Demonstrando a inervação da pele cabeluda e glabrous em um padrão 3D usando múltiplas abordagens de coloração fluorescente e limpeza de tecidos
May 20th, 2022
A espessura das seções teciduais limitou o estudo morfológico da inervação da pele. O presente protocolo descreve uma técnica única de limpeza tecidual para visualizar fibras nervosas cutâneas em seções de tecido espessas de 300 μm sob microscopia confocal.
Nosso protocolo forneceu um método viável para observar a seção de sincronização usando microscópio confocal, o que poderia garantir precisão na observação das fibras nervosas. Protocolo simples e fácil de limpeza de tecidos é uma das principais vantagens dessa técnica. O processo de limpeza de tecidos é eficiente e leva cerca de 30 minutos a uma hora.
Conduta perfusão no rato eutanizado como mencionado no manuscrito do texto. Use um bisturi para remover a pele do dorso e sola da pata traseira. Para amostras que requerem uma seção congelada, corrija os tecidos em 4% de aldeído em PB molar de 0,1 por duas horas.
Após a lavagem, incorpore os tecidos da pele em 2% agarose a 37 graus Celsius e coloque-os dentro da caixa de gelo para resfriamento. Fixar o tecido montado na microtona vibratória com água gelada e cortá-los a uma espessura de 500 micrômetros na direção transversal. Após o corte, retire a agarose das seções e armazene-as em uma placa de seis poços com 1x PBS.
Incubar as seções teciduais em uma solução de 2%triton X-100 em 1x PBS durante a noite a quatro graus Celsius. Coloque as seções teciduais no tampão de bloqueio e gire a 72 rotações por minuto no agitador durante a noite a quatro graus Celsius. Transfira as seções teciduais para a solução contendo os anticorpos primários do anti-CGRP monoclonal do rato e do anticorpo anti-LYVE-1 de ovelha em tampão de diluição no tubo de micro centrífuga.
Em seguida, gire no shaker por dois dias a quatro graus Celsius. Lave as seções teciduais duas vezes com tampão de lavagem à temperatura ambiente, em seguida, mantenha-as no shaker durante a noite a quatro graus Celsius no tampão de lavagem. No dia seguinte, transfira as seções teciduais para a solução mista contendo os anticorpos secundários em um tubo de micro centrífugas e gire a 72 rotações por minuto no agitador por cinco horas a quatro graus Celsius.
Lave as seções de tecido em uma placa de seis poços com tampão de lavagem duas vezes por uma hora em temperatura ambiente. Mantenha as seções teciduais na lavagem do tampão no agitador durante a noite a quatro graus Celsius. Transfira as seções teciduais para o reagente de limpeza tecidual e gire a 60 rotações por minuto no agitador suavemente por uma hora à temperatura ambiente.
Monte os tecidos claros na lâmina, em seguida, circule os tecidos com um espaçador e coloque a lacuna com reagente de limpeza de tecido fresco e deslize de cobertura. O padrão 3D demonstrou que as fibras nervosas positivas CGRP passaram pelo tecido subcutâneo e derme para a epiderme. Estas fibras nervosas correram em feixes no tecido subcutâneo ramificado dentro da derme e terminadas na epiderme.
Em contraste, a faloidina nos vasos sanguíneos positivos e os vasos linfáticos positivos LYVE-1 estão distribuídos no tecido subcutâneo e na dermis. Geralmente, as fibras nervosas positivas CGRP corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos e vasos linfáticos formando uma rede 3D na pele pelrosa e glabrous. Com a abordagem convencional, embora os vasos sanguíneos das fibras nervosas e vasos linfáticos tenham sido claramente rotulados com fábula CGRP e LYVE-1 nas seções finas, a observação dessas estruturas foi limitada pela espessura da fatia e não pode ser observada completamente.
Na seção com espessura de 30 micrômetros, não houve diferença entre pele pelrosa e pele glabrous na superfície das fibras nervosas positivas CGRP. Nas seções de tecido de 300 micrômetros de espessura, em comparação com a pele pelrosa, a área superficial das fibras nervosas positivas CGRP da pele glabrous foi significativamente aumentada. É importante usar o tampão de limpeza com alta pressão osmótica após a incubação de anticorpos.
