wt.</li>
	<li>Usando a inalação de CO2, eutanasie um rato ingênuo de controle de companheiro de ninhada (TRPV1 wt::D TAfl/wt).</li>
	<li>Recolher o baço num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).</li>
	<li>Homogeneize o baço usando um pilão.</li>
	<li>Diluir as células com 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Filtrar a mistura através de um filtro de células de 50 μm para um tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Aumente o volume (10 mL) com PBS estéril.</li>
	<li>Colete 10 μL e conte as células usando um hemocitômetro.</li>
	<li>Centrifugar as células (500 × g, 5 min) e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células a uma concentração de 108 células/ml em meio RPMI 1640 suplementado.</li>
	<li>Siga as instruções do fabricante para purificar magneticamente as células NK do baço usando um kit de isolamento de células NK de camundongo. Confirmar a pureza das células NK usando citometria de fluxo11.</li>
	<li>Colete 10 μL e conte as células usando um hemocitômetro.</li>
	<li>Centrifugar as células (500 × g, 5 min) e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células NK em meio de cultura RPMI 1640 suplementado (contendo IL-2 e IL-15).</li>
	<li>Cultura 2 × 106 células NK/mL em uma placa de fundo U de 96 poços por 48 h.</li>
</ol>2. Isolamento e cultura de neurônios DRG
<ol><li>Às 24 h antes do final da estimulação com células NK (etapa 1.15), revestir uma placa de 96 poços com 100 μL/poço de laminina (1 ng/mL) e incubar por 45 min (37 °C).</li>
	<li>Após a incubação, remova a solução e deixe os poços secarem ao ar em um armário de biossegurança.</li>
	<li>Usando a inalação de CO2, eutanasiar o neurônio nociceptor intacto (controle do companheiro de ninhada; TRPV1wt: :D TA fl/wt) ou ratos ablados (TRPV1cre::D TAfl/wt). NOTA: A inalação de CO2 é preferível à luxação cervical, pois evita interromper os nervos espinhais conectados ao DRG.</li>
	<li>Prenda o rato na prancha em posição prona, levante a pele e incite a pele ao longo da coluna dorsal. Consulte Perner et al. para um vídeo detalhado12.</li>
	<li>Corte a articulação lombossacra e separe o sacro da coluna lombar com uma tesoura.</li>
	<li>Separe a coluna cortando os músculos e costelas em ambos os lados da coluna vertebral na direção craniana até que a base do crânio seja atingida.</li>
	<li>Usando uma tesoura, corte a coluna vertebral na articulação atlanto-occipital.</li>
	<li>Remova o músculo e o tecido adiposo da coluna vertebral.</li>
	<li>Prenda e abra a coluna vertebral para remover a medula espinhal e obter acesso ao DRG. Procure o DRG nos forames intervertebrais conectados à medula espinhal através da raiz dorsal, mas separados das meninges.</li>
	<li>Colha os DRGs em um tubo cônico de 15 mL preenchido com 10 mL de DMEM suplementado gelado.</li>
	<li>Centrifugar a preparação (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 250 μL de PBS contendo colagenase IV (1 mg/mL) e Dispase II (2,4 U/mL).</li>
	<li>Incubar o DRG com solução de colagenase IV/Dispase II (C/D) (80 min, 37 °C, agitação ligeira). Ao agrupar gânglios de vários camundongos, mantenha uma proporção de 125 μL de solução C/D por gânglio.</li>
	<li>Para inativar as enzimas, adicione 5 mL de meio DMEM suplementado.</li>
	<li>Centrifugar a solução (200 × g, 5 min) e remover suavemente o sobrenadante utilizando uma pipeta.</li>
	<li>Para evitar a perda de células indesejadas, deixe ~ 100 μL do sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio DMEM suplementado.</li>
	<li>Usando uma pistola de pipeta e três pipetas Pasteur de vidro de tamanhos decrescentes, triturate suavemente (~ 10 para cima / para baixo por tamanho de pipeta Pasteur) o DRG em uma preparação de célula única.</li>
	<li>Em um gabinete de biossegurança, diluir a albumina sérica bovina (BSA) em PBS estéril até uma concentração final de 15%. Armazenar alíquotas de 1 ml a -20 °C.</li>
	<li>Crie um gradiente de BSA em um tubo cônico de 15 mL adicionando 2 mL de PBS estéril e dispensando lentamente 1 mL de solução de BSA a 15% na parte inferior do tubo. Evite interromper o gradiente removendo suavemente a pipeta.</li>
	<li>Usando uma pipeta P200, pipete lentamente a suspensão triturada dos gânglios (que contém os neurônios) para o lado do tubo no gradiente.</li>
	<li>Centrifugar o gradiente de BSA contendo neurônios (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Ajuste a aceleração e a desaceleração da centrífuga para a velocidade mínima. NOTA: Após a centrifugação, os neurônios estarão na parte inferior do tubo, enquanto os detritos celulares ficarão presos no gradiente BSA.</li>
	<li>Remova suavemente todo o sobrenadante usando uma pipeta.</li>
	<li>Ressuspender as células em 500 μL de Neurobasal.</li>
	<li>Placa 104 neurônios por poço (200 μL de neurobasal/poço) em uma placa de 96 poços revestida de laminina e fundo plano. NOTA: Em média, um investigador será capaz de preencher ~ 8 poços por mouse.</li>
	<li>Cultura dos neurônios (37 °C, durante a noite) para permitir a fixação.</li>
</ol>3. Co-cultura e citometria de fluxo
<ol><li>Remova lentamente o neurobasal da cultura de neurônios.</li>
	<li>Após 48 h de estimulação com IL-2 e IL-15 (ver passos 1.14-1.15), ressussuscite as células NK e adicione 105 células NK/poço à cultura de neurónios (placa inferior plana de 96 poços). NOTA: Em média, o investigador será capaz de preencher ~ 6 poços por mouse.</li>
	<li>Co-cultura das células em MX neurobasal suplementado (37 °C, 48 h).</li>
	<li>Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e manche as células com o Corante de Viabilidade eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Bloquear locais inespecíficos nas células com CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Coloração (15 min, 4 °C) das células com BV421 anti-NK-1.1 (1:100), isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-NKp46 (1:100) e ficoeritrina (PE) anti-GM-CSF (1:100).</li>
	<li>Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em tampão FACS (500 μL) e imunofenótipo as células NK por citometria de fluxo11. Consulte a Figura 1A para ver a estratégia de bloqueio.</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Davies et al.11 encontraram que os neurônios lesados regulam positivamente a RAE1. Através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram então capazes de identificar e eliminar neurônios RAE1+ , que por sua vez limitam a dor crônica11. Dado que as células NK também expressam vários receptores neuropeptídicos, e que esses neuropeptídeos são conhecidos por suas capacidades imunomoduladoras, parece cada vez mais importante estudar a inte...

