Name: Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a editar genes em hepatócitos de rato primário usando CRISPR-Cas9 por eletroporação. Este método reprodutível permite criar modelos de doenças metabólicas hepáticas in vitro e in vivo com alta eficiência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A RNC recebeu financiamento do Centro de Bioengenharia da Carolina do Sul de Regeneração e Formação de Tecidos A bolsa piloto apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) dos Institutos Nacionais de Saúde, da Associação Americana para o Estudo das Doenças hepáticas e da Sociedade Americana de Terapia Genética & Celular sob os números de subvenção P30 GM131959, 2021000920, e 2022000099, respectivamente. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais da Sociedade Americana de Terapia Genética & Celular ou da Associação Americana para o Estudo das Doenças Hepáticas. O esquema para a Figura 1 foi criado com BioRender.com.

<ol><li>Pampols, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+metabolic+rare+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Inherited metabolic rare disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).</li>
<li>Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approach+to+treatable+inborn+metabolic+diseases%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).</li>
<li>Arnon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation+in+children+with+metabolic+diseases%3A+the+studies+of+pediatric+liver+transplantation+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience.</a> Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).</li>
<li>Maiorana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preemptive+liver+transplantation+in+a+child+with+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia.</a> Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).</li>
<li>OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx">https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx</a> (2019).</li>
<li>Fabris, L., Strazzabosco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+and+undiagnosed+liver+diseases%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities.</a> Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).</li>
<li>Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+translational+models+for+rare+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+notch+ligand+Jagged1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li>
<li>Lima, A., Maddalo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMMs%3A+Somatically+engineered+mouse+models.+a+new+tool+for+in+vivo+disease+modeling+for+basic+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1117(2021).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seamless+modification+of+wild-type+induced+pluripotent+stem+cells+to+the+natural+CCR5Delta32+mutation+confers+resistance+to+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).</li>
<li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584(2014).</li>
<li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+correction+of+the+sickle+mutation+in+human+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells.</a> Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).</li>
<li>Rathbone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+delivery+of+Cas9+ribonucleoproteins+results+in+high+levels+of+gene+editing+in+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes.</a> The CRISPR Journal. , (2022).</li>
<li>Benchling [Biology Software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2022).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+printing+of+mouse+primary+hepatocytes+to+generate+3D+hepatic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure.</a> Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Lattanzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CRISPR%2FCas9+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+for+therapeutic+genomic+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements.</a> Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).</li>
<li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).</li>
<li>Grompe, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrompe%2C+M+%22Hereditary+Tyrosinemia%3A+Pathogenesis%2C+Screening+and+Management%22">Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management</a>. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.

As etapas descritas no protocolo para isolamento hepatócito são desafiadoras e exigem prática de proficiência. Existem vários passos-chave para o isolamento hepatócito bem sucedido do fígado. Em primeiro lugar, a canulação adequada da veia cava inferior é essencial para a perfusão hepática completa. A ausência de branqueamento no fígado após a perfusão indica deslocamento do cateter (Tabela 1). A veia cava inferior (perfusão retrógrada) foi cânulada no procedimento por ser mais simples e acessível que a ...

