Uma abordagem baseada em espectrometria de massa para identificar fosfofamina fosfates e seus interacttores

PIB-MS é uma nova técnica usada para enriquecer fosfarprotetases esforprotetases e estão interagindo proteínas de células e tecidos. Envolve a identificação e quantificação dessas proteínas usando proteômica à base de espectrometria de massa. Esta técnica não requer a expressão exógena de versões marcadas de fosforprotetases fosforproteínas que poderiam alterar a atividade proteica ou a localização.

Além disso, não usa anticorpos que possam ser não específicos ou incapazes de distinguir entre isoformes específicos. Este método de investigação do PPPM pode ser dimensionado para uso em tudo, desde células até amostras clínicas. Para começar, colete a pelota celular por centrifugação a 277 vezes g por dois minutos em temperatura ambiente.

Remova a mídia e lave as células com cinco mililitros de PBS. Prepare o tampão de lise conforme descrito no protocolo de texto e mantenha no gelo. Adicione um mililitro de tampão de lise resfriado às amostras, homogeneize as amostras por sonificação e mantenha as células no gelo entre os pulsos.

Transfira os lises para tubos frescos de 1,5 mililitro. Centrifugar a amostra sonicada a 21,130 vezes g por 15 minutos a 4 graus Celsius. Use uma alíquota do lisato para quantificar a concentração total de proteínas usando um ensaio de ácido bicinchonínico.

Esta etapa é essencial para garantir a concentração igualitária de proteínas em cada amostra. Para um controle inibidor de fosfoproteína fosfaprotetora, prepare duas alíquotas de concentração de proteína igual para cada amostra. O tampão de lise pode ser usado para diluir as amostras para que cada tubo tenha concentração de proteína igual.

Adicione um micromolar de microcistina-LR livre a uma alíquota e um volume igual de DMSO ao outro. Vórtice as amostras e incuba-as no gelo por 15 minutos. A preparação das contas inibidoras de fosfatase deve ser realizada com antecedência ou durante as etapas de incubação descritas na seção de preparação da amostra.

Use 10 microlitadores de contas inibidoras de fosfattase sólida, ou resina PIB, para um miligrama de proteína e adicione-as a um tubo de 1,5 mililitro. Lave os PIBs três vezes com 0,5 mililitros de tampão de lise por vórtice seguido de centrifugação a 376 vezes g por 30 segundos em temperatura ambiente. Adicione uma quantidade apropriada de tampão de lise aos PIBs lavados para fazer 50% por volume solução de buffer PIB.

Misture suavemente a pipetação e gire a ponta da pipeta e o chorume para resuspensar os PIBs. Transfira 20 microliters do chorume para um tubo de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitros de tampão de lise. Gire os tubos a 376 vezes g por 30 segundos.

Cada tubo contém volumes iguais de PIBs nele. Descarte o supernascer, deixando apenas a resina sólida e até 50 microliters de tampão de lise em cada tubo. Transfira os lises para os tubos devidamente rotulados que contenham PIBs.

Incubar o lysate com os PIBs por uma hora a 4 graus Celsius com rotação a 8 rpm. Após a incubação com o lise, centrifugar os PIBs a 376 vezes g por 30 segundos a 4 graus Celsius e remover o supernante. Lave as contas adicionando 0,5 mililitros de tampão de lise e invertendo os tubos Cole as contas por centrifugação e remova o sobrenatário.

Repita esta etapa para um total de três lavagens. Após a lavagem final, remova o tampão de lise o máximo possível sem encanar os PIBs. Prepare o buffer de eluição contendo SDS de 2%e adicione o buffer de eluição de quatro a cinco vezes o volume de PIBs.

Incubar a 65 graus Celsius por uma hora para elutar as fosfafefinas fosfoproteínas das contas. Centrifugar os tubos a 376 vezes g por 30 segundos à temperatura ambiente. Colete o elunato em um tubo separado e prossiga para análises de espectrometria de massa ou manchas ocidentais.

Para regenerar os PIBs, incuba-os em solução 2%SDS com rotação a 8 rpm por uma hora em temperatura ambiente. Lave as contas três a cinco vezes em 25 mililitros Tris-HCl pH 7.5 com rotação por 30 minutos por lavagem. Armazene PIBs em 25 milimerlares Tris HCL pH 7.5 com azida de sódio.

Para análise de espectrometria de massa, os métodos de filtragem e análise de dados variam e podem ser realizados pelo pesquisador ou por uma instalação central. Depois de pesquisar os dados brutos em um banco de dados proteome específico para espécies, filtrar os resultados de pesquisa e exportá-los como uma planilha do Microsoft Excel. Analise os dados em triplicados.

Para quantificação sem rótulos, use medições de área de pico MS1 para quantificar os dados. Para identificar subunidades PPP e seus interactdores de novo, compare triplicados biológicos de amostras inibidas por microcistina-LR e tratadas com DMSO. Filtre os dados para que apenas proteínas com uma contagem total de peptídeos de mais de uma em pelo menos duas das três amostras tratadas com controle DMSO estejam presentes.

Para filtrar proteínas que não se ligam especificamente à resina, remova as proteínas nas quais a contagem total de peptídeos na condição tratada com microcistina-LR é maior do que a de qualquer subunidade catalítica PPP. Exclua contaminantes comuns como queratina, colágeno, proteínas ribossômicas e ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas da análise. Um arquivo CSV é essencial para importar os dados para Perseus.

Importe dados filtrados em Perseus clicando no upload de matriz genérica na seção Carregar. Transforme os dados indo para o Basic Transform, selecionando os dados e especificando a função de transformação como base de registro 2 de x. Imputar valores perdidos de uma distribuição normal indo para a imputação, Substitua os valores ausentes da distribuição normal, selecionando os dados e especificando a largura e o downshift para o cálculo.

Realize a normalização quântica indo para Normalizar, normalização quântica. Anote os dados indo para linhas de anotações, linhas de anotação categóricas. Realize o teste T do aluno indo a Testes, Testes de duas amostras, selecionando os grupos, o teste a ser realizado e o método para correção de teste de hipóteses múltiplas, conforme usado para truncação.

Esta função também calcula as razões de log 2. Fosfotatos fosfotínicos e seus interagedores foram identificados nas células HeLa usando um experimento de retirada do PIB, seguido por quantificação sem rótulos de abundância de proteínas em amostras tratadas com DMSO e microcistina-LR. O enredo vulcânico da análise de espectrometria de massa identificou aglutinantes PIB específicos mostrados em subunidades vermelhas, catalíticas em azul, e novas subunidades PPP candidatas, ou proteínas interagindo, em branco.

As pastas não específicas foram mostradas em cinza. O gráfico de dispersão da área de log2 da célula HeLa tratada pelo DMSO mostrou que as abundâncias estavam altamente correlacionadas, indicando a reprodutibilidade dos dados. A análise de rede de todas as subunidades fosfarprotetases de fosforproteína e proteínas interativas mostrou que essas proteínas eram interagidores específicos na retirada do PIB.

Análises de proteômica global poderiam ser realizadas e os resultados comparados com a análise do PIB para determinar se a composição do PPPome é impulsionada pela abundância de PPP ou regulada por mecanismos pós-translacionais. PIB-MS é uma ferramenta amplamente aplicável que nos permitiu identificar diferenças nos padrões de expressão de PPP em várias condições, como interfase versus amostras mitóticas ou diferenças entre as linhas celulares cancerosas.