Name: Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda métodos de infecção viral em mosquitos Aedes aegypti por alimentação oral e microinjeção intratorácica. Este protocolo avalia a competência vetorial de arbovírus e as barreiras do intestino médio e glândulas salivares.

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Este trabalho foi apoiado pelo Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Preparação de vírus e mosquitos
<ol><li>Preparação de vírus OBS: Todos os processos foram realizados em laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2). O nível de contenção de biossegurança utilizado deve ser determinado pela avaliação de risco do patógeno e regulamentos específicos para nações e regiões. O processo deve ser realizado em um gabinete de biossegurança.<ol><li>Inocular 1 x 106 células C6/36 num balão de cultura T75. Encher o frasco com 10 mL de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). NOTA: O meio L-15 de Leibovitz (L15) ou o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) também podem ser usados para manter células C6/36.</li>
		<li>Manter as células em 5% CO2 a 28 °C durante a noite e remover o sobrenadante celular no dia seguinte, quando as células estiverem 80%-90% confluentes.</li>
		<li>Adicionar 1 ml de diluição viral (Multiplicidade de Infecção (MOI) = 0,01) no balão e incubar as células durante 1 h em CO2 a 5% a 28 °C. O Ebinur Lake virus (EBIV)15, um orthobunyavirus transmitido por mosquitos, foi utilizado como vírus modelo para este protocolo.</li>
		<li>Retire o sobrenadante e lave as células 3x com 5 mL de PBS. Encher o frasco com 15 mL de novo meio RPMI com SFB a 2%. Manter o balão em 5% de CO2 a 28 °C.</li>
		<li>Coletar o sobrenadante contendo vírus quando o título viral necessário for atingido (após quase 5 dias, dependendo do vírus usado). Para EBIV, esse valor de título foi de 10a 7 unidades formadoras de placa (UFP)/mL. Subembalá-los em tubos de armazenamento individuais de tampa de rosca de 2 mL e armazenar os tubos contendo 0,5-1 mL de vírus a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação do título viral NOTA: Determinar o título viral através dos ensaios de placa16. BHK-21 foi usado para determinar o título viral de EBIV, devido ao óbvio efeito citopático (CPE) observado em células infectadas.<ol><li>Inocular 1 x 105 células BHK-21 em cada poço de placas de 24 poços. Encher cada poço com 1 mL de meio DMEM contendo 10% de SFB e 1% de P/S. Manter as células em 5% de CO2 a 37 °C durante a noite.</li>
		<li>Fazer seis (10-6) diluições sucessivas de 10 vezes de sobrenadante contendo vírus com meio DMEM fresco contendo 10% de SFB e 1% de P/S.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de diluente viral em cada poço de placas de 24 poços contendo a monocamada BHK-21. Eliminar o diluente viral após incubação durante 1 h em 5% de CO2 a 37 °C. Adicionar 500 μL de DMEM contendo 1,5% de metilcelulose a cada poço.</li>
		<li>Células de cultura em CO2 a 5% a 37 °C por 48 h (o ECP aparente foi encontrado após 48 h para EBIV). Fixar as células durante a noite com 750 μL de formaldeído a 3,7%.</li>
		<li>Colora-os com 200 μL de violeta de cristal a 2% por 15 min. Conte o número de placas para calcular o título viral.</li>
	</ol></li>
	<li>Reprodução de mosquitos em laboratório NOTA: Mosquitos traseiros em um laboratório de nível 1 de contenção de artrópodes (ACL-1).<ol><li>Para a preparação da água desclorada, encha um balde de 20 L com água da torneira e deixe-o repousar por 7-8 dias sem luz. Não cubra a tampa.</li>
		<li>Manter ovos e larvas de Aedes aegypti em uma sala de mosquitos com as seguintes condições: 28 ± 1 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h e umidade relativa de 75% ± 5%.</li>
		<li>Manter cerca de 1.000 larvas em um prato raso (22 cm x 15 cm x 6 cm) contendo água desclorada após a eclosão dos ovos. Alimente-os com quase 1/8 colher de chá de pó de ração para ratos. Refrescar os alimentos diariamente e trocar a água a cada 2 dias.</li>
		<li>Uma vez que as larvas pupam após 5-7 dias, use um conta-gotas único para transferir as pupas para um copo plástico (7 oz) cheio de água desclorada.</li>
		<li>Coloque cinco xícaras contendo pupas (cerca de 200 por xícara) em uma gaiola de malha (30 cm x 30 cm x 30 cm) e mantenha as gaiolas na incubadora de insetos com as mesmas condições da etapa 1.3.2.</li>
		<li>Coloque uma pequena esponja contendo uma solução de glicose a 8% (m/p) em cada gaiola de malha para alimentar mosquitos adultos. Após a emergência do adulto, retire os copos sem pupas. Mantenha as gaiolas de malha com cerca de 1.000 mosquitos adultos por gaiola na mesma incubadora de insetos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação para infecção oral
<ol><li>Preparar mosquitos fêmeas para infecção oral. Use a máquina de absorção de mosquitos para coletar mosquitos de 5 a 8 dias de idade. Anestesia-os a -20 °C por 1 min e verifique se os mosquitos estão tontos. Caso contrário, anestesiar-os por mais um minuto a -20 °C.</li>
	<li>Despeje-os rapidamente nos copos plásticos (24 oz) a cerca de 200 mosquitos (fêmeas e machos) por xícara. Cubra rapidamente cada copo com um mosquiteiro bem cortado, seguido de uma tampa com um orifício (aproximadamente 6 cm de diâmetro) no meio.</li>
	<li>Passe fome os mosquitos por 24 h antes da infecção oral e prepare a refeição de sangue infecciosa da seguinte maneira.</li>
	<li>Em um gabinete de biossegurança sob condições BSL-2, retire o estoque de vírus do freezer de -80 °C e descongele-o no gelo. Diluir o estoque de vírus para uma concentração de 2 x 106 PFU/mL com meio RPMI 1640 contendo 10% de SFB e 1% de P/S. Misture a diluição do vírus com um volume igual de sangue de cavalo desfibrado. OBS: Os processos foram realizados em gabinete de biossegurança em laboratório de ACL-2.</li>
</ol>3. Realizar infecção oral
OBS: Todas as etapas foram realizadas em laboratório de ACL-2. O processo deve ser realizado no porta-luvas para evitar que os mosquitos escapem.
<ol><li>Realizar alimentação artificial utilizando o sistema de alimentação artificial do mosquito por 1 h.<ol><li>Cortar as membranas de colágeno no tamanho adequado (aproximadamente 5 cm de diâmetro), fixá-las aos reservatórios com o-rings e, em seguida, adicionar a mistura vírus-sangue (aproximadamente 3 mL) aos reservatórios. Use tampões plásticos para vedar reservatórios e evitar vazamentos. OBS: Essas etapas foram realizadas em uma cabine de biossegurança.</li>
		<li>Coloque os copos plásticos (24 oz) contendo mosquitos no porta-luvas. Rosqueie os reservatórios selados no alimentador FU1 e coloque um reservatório em um copo e, em seguida, ligue a unidade de alimentação. Alimente os mosquitos por 1 h</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesiar os mosquitos por CO2 por vários segundos até que desmaiem. Em resumo, coloque a pistola de dióxido de carbono no meio da malha de rede através do buraco no copo que contém mosquitos, abra o valor e permita que enormes quantidades de dióxido de carbono sejam expelidas para anestesiar os mosquitos.</li>
	<li>Despeje-os em uma placa de Petri colocada no gelo e cubra a tampa rapidamente. Escolha os mosquitos fêmeas ingurgitados com fórceps. Para identificar, os machos têm antenas de penas e as fêmeas têm antenas planas. Transfira-os para copos plásticos novos a 50 fêmeas de mosquitos por xícara. NOTA: As fêmeas ingurgitadas de mosquitos foram colhidas para manter a consistência, pois a quantidade de alimentação afeta o conteúdo viral.</li>
	<li>Embrulhe o copo com uma malha mosquiteira cortada e, em seguida, cubra-o com uma tampa com um buraco no meio. Corte a esponja em um pedaço pequeno e coloque no copo.</li>
	<li>Adicione solução de glicose a 8% na esponja usando um conta-gotas descartável de plástico. Manter os copos contendo fêmeas de mosquitos na incubadora a 27 °C a 80% de umidade por 10 dias. Substitua uma nova esponja saturada de glicose a cada 72 h.</li>
</ol>4. Preparo para inoculação intratorácica
<ol><li>Prepare as agulhas de microinjeção da seguinte forma. Utilizar um PUL-1000 para confecção de agulhas de microinjeção (Figura 1A) com os seguintes parâmetros no programa extrator da agulha: Índice de calor = 450, força (g) = 110, distância (mm) = 1,00 e atraso (s) = 0.</li>
	<li>Cortar a ponta de uma agulha tracionada com uma pinça sob o microscópio dissecante em aumento de 16x (Figura 1B). Não deixe a ponta muito grande, caso contrário pode prejudicar os mosquitos.</li>
	<li>Prepare mosquitos fêmeas como na etapa 2.1. NOTA: Os seguintes processos foram realizados em um laboratório de ACL-2.</li>
	<li>Preparar a diluição do vírus infeccioso da seguinte forma:<ol><li>Retire o estoque de vírus do freezer de -80 °C e descongele-o no gelo. Diluir o vírus para uma diluição de vírus de 100 nL contendo 100-500 vírus PFU com meio RPMI 1640 contendo 10% FBS e 1% P/S. Mantenha a diluição do vírus no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Encha novamente a agulha com óleo mineral através de uma seringa estéril descartável. Conecte a agulha no injetor seguindo as instruções na máquina.</li>
	<li>Introduza a agulha num tubo contendo a diluição do vírus infeccioso. Não quebre a ponta da agulha. Pressione o botão FILL para encher a agulha com solução de vírus. O volume final da solução viral na agulha é de aproximadamente 4,0 μL. Uma vez que a agulha está cheia com o vírus, tenha cuidado para não tocá-lo e danificá-lo. OBS: As etapas foram realizadas em uma cabine de biossegurança.</li>
</ol>5. Realizar injeção viral sob microscópio dissecante
OBS: Todas as etapas foram realizadas em laboratório de ACL-2.
<ol><li>Anestesiar mosquitos a -20 °C por 1 min. Despeje-os em uma placa de Petri colocada no gelo e cubra a tampa rapidamente.</li>
	<li>Escolha cerca de 50 mosquitos fêmeas com pinça e coloque-os na placa de gelo. Coloque a placa de gelo sob o injetor e insira a agulha na cavidade torácica do mosquito sob o microscópio dissecante (Figura 1C).</li>
	<li>Ajuste o volume de injeção para 100 nL e a taxa para 50 nL/s. Pressione o botão INJECT para deixar a solução do vírus fluir para o mosquito. Se ocorrer uma injeção bem-sucedida, o abdômen ficará ligeiramente protuberante.</li>
	<li>Coloque o mosquito infectado em um novo copo plástico (24 oz) colocado no gelo. Quando o número de mosquitos infectados for suficiente, envolva o copo com uma malha mosquiteira cortada e, em seguida, cubra-o com a tampa.</li>
	<li>Manter o copo contendo mosquitos infecciosos na incubadora a 27 °C a 80% de umidade por 10 dias. Alimente os mosquitos como no passo 3.5.</li>
</ol>6. Processamento das fêmeas de mosquitos infectadas
NOTA: Três tecidos/órgãos diferentes foram dissecados de cada fêmea do mosquito: o intestino para calcular a taxa de infecção pelo vírus (VIR), a cabeça para calcular a taxa de disseminação do vírus (VDR) e a saliva para calcular a taxa de transmissão do vírus (VTR). VIR foi definido como o número de mosquitos com intestinos positivos para vírus. VDR foi definido como o número de mosquitos com cabeças vírus-positivas dividido pelo número de mosquitos com intestinos vírus-positivos por 100. A VTC foi definida como o número de mosquitos com saliva vírus-positiva dividido pelo número de mosquitos com intestinos vírus-positivos por 100.
<ol><li>Coleta de saliva das fêmeas de mosquitos infectadas NOTA: Os processos devem ser realizados em um laboratório ACL-2.<ol><li>Anestesiar as fêmeas de mosquitos infectadas por anestesia com dióxido de carbono como no passo 3.2. Despeje-os em uma placa de Petri colocada no gelo e feche a tampa rapidamente.</li>
		<li>Coloque as pontas da pipeta de 10 μL preenchidas com óleo de imersão lado a lado sobre a lama de borracha.</li>
		<li>Escolha mosquitos fêmeas com pinças e coloque-os em uma placa de gelo. Retire as pernas e asas com uma pinça. Coloque a parte bucal de um mosquito em cada ponta da pipeta.</li>
		<li>Colete a saliva como secretada no óleo pelos mosquitos para os próximos 45-60 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Colocar as pontas da pipeta em tubos de 1,5 mL contendo 200 μL de meio diluente viral (meio RPMI 1640 contendo 10% FBS e 1% P/S). Centrifugar-os a 5.000 x g por 5 min a 4 °C para expelir a saliva em tubos. Conservar estes tubos a -80 °C para posterior determinação das taxas de transmissão.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecar os mosquitos fêmeas infectados NOTA: Os processos devem ser realizados em um laboratório ACL-2.<ol><li>Use pinças para cortar as cabeças das fêmeas de mosquitos após a coleta de saliva. Coloque cada cabