Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

O chip de glomérulo isogênico permitirá a modelagem de doenças específicas do paciente e testes de nefrotoxicidade e aplicações avançadas de medicina de precisão. O epitélio glomerular e o endotélio são derivados de uma única população de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou IPSCs. Os IPSCs possuem auto-renovação ilimitada e podem se diferenciar em quase qualquer tipo de célula.

Esta técnica pode ser usada para avaliar fenótipos celulares patológicos e doenças. O chip de órgão específico do paciente também pode servir como uma plataforma para triagem de medicamentos e estudos mecanicistas. Este modelo pode ser aplicado ao desenvolvimento de um corpo em um sistema de chips personalizado para um paciente específico.

Este sistema tem o potencial de prever respostas específicas do paciente antes do teste clínico. Comece adicionando suavemente 25 microlitros de matriz de membrana basal 2 solução ao canal urinário e 20 microlitros no canal capilar do chip. Pegue duas tampas de tubo cônicas estéreis de 15 mililitros e encha-as com 500 microlitros de água destilada estéril.

Coloque a tampa na placa de Petri para evitar a secagem e coloque a tampa no prato. Incube-o a 37 graus Celsius durante a noite. Procedendo, aspirar o meio de frascos T75 contendo uma cultura de 15 dias de células endoteliais vasculares a 90% de confluência.

Adicione cinco mililitros de tampão de descolamento celular e incube a 37 graus Celsius por cinco a sete minutos. Em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de DMEM / F-12. Centrífuga a 200 vezes G durante cinco minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 300 microlitros de meio de manutenção endotelial. Conte as células com um hemocitômetro para obter aproximadamente 2 milhões de células. Usando uma ponta de barreira P200, lave os canais superior e inferior do chip microfluídico com 200 microlitros de DMEM / F-12 enquanto aspira simultaneamente da periferia da tomada.

Segure o chip firmemente com a ponta de barreira P200 presa ao aspirador longe da saída do canal inferior. Injete firmemente 20 microlitros da suspensão de células endoteliais vasculares no canal capilar do chip e aspirar cuidadosamente o meio da periferia da saída. Verifique sob o microscópio se há bolhas ou uma densidade de semeadura desigual.

Inverta suavemente o chip para que as células possam aderir ao lado basal da membrana PDMS flexível. Coloque o chip no cartucho do suporte e adicione três mililitros de PBS no cartucho para evitar que a membrana seque. Incube o chip a 37 graus Celsius por três horas.

Verifique o canal inferior sob o microscópio para uma camada confluente de células ligadas à membrana PDMS flexível. Lave as células desligadas adicionando 200 microlitros de meio de manutenção endotelial na entrada do canal inferior enquanto aspira da periferia da saída do canal capilar. Coloque o chip de volta no cartucho do suporte e incube a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, lave suavemente o canal capilar com 200 microlitros de meio de manutenção endotelial. Lave o canal urinário com 200 microlitros de DMEM / F-12 e solte 50 microlitros de DMEM / F-12 nas portas de entrada e saída. Procedendo células mesodérmicas intermediárias, substituir o meio de indução mesoderma intermediário de cada poço da placa de 12 poços por um mililitro de tripsina EDTA e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Raspe suavemente as células usando um elevador de células e dissociar as células usando pipetagem. Adicione dois mililitros de solução de neutralização de tripsina a cada poço e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Completar o volume da suspensão celular para 50 mililitros com DMEM/F-12 e centrifugar a 200 vezes G durante cinco minutos.

Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 microlitros de meio intermediário de indução mesodérmica para obter aproximadamente 3 milhões de células. Conte as células com um hemocitômetro. Segure o chip e injete firmemente 25 microlitros de suspensão celular no canal urinário do chip enquanto aspira cuidadosamente o meio da periferia da tomada.

Verifique se há bolhas ou densidade de semeadura de células irregulares. Adicione três mililitros de PBS no cartucho do suporte do chip e incube a 37 graus Celsius por três horas. Após a incubação, lavar ambos os canais com 200 microlitros de seu respectivo meio de cultura celular.