Os corpos celulares dos neurônios sensoriais se originam nos gânglios da raiz dorsal (DRG). Os DRG estão localizados no sistema nervoso periférico (SNP), entre o corno dorsal da medula espinhal e os terminais nervosos periféricos. A natureza pseudo-unipolar dos neurônios DRG permite a transferência de informações do ramo periférico, que inerva o tecido alvo, para o ramo central, que transporta a informação somatossensorial para a medula espinhal1. Usando receptores de canais iônicos especializados, os neurônios de primeira ordem detectam ameaças representadas por patógenos, alérgenos e poluentes2, levando ao influxo de cátions (Na+, Ca2+) e à geração de um potencial de ação 3,4,5.
Esses neurônios também enviam potencial de ação antidrômica para a periferia, onde ocorreu a detecção inicial de perigo, o que leva à liberação local de neuropeptídeos 1,4. Portanto, os neurônios nociceptores servem como mecanismo de proteção, alertando o hospedeiro para o perigo ambiental 4,5,6,7.
Para se comunicar com neurônios de segunda ordem, os nociceptores liberam vários neurotransmissores (por exemplo, glutamato) e neuropeptídeos (por exemplo, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), substância P (SP) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP)))6,7. Esses peptídeos atuam sobre os capilares e promovem extravasamento plasmático, edema e influxo e modulação locais de células imunes 2,4,7.
Os sistemas somatossensorial e imunológico utilizam um sistema de comunicação compartilhado composto por citocinas e neuropeptídeos, e seus respectivos receptores cognatos4. Embora essa comunicação bidirecional ajude a proteger do perigo e preservar a homeostase, também pode contribuir para a fisiopatologia da doença4.
As células NK são classificadas como células linfoides inatas e são especializadas para eliminar células infectadas por vírus. A função das células NK é governada por um equilíbrio de receptores estimulatórios e inibitórios, incluindo o receptor ativador NKG2D8. O ligante endógeno do NKG2D, ácido retinóico induzível precoce1 (RAE1), é expresso por células submetidas a estresse, como tumorigênese e infecção 8,9.
Investigações recentes mostraram que a lesão do nervo periférico leva os neurônios sensoriais a expressar moléculas desadaptativas, como a estatina 2 (STMN2) e a RAE1. Assim, através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram ativadas pela interação com neurônios que expressam RAE1. Por sua vez, as células NK foram capazes de eliminar neurônios nociceptores lesados e hipersensibilidade à dor contusa normalmente associada à lesão nervosa10. Além do eixo NKG2D-RAE1, as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores. Portanto, é possível que esses mediadores modulem a atividade das células NK. Este trabalho apresenta um método de co-cultura para investigar a biologia da interação nociceptor neurônio-célula NK. Essa abordagem ajudará a avançar a compreensão de como os neurônios nociceptores modulam as respostas inatas das células imunes a lesões, infecções ou malignidades.