IMDs do fígado são distúrbios genéticos caracterizados pela deficiência de uma enzima hepática crucial envolvida no metabolismo que leva ao acúmulo de metabólitos tóxicos. Sem tratamento, as IMDs do fígado resultam em falência de órgãos ou morte prematura 1,2. A única opção curativa para pacientes com IMDs do fígado é o transplante hepático ortotópico, que é limitado devido à baixa disponibilidade de órgãos doadores e complicações da terapia imunossupressor após o procedimento 3,4. De acordo com dados recentes coletados pela Rede de Captação e Transplante de Órgãos, apenas 40%-46% dos pacientes adultos na lista de espera por transplante de fígado recebem um órgão, enquanto 12,3% desses pacientes morrem enquanto estão na listade espera 5. Além disso, apenas 5% de todas as doenças raras do fígado têm um tratamento aprovado pela FDA6. É claro que há uma necessidade crítica de novos tratamentos para IMDs do fígado. No entanto, modelos adequados de doenças são necessários para desenvolver novas opções terapêuticas.
Modelar doenças humanas usando sistemas in vitro e in vivo continua sendo um obstáculo para o desenvolvimento de terapias eficazes e o estudo da patologia dos DDM do fígado. Hepatócitos de pacientes com doenças hepáticas raras são desafiadores para obter7. Modelos animais são cruciais para o desenvolvimento da compreensão da patologia da doença e para testar estratégias terapêuticas. No entanto, um obstáculo é a geração de modelos a partir de embriões portadores de mutações letais. Por exemplo, tentativas de criar modelos de camundongos da Síndrome de Alagille (ALGS) com embriões contendo exclusões homozigosas de uma sequência de 5 kb perto do final de 5′do gene Jag1 resultaram na morte precoce dos embriões8. Além disso, gerar modelos de mouse por edição de genes em células-tronco embrionárias pode ser otempo e o recurso intensivo 9. Por fim, mutações aparecerão fora do tecido alvo, levando a variáveis de confusão que podem impedir o estudo da doença9. A edição de genes somáticos permitiria uma edição mais fácil no tecido hepático e contornaria os desafios associados à geração de modelos usando células-tronco embrionárias.
A eletroporação permite a entrega do CRISPR-Cas9 diretamente no núcleo, aplicando correntes de alta tensão para permeabiliizar a membrana celular e é compatível com muitos tipos de células, incluindo aquelas que são intransigentes às técnicas de transfecção, como células-tronco embrionárias humanas, células-tronco pluripotentes e neurônios 10,11,12 . No entanto, a baixa viabilidade é uma potencial desvantagem da eletroporação; otimizar o procedimento pode produzir altos níveis de entrega ao mesmo tempo em que limita a toxicidade13. Um estudo recente demonstra a viabilidade de eletroporar componentes CRISPR-Cas9 em hepatócitos primários e humanos como uma abordagem altamente eficiente14. A eletroporação ex vivo em hepatócitos tem potencial para ser aplicada para gerar novos modelos de camundongos para IMDs humanos do fígado.
Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo detalhado para isolar hepatócitos de camundongos do fígado e, posteriormente, eletroporar CRISPR-Cas9 como complexos RNP, consistindo de proteína Cas9 e RNA de guia único sintético (sgRNA), ou Cas9 mRNA combinado com sgRNA para obter altos níveis de edição de genes no alvo. Além disso, o protocolo fornece métodos para quantificar a eficiência, a viabilidade e a funcionalidade de edição de genes após a eletroporação do CRISPR-Cas9 em hepatócitos de camundongos recém-isolados.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, tampas planas transparentes anexadas, natural</td> Placas de Colágeno <td>de 6 poços USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td> Microscópio Fluorescente All-in-one <td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de Vórtice Analógico</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART Pontas filtradas de furo largo 1.000 &micro; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de Dissecção de Cera Azul</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9" x 6.5" x 1/2"+F21</td></tr><tr><td>Raspador/levantador de células</td><td>Argos Technologies</td><td>UX-04396-53</td> Tubos cônicos <td>estéreis não pirogênicos</td></tr><tr><td>(15 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>Curvos tesoura</td><td>Cooper Surgical</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri Descartáveis</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>100mm,</td></tr><tr><td>Placas de Petri Descartáveis</td> Estéreis <td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35mm,</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de Microplacas Epoch</td> Estéril <td>BioTek Instruments</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Falcon Cell (70 &micro; m)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Cooper Surgical</td><td>61864</td><td>Euro-Med Adson Tissue Fórceps</td></tr><tr><td>IV cateteres&nbsp;</td><td>BD</td><td>382612</td><td>24 G x 0,75 in</td></tr><tr><td>IV conjunto de infusão</td><td>Baxter</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini Centrífuga</td><td>Benchmark Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Dispositivo</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Programa T-028 foi usado para eletroporação em hepatócitos de camundongos</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Masterflex</td><td> HV-77120-42</td><td>10 a 60 rpm; 90 a 260 VAC</td></tr><tr><td>Tubulação de bomba de precisão</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 pés, silicone</td></tr><tr><td>Placas de cultura primária</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353846</td><td>Placas de cultura de tecidos contendo nitrogênio</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (25 mL)</td> <td>Seringas Fisher Scientific</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 mL, estéreis</td></tr><tr><td>Termociclador T100</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp; EGFP mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning Life Sciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885076</td><td>Baixa glicose, piruvato</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermoscientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Manutenção de hepatócitos Meio (MM)</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>Hepatócito Plating Medium (PM)</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA de Albumina de Camundongo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0010653</td><td></td></tr> Kit de <tr><td>Hepatócitos de Hepatócitos</td><td>Onza</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq HotStart DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>70011-044</td><td>Sem cloreto de cálcio ou magnésio</td></tr><tr><td>Percoll (solução PVP)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido periódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>Solução de extração rápida de DNA</td><td>Lucigen Corporation QE05090</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s reagente de sulfito de fucsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Vermelho de fenol</td></tr><tr><td>Vybrant MTT Cell Viability Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Solução de perfusão 1 (pH 7,4, esterilizado por filtro)&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td>Estável a 4 &graus; C por 2 meses</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14155063</td><td>Completo para 200 mL</td></tr><tr><td>EGTA (0,5 M)</td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>HEPES (pH 7.3, 1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><forte>Solução de Perfusão 2 (pH 7,4, esterilizada por filtro)&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td>Estável a 4 &graus; C por 2 meses</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20 (1.8 mM)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 &micro; L de 1 M de estoque&nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS (sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>Completo para 200 mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H20 (0,8 mM)</td><td>Sigma</td><td>30391-25G</td><td>160 e micro; L de 1 M stock</td></tr><tr><td>Solução de Perfusão 3&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td>Preparado fresco antes do uso</td></tr><tr><td>Solução 2</td><td></td><td></td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>0.094 Wunsch unidades/mL</td></tr><tr><td><forte>Coquetel Anestésico de Mouse&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromzina</td><td></td><td></td><td>0,25 mg/mL concentração final</td></tr><tr><td>Cetamina</td><td></td><td></td><td>7,5 mg/mL concentração final</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td></td><td></td><td>1,5 mg/mL concentração final</td></tr><tr><td>Software</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TIDE: Rastreamento de Indels por https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td><td></td> de decomposição</tr></tbody></table>

entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mrna em hepatócitos de rato primário recém-isolados

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para isolar hepatócitos primários do rato seguido pela entrega mediada por eletroporação de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) e mRNA. Os hepatócitos primários do camundongo foram isolados usando um método de perfusão retrógrada de três etapas, resultando em altos rendimentos de até 50 × 106 células por fígado e viabilidade celular de >85%. Este protocolo fornece instruções detalhadas para chapeamento, coloração e hepatócitos. Os resultados indicam que a eletroporação proporciona uma alta eficiência de transfecção de 89%, medida pela porcentagem de células positivas de proteína fluorescente verde (GFP) e viabilidade celular modesta de >35% em hepatócitos de camundongos.
Para demonstrar a utilidade dessa abordagem, o CRISPR-Cas9 direcionado ao gene de dioxygenase hidroxifenyfenyruvate foi eletroporado em hepatócitos primários como prova de princípio de edição de genes para interromper um gene terapêutico relacionado a uma doença metabólica herdada (IMD) do fígado. Observou-se maior escíctil de 78% para RNPs em comparação com 47% de eficiência de edição com mRNA. A funcionalidade dos hepatócitos foi avaliada in vitro usando um ensaio de albumina que indicava que a entrega de CRISPR-Cas9 como RNPs e mRNA resulta em viabilidade celular comparável em hepatócitos de camundongos primários. Uma aplicação promissora para este protocolo é a geração de modelos de camundongos para doenças genéticas humanas que afetam o fígado.

Isolamento de hepatócitos primários plateable do fígado O processo global de perfusão hepática e isolamento hepatocito é ilustrado na Figura 1. Neste experimento, foram utilizados ratos C57BL6/6J de 8-10 semanas de idade. Espera-se que o procedimento produza 20-50 × 106 células por rato com uma viabilidade entre 85% e 95%. Se a viabilidade for &lt;70%, o tratamento percoll deve ser seguido para remover células mortas. Hepatócitos recém-isolados devem ser banhad...

Este protocolo descreve técnicas para isolar hepatócitos primários do fígado e eletroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas e mRNA para interromper um gene alvo terapêutico associado a uma doença metabólica herdada do fígado. Os métodos descritos resultam em alta viabilidade e altos níveis de modificação genética após a eletroporação.

Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

A principal vantagem de nossa técnica é que é uma abordagem fácil, rápida e reprodutível para a edição de genes em hepatócitos de camundongos primários como forma de gerar modelos in vitro e in vivo da doença. Usando nossa técnica, pode ser possível derrubar um gene alvo em hepatócitos isolados e, em seguida, transplantá-los de volta para o paciente, para substituir células doentes por hepatócitos editados por genes Pesquisadores inexperientes podem lutar com a cannulação e manter o cateter estável durante toda a perfusão. Os usuários são aconselhados a ler e praticar cuidadosamente o procedimento e os métodos de solução de problemas antes de começar.Demonstrando a perfusão hepática e o isolamento da hepatocita serão Tina Parker, gerente de clínica e Ilayda Ates, assistente de pesquisa de pós-graduação. O procedimento de eletroporação será demonstrado por Callie Stuart, uma assistente de pesquisa de pós-graduação do meu laboratório. Sob um plano cirúrgico de anestesia.Inicie a perfusão hepática fazendo uma incisão lateral em forma de U na pele do abdômen usando uma tesoura, e expanda o orifício através dos lados. Continue abrindo a pele para a caixa torácica. Usando uma tesoura, corte o peritônio para expor a cavidade abdominal até a caixa torácica.Tomando cuidado para não roubar nenhum órgão. Mova os intestinos para o lado direito usando a parte de trás das fórceps ou a superfície cega da tesoura. Identifique a veia portal e a veia cava inferior.Inicie a bomba para lavar a solução de perfusão pré-aquecida através do cateter. Pare a bomba e remova o cateter. Em seguida, insira a ponta da agulha conectada ao cateter na veia cava inferior em um ângulo de 10 a 20 graus na veia, remova a agulha do cateter.Em seguida, empurre suavemente o cateter para dentro da veia em um movimento paralelo à veia. Conecte a tubulação ao cateter sem mover o cateter mais para dentro da veia. Inicie a bomba com uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto.Procure o fígado imediatamente ficando pálido como um sinal de que a perfusão é bem sucedida. Corte a veia do portal usando uma tesoura. Aumente gradualmente a vazão para cinco mililitros por minuto.Uma vez que a solução de perfusão três está fluindo através de monitorar cuidadosamente a elasticidade do fígado. Para determinar se o fígado amoleceu, pressione suavemente o fígado com um cotonete ou fórceps e verifique se as indagações se formam no fígado. Tenha cuidado para não exagerar para evitar a perda de viabilidade celular.Uma vez que o fígado amoleça depois de 30 a 50 mililitros de solução de perfusão três fluiu, pare a bomba, remova o cateter e a vesícula biliar. Cuidado para não derramar seu conteúdo. Em seguida, dissecar cuidadosamente o fígado.Coloque o fígado em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo DME M gelado com meio 10%FBS. Gire a placa de Petri suavemente para remover possíveis coágulos sanguíneos. Transfira o fígado para uma nova placa de Petri contendo DME M gelado e meio 10% FBS.Para liberar células da cápsula hepática, coloque a placa de Petri no gelo e, em seguida, usando dois pares de fórceps estéreis, rasgue suavemente a cápsula hepática em todos os lóbulos. Gire suavemente o fígado ao redor no meio usando um levantador de células para liberar os hepatócitos. Continue este movimento até que o fígado se torne muito pequeno e a suspensão fique marrom e opaca.Remova os restos do tecido hepático da placa e usando uma pipeta sorológica de 25 mililitros definida para baixa velocidade, transfira cuidadosamente a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros pré-refrigerado no gelo e equipado com um filtro de célula de 100 micrômetros. Adicione DMEM frio fresco e meio 10% FBS à placa de Petri para lavar e coletar as células restantes da superfície. Então, transfira para o tubo cônico de 50 mililitros.Repita esta etapa até que todas as células sejam coletadas. Para lavar e purificar hepatócitos de células não parenchímicas, centrifugar as células coletadas no tubo cônico de 50 mililitros a 50 RCF a quatro graus Celsius por cinco minutos em baixa desaceleração ou sem qualquer quebra. Descarte o super-naton contendo detritos e células não parenchímicas.Em seguida, suspenda novamente a pelota na sobra do super-naton girando suavemente o tubo. Após a suspensão da pelota adicione 30 mililitros de DMEM frio fresco e meio 10% FBS. Comece a preparar a mídia, as células e o instrumento de eletroporação CRISPR CAS 9 ligando o botão de alimentação no dispositivo de eletroporação.Em seguida, defina o programa de eletroporação pressionando o botão X e, em seguida, o botão de seta para baixo até que o programa T 0 28 apareça na tela. Preparei os poços de destino para os hepatócitos eletroporados adicionando 1,5 mililitros de PM a seis placas bem colágenas revestidas. Incubar as placas em uma incubadora Celsius de 37 graus até estar pronta para uso.Em tubos de tira split PCR, prepare os complexos CAS 9 RMP e mRNA, conforme descrito no manuscrito do texto. Armazene a mistura de RNA MRNA SG no gelo até a eletroporação. Separadamente, prepare um tubo contendo um micrograma de E G F P mRNA para verificar a eletroporação bem sucedida usando microscopia de fluorescência.Centrifugar a reação de eletroporação a 100 RCF por dois minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernaton da pelota celular e adicione 100 microliters de solução de nucleoffection por reação ao longo da lateral da parede do tubo. Suspender os hepatócitos na solução de eletroporação balançando o tubo suavemente à mão.Uma vez que os hepatócitos são uniformemente dispersos na solução de eletroporação, transfira 100 microliters da suspensão do hepatócito para os tubos de tira contendo os nove complexos CAS. Transfira bem o conteúdo da tira para um vaso de eletroporação. Coloque o vaso nucleo-veterinário na ranhura do dispositivo de eletroporação.Eletroporar os hepatócitos pressionando o botão X. Após a eletroporação, espere uma tela aparecer no dispositivo que diz: Ok. Pressione novamente o botão X e remova a nave.Incubar o vaso eletroporado no gelo por 15 minutos. Adicione 500 microliters um PM pré-armado ao navio de eletroporação. Transfira 300 microliters da reação de eletroporação para cada destino bem na placa pré-aquecida.Incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Adicione a matriz de membrana ao meio de manutenção de hepatocitste gelada e misture por tubulação para cima e para baixo 10 vezes. Remova o meio dos poços designados para análise de edição de genes 24 horas após o revestimento das células.Pipeta a mistura de sobreposição lentamente em cima das células e coloque a placa de volta a 37 graus Celsius. Às 24 horas após o revestimento, transfira o meio condicionado do poço designado para ensaios MTT e albumina e armazene em um tubo de microfusagem até pronto para executar o ensaio albumin. Prossiga com a análise da atividade cas nove alvo, extraindo o DNA genômico e configurando o PCR conforme descrito no manuscrito do texto.Dentro de 3 a 12 horas após o revestimento dos hepatócitos aderidos à placa e a morfologia celular assumiu uma aparência típica poligonal ou hexagonal dentro de 24 horas A pureza das células isoladas foi verificada através da coloração glicogênio usando o reagente de mudança de ácido periódico às 24 horas após o revestimento. O citoplasma dos hepatócitos manchados apareceu magenta. Os hepatócitos foram imageados 24 horas após a eletroporação e, em média, 89,8% dos hepatócitos foram positivos.Três dias após eletroporação CAS nove induzidos no lócus hpd onde analisados e os resultados mostraram em indels alvo de 47,4% em hepatócitos eletroporados com CRISPR Cas nove mRNA e 78,4% indels para o CAS nove RNP. O ensaio MTT mostrou 35,4 e 45,9% de viabilidade em hepatócitos tratados com CRISPR Cas nove mRNA e R N P.Consistente com os resultados MTT os níveis de albumina normalizados foram de 31,8% em hepatócitos tratados com CAS nove RNA e 34,5% para CAS nove r p. O mais importante a se lembrar é que a cannulação adequada afeta todas as etapas posteriores e o sucesso do procedimento.Após este procedimento, os hepatócitos podem ser transplantados e camundongos para investigar seus enxertos. Além disso, o DNA genômico de hepatócitos banhados pode ser extraído para analisar a eficiência e especificidade da edição cas nove.