Fixe as pontas de barreira P200 vazias em ambas as saídas dos canais urinário e capilar. Pipetar 200 microlitros de meio de manutenção endotelial e injetar metade dele na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada de tal forma que tanto a entrada quanto a saída do canal sejam presas às pontas da pipeta cheias de meio.

Repita este procedimento para a entrada do canal urinário com 200 microlitros de meio intermediário de manutenção mesodérmica. Incube os chips com pontas embutidas a 37 graus Celsius durante a noite. Para conectar os chips ao biorreator de chip de órgão, primeiro, remova as pontas P200 dos canais.

Adicione gotículas dos respectivos meios à entrada e saída dos canais urinário e capilar para evitar a secagem. Adicione três mililitros de meio de indução de podócitos quentes ao reservatório de entrada urinária e três mililitros de meio de manutenção endotelial quente ao reservatório de entrada capilar. Adicione 300 microlitros dos respectivos meios aos reservatórios de saída diretamente sobre a porta de saída.

Deslize as cápsulas para a bandeja e para o biorreator do chip do órgão. Use o mostrador rotativo para selecionar e iniciar o ciclo principal por dois minutos. Inspecione visualmente a parte inferior do pod em busca de pequenas gotículas em todas as quatro portas fluídicas.

Para obter contato fluido-fluido entre a parte inferior do pod e as portas do chip microfluídico, deslize suavemente o portador do chip para o pod. Pressione suavemente a aba do portador do chip para dentro e para cima. Aspirar o excesso de meio da superfície do chip.

Defina a taxa de fluxo do biorreator do chip do órgão para 60 microlitros por hora. Defina a tensão cíclica para 10% a 0,4 hertz. Use o mostrador rotativo no biorreator do chip do órgão para selecionar o ciclo de regulação e funcionar por duas horas.

Inspecione visualmente os reservatórios de saída para um aumento no nível do meio. Use o mostrador rotativo no biorreator do chip do órgão para selecionar o ciclo de regulação. Após o dia 17 de cultura, aspirar diariamente o meio dos reservatórios de saída do canal urinário diagonalmente longe do porto, mas manter algum meio no reservatório.

Reabasteça o reservatório de entrada do canal urinário com até três mililitros de meio de indução de podócitos a cada dois dias durante cinco dias. Após cinco dias, aspirar o meio do canal urinário, mas manter algum meio no reservatório. Reabasteça o reservatório de entrada do canal urinário diariamente com três mililitros de meio de manutenção de podócitos.

Da mesma forma, aspirar o meio da saída do canal capilar e reabastecer os reservatórios de entrada diariamente com meio de manutenção endotelial. Usando este protocolo, células-tronco pluripotentes induzidas por humanos foram usadas para desenvolver um modelo funcional in vitro do glomérulo propagando células endoteliais vasculares e podócitos. No dia 21, após a indução de podócitos e a propagação do endotélio vascular, as células dentro dos chips expressaram marcadores de identificação de linhagem como Podocin e Nefrina para podócitos, VE Caderina e PECAM-1 para células endoteliais vasculares.

Tanto o podócito quanto as camadas de células endoteliais vasculares expressaram o colágeno IV, que é a proteína GBM mais abundante no glomérulo renal. Os chips de glomérulo filtraram seletivamente pequenas moléculas, como a inulina, do capilar para o canal urinário, evitando que grandes proteínas como a albumina deixassem o canal capilar, mostrando uma função de filtração molecular seletiva. Durante a indução endotelial nos dias quatro a sete, um aumento no número de células pode resultar em uma camada secundária de células, mas a semeadura excessiva pode causar agregação que pode impedir a diferenciação.

Fluxo cruzado inesperado de fluido entre os canais urinário e capilar pode ser observado em caso de ligação inadequada dos componentes do chip PDMS, bloqueio no caminho do fluxo de fluido ou barreira de filtração comprometida. Ao semear endotélio e epitélio e manter os cavacos a partir dos dias 15, é importante inspecionar visualmente as bolhas de ar nos canais a cada passo. No chip isogênico de glomérulo, candidatos a medicamentos clinicamente relevantes podem ser administrados para testar seu potencial terapêutico ou níveis de toxicidade.

Esta técnica agora abre oportunidades para entender a base genética da doença renal humana e desenvolver terapias personalizadas.