<table><tbody><tr><td>Anti-rato CD16/32</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Cat nº: 017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Cat nº: 009669</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) grau de cultura</td><td>World Precision Instruments</td><td>Cat nº: 504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-rato NK-1.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat nº: 12430112</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (50 &mu; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat nº: A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat nº: 15140148</td><td></td></tr><tr><td>Toxina difteriafl/fl</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat nº: SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat nº: 13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat nº: 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de células NK de camundongo EasySep</td><td>Sigma</td><td>Cat nº: CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>Cat nº: C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Sigma</td><td>Cat nº: 04942078001</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>Cat nº: 806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-camundongo NKp46</td><td>Sigma</td><td>Cat nº: L2020</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo plano de 96 poços</td><td>Sigma</td><td>Cat nº: 03690</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidro</td><td>Sigma</td><td>Cat nº: 470236-274</td><td></td></tr><tr><td>Fator neurotrófico derivado da linha de células gliais (GDNF)</td><td>VWR</td><td>Cat nº: 02-0131</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Cedarlane</td><td>Nº de gato: 03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>Nº de gato: A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>Rato IL-15 recombinante</td><td>Gibco</td><td>Cat no: 22400-089</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante de camundongo</td><td>Gibco</td><td>Cat no: 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento nervoso (NGF)</td><td>Life Technologies</td><td>Cat no: 13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Mídia neurobasal</td><td>PeproTech</td><td>Cat no: 450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat no: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e Estreptomicina</td><td>PeproTech</td><td>Cat nº: 210-15</td><td></td></tr><tr><td>Pilões</td> Tecnologia de <td>células-tronco</td><td>Nº do gato: 19855</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Biolegend</td><td>Cat nº: 108732</td><td>Clone PK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 mídia</td><td>Biolegend</td><td>Cat nº: 137606</td><td>Clone 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>Cat nº: 505406</td><td>Clone MP1-22E9</td></tr><tr><td>Pinças e ferramentas de dissecação.</td><td>Biolegend</td><td>Cat nº: 65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços com fundo em forma de U</td><td>Biolegend</td><td>Cat nº: 101319</td><td></td></tr><tr><td>Corante de Viabilidade eFlour-780</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

provocando a interação entre células assassinas naturais e neurônios nociceptores