electroporation-mediated-delivery-cas9-ribonucleoproteins-mrna-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Os detalhes do protocolo de artigo para site-specific transfecção de scrambled sequência de siRNA em uma cultura de células aderentes mamíferos usando uma rede de microeletrodos (MEA).

Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA)

Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação dos hepatócitos saudável e funcional principal do rato. Instruções para a detecção de síntese hepática da proteína nascente por substrato de rotulagem não-radioativo foram fornecidas para ajudar a compreender os mecanismos subjacentes a síntese de proteínas no contexto da homeostase do metabolismo energético no fígado.

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

É apresentado aqui um protocolo para a edição eficiente do gene de CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-negociado em pilhas de mamíferos usando o electroporation do tubo.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Traduzir a purificação da afinidade do Ribossoma (armadilha) permite a isolação rápida e eficiente do tipo de pilha-específico que traduz o mRNA. Aqui, Nós demonstramos um método que combine a injeção hidrodinâmico da cauda-veia em um modelo do rato do repovoamento do fígado e da armadilha para examinar o perfil da expressão de repovoamento hepatocytes.

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Este protocolo descreve o procedimento de edição do genoma em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos usando complexos ribonucleoprotéicos Cas9-sgRNA montados in vitro e liberados por eletroporação.

Ruptura Gênica de Alta Eficiência em Macrófagos Primários Derivados da Medula Óssea Usando Complexos Eletroporados Cas9-sgRNA

Biocompatíveis pH responsivos nanosensors sol-gel pode ser incorporado em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun. Os andaimes de auto-relato produzidos podem ser utilizados para a monitorização in situ de condições micro-ambientais, enquanto a cultura de células sobre o andaime. Isto é benéfico porque a construção celular 3D pode ser monitorado em tempo real, sem perturbar o experimento.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Aprenda a editar genes em hepatócitos de rato primário usando CRISPR-Cas9 por eletroporação. Este método reprodutível permite criar modelos de doenças metabólicas hepáticas in vitro e in vivo com alta eficiência.

Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados

Explorar mais vídeos