Várias vezes, o tempo de limpeza necessário para a coloração da imunoexorescência é necessário. Após esse procedimento, acreditamos que existe também a possibilidade de coloração e observação de outros tecidos e órgãos em seis seções. Essa técnica poderia auxiliar pesquisadores de neurociência encontrando a área da superfície e o estado das fibras neurológicas.
Também nos ajuda a observar a inovação de tecidos e órgãos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma nova técnica de clareamento de tecido para a visualização de fibras nervosas cutâneas em secções de tecido grossas de 300 µm usando microscopia confocal. O método aprimora o estudo morfológico da inervação da pele, abordando as limitações da secção fina convencional.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imagem de tecido
- Microscopia confocal
Fundo
- Estudar a inervação da pele é crucial para entender as vias sensoriais.
- Os métodos tradicionais são limitados pela finura das secções de tecido.
- Visualizar fibras nervosas em secções mais espessas pode oferecer insights mais profundos.
- O método visa melhorar a precisão e a eficiência da imagem.
Propósito do Estudo
- Desenvolver e validar uma técnica de clareamento de tecido para secções de pele grossa.
- Facilitar a observação de fibras nervosas e sua relação com vasos sanguíneos e linfáticos.
- Proporcionar um método que possa ser adaptado para estudar outros tecidos e órgãos.
Métodos Utilizados
- A microscopia confocal foi utilizada para visualizar fibras nervosas em secções de tecido clareado.
- O modelo biológico envolveu ratos eutanasiados, observando especificamente a pele do dorso e da pata traseira.
- Etapas-chave incluíram perfusão de tecido, incorporação, coloração com anticorpos e clareamento de tecido.
- Todo o protocolo de limpeza e imagem tipicamente leva de 30 minutos a uma hora.
Principais Resultados
- A técnica de clareamento revelou com sucesso fibras nervosas positivas para CGRP formando uma rede 3D dentro da pele.
- Os resultados indicaram diferenças significativas na distribuição de fibras nervosas entre pele piluda e glabra.
- O método permitiu a observação detalhada das relações estruturais com vasos sanguíneos e linfáticos.
- Fibras positivas para CGRP foram encontradas correndo paralelas ou cercadas por vasos sanguíneos e linfáticos.
Conclusões
- Esta técnica aprimora a capacidade de visualizar e estudar a inervação da pele de forma abrangente.
- A visualização melhorada pode contribuir com insights valiosos sobre mecanismos neurobiológicos.
- Aplicações potenciais se estendem a vários tecidos, promovendo uma pesquisa mais ampla em neurociência.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Three-dimensional visualization of skin innervation using thick tissue sections and multiplex fluorescent staining addresses a critical gap in mapping peripheral nerve architecture. This approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling comprehensive analysis of nerve, blood, and lymphatic vessel interactions in disease-relevant skin models. The method supports translational continuity for neurobiology and dermatology-focused R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed mapping of sensory nerve fiber distribution in both hairy and glabrous skin.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships between nerves and vasculature.
- Improves predictive confidence for target validation in peripheral nervous system research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated 3D skin models for downstream phenotypic screening.
- Enhances assay reproducibility by standardizing tissue clearing and staining protocols.
- Provides quantitative outputs on nerve fiber surface area and network complexity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling both hairy and glabrous skin innervation.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neurocutaneous targets.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing structural biomarkers in skin tissue.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model development.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on nerve-vasculature interactions in skin.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D readouts for assay development.
- Analytics: Provides surface area measurements and network mapping for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment in disease-relevant skin models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to other tissues and organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in nerve mapping.
- Operational Value: Streamlines tissue processing with efficient clearing and staining workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust 3D data for target evaluation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurocutaneous and dermatological programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and multiplex immunofluorescence.
- Demands access to tissue clearing reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining and clearing protocols.
- Adaptable to various tissue types with protocol optimization.
- Dependent on antibody quality and clearing efficiency for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Perfusion, Triple Fluorescent Staining, and Tissue Clearing Treatment
3:10
Results: Enhanced Understanding of the Skin Innervation via Immunofluorescence and a 3D View of the Cutaneous Nerve Fibers in the Hairy and Glabrous Skin
4:31
Conclusion