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Os neurônios somatossensoriais evoluíram para detectar estímulos nocivos e ativar reflexos defensivos. Ao compartilhar meios de comunicação, os neurônios nociceptores também ajustam as defesas do hospedeiro, controlando a atividade do sistema imunológico. A comunicação entre esses sistemas é principalmente adaptativa, ajudando a proteger a homeostase, também pode levar a, ou promover, o aparecimento de doenças crônicas. Ambos os sistemas co-evoluíram para permitir essa interação local, como encontrado nos tecidos linfoides primários e secundários e na mucosa. Estudos recentes demonstraram que os nociceptores detectam e respondem diretamente a antígenos estranhos, citocinas derivadas de células imunes e micróbios.
A ativação do nociceptor não só resulta em hipersensibilidade à dor e coceira, mas reduz o limiar de disparo do nociceptor, levando à liberação local de neuropeptídeos. Os peptídeos que são produzidos e liberados a partir dos terminais periféricos dos nociceptores podem bloquear a quimiotaxia e a polarização dos linfócitos, controlando a localização, a duração e o tipo de inflamação. Evidências recentes mostram que os neurônios sensoriais interagem com células imunes inatas através do contato célula-célula, por exemplo, envolvendo receptores de grupo 2D (NKG2D) em células natural killer (NK).
Dado que as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores, é concebível que os nociceptores usem neuropeptídeos para controlar a atividade das células NK. Aqui, elaboramos um método de co-cultura para estudar as interações entre o neurônio nociceptor e as células NK em um prato. Usando essa abordagem, descobrimos que os neurônios nociceptores lombares diminuem a expressão de citocinas de células NK. No geral, esse método reducionista poderia ser útil para estudar como os neurônios inervantes de tumores controlam a função anticancerígena das células NK e como as células NK controlam a eliminação de neurônios lesionados.

As células NK foram purificadas magneticamente a partir de esplenócitos de camundongos controle de ninhada (TRPV1 wt::D TAfl/wt) e estimuladas (48 h) com IL-2 e IL-15. As células NK foram então cultivadas isoladamente ou co-cultivadas com neurônios DRG colhidos do neurônio nociceptor intacto (controle littermate; TRPV1wt: :D TA fl/wt) ou ratos ablados (TRPV1cre::D TAfl/wt). As células foram então expostas ao agonista TRPV1 capsaicina (1 μM) ou seu veículo....

Os neurônios nociceptores e as células NK interagem ativamente em um contexto inflamatório. Uma abordagem de co-cultura permite estudar essa interação.

Provocando a interação entre células assassinas naturais e neurônios nociceptores

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Dado que o neurônio nociceptor secreta vários neuropeptídeos e que a célula NK expressou o receptor para esses neuropeptídeos, decidimos elaborar um método de co-cultura para estudar a interação entre a célula NK e os neurônios nociceptores. Tal método reducionista poderia ser útil para estudar como o neurônio nociceptor controla a função antitumoral da célula NK, e também pode ser interessante estudar como a célula NK controla a eliminação de neurônios lesados. Demonstrando o procedimento estará Ali Ahmadi, um ex-aluno de mestrado do meu laboratório.Para iniciar o isolamento e a cultura de células natural killer ou NK, colete o baço do rato em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de PBS estéril e, em seguida, homogeneize o baço usando um pilão. Em seguida, dilua as células com um mililitro de PBS estéril e filtre a mistura através de um filtro de células de 50 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Recarregue o volume de homogeneizado filtrado para 10 mililitros usando PBS estéril.Conte as células em 10 microlitros do homogeneizado diluído usando um hemocitômetro. Centrifugar as células restantes por cinco minutos a 500 G e remover o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em 10 para a oitava célula por mililitro em meio RPMI 1640 suplementado.Purificar magneticamente as células NK do baço usando um kit de isolamento de células NK de camundongo e confirmar a pureza das células NK usando citometria de fluxo. Conte as células usando um hemocitômetro, seguido de centrifugação em cinco minutos a 500 G, em seguida, remova o sobrenadante. Para estimular as células NK peletizadas, ressuspender essas células em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com IL-2 e IL-15.Cultura duas vezes 10 para a sexta célula NK por mililitro em uma placa de fundo U de 96 poços por 48 horas. 24 horas antes da estimulação das células NK, revestir a placa de 96 poços com 100 microlitros por poço de laminina e incubá-la por 45 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova a solução e deixe os poços secarem ao ar livre no armário de biossegurança.Em seguida, prenda o rato eutanasiado na prancha em posição prona. Levante a pele e incite a pele ao longo da coluna dorsal. Corte a articulação lombossacra e separe o sacro da coluna lombar com uma tesoura.Em seguida, separe a coluna cortando os músculos e costelas de ambos os lados na direção craniana até que a base do crânio seja atingida. Use uma tesoura para cortar a coluna vertebral na articulação atlantooccipital. Em seguida, remova o músculo e o tecido adiposo da coluna vertebral.Prenda e abra a coluna vertebral para remover a medula espinhal antes de obter acesso ao gânglio da raiz dorsal ou DRG nos forames intervertebrais conectados à medula espinhal através da raiz dorsal. Em seguida, colha os DRGs em um tubo cônico de 15 mililitros preenchido com 10 mililitros de DMEM suplementado a frio. Em seguida, centrifugar a preparação por cinco minutos a 200 G à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.Adicione 250 microlitros de PBS contendo um miligrama por mililitro de colagenase IV e 2,4 unidades por mililitro de dispase II.Incube este DRG com solução de colagenase-dispase por 80 minutos com agitação leve. Para inativar as enzimas, adicione cinco mililitros de meio DMEM suplementado e centrifugar a solução a 200 G.Após cinco minutos, remova suavemente o sobrenadante usando uma pipeta e deixe cerca de 100 microlitros do sobrenadante para evitar a perda celular indesejada. Em seguida, adicione um mililitro de meio DMEM suplementado às células e use uma pistola de pipeta e três pipetas Pasteur de vidro de tamanhos decrescentes para triturar suavemente o DRG em uma única preparação celular.Enquanto trabalha em um gabinete de biossegurança, diluir a albumina sérica bovina ou BSA em PBS estéril até uma concentração final de 15% e armazenar alíquotas de um mililitro a menos 20 graus Celsius. Para criar um gradiente BSA em um tubo cônico de 15 mililitros, adicione dois mililitros de PBS estéril e, em seguida, dispense lentamente um mililitro de solução de 15% de BSA na parte inferior do tubo. Evite interromper o gradiente removendo suavemente a pipeta.Usando uma pipeta P200, adicione a suspensão de gânglios triturados contendo os neurônios no lado do tubo no gradiente. Em seguida, defina a aceleração e desaceleração no mínimo para centrifugar o neurônio contendo o gradiente BSA por 12 minutos a 200 G.Após a centrifugação, remova todo o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda as células em 500 microlitros de Neurobasal. Placa de 10.000 neurônios por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços revestida de laminina.Para permitir a ligação dos neurônios, incube a placa de 96 poços durante a noite a 37 graus Celsius. Para começar a co-cultura, remova lentamente o Neurobasal da cultura de neurônios. Após 48 horas de estimulação com IL-2 e IL-15, ressuspenda as células NK e adicione 10 à quinta célula NK por poço à cultura de neurônios.Co-cultura das células em MX Neurobasal suplementado a 37 graus Celsius. Após 48 horas, recolher e lavar as células três vezes com PBS e centrifugar-as durante cinco minutos a 500 G a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante antes de corar as células com um a 1 000 corantes de viabilidade diluídos eFluor 780 durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Lavar e centrifugar as células conforme demonstrado, seguido de tratamento com CD 1632 por 15 minutos a quatro graus Celsius para bloquear locais não específicos nas células, seguido de coleta e lavagem das células com PBS três vezes. Após o próximo ciclo de lavagem e centrifugação, core as células com BV421, anti-NK-1.1, isotiocianato de fluoresceína anti-NKp46 e ficoeritrina anti-GM-CSF por 15 minutos. Mais uma vez, colete e lave as células três vezes com PBS, centrifuga-as e descarte o sobrenadante, em seguida, ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão FACS e imunofenótipo das células NK usando citometria de fluxo.Quando cultivadas isoladamente, as células NK expressaram níveis basais de fator estimulador de colônias de macrófagos de granulócitos ou GM-CSF e NKp46. Quando co-cultivada com neurônios DRG colhidos de camundongos nociceptores intactos, a estimulação com capsaicina diminuiu a expressão das células NK do GM-CSF. A capsaicina não teve impacto nas ativações das células NK quando co-cultivada com neurônios DRG colhidos de camundongos ablados.O nível de NKp46 não foi afetado. As principais etapas deste protocolo são a dissociação e o isolamento do DRG. A ideia é manter a máxima viabilidade neuronal, evitando fazer bolhas e usando a pipeta do tamanho certo.Após o protocolo, o investigador pode usar o sequenciamento de RNA ou qPCR para medir a mudança do transcrito em células purificadas com FACS, ou pode usar ELISA para medir a secreção de citocinas ou neuropeptídeos. Tal interação revela que a função das células NK é provavelmente sintonizada pelo neurônio nociceptor. E essa conversa cruzada pode ser importante em processos biológicos que vão desde lesões nervosas, infecções bacterianas e virais, até malignidades.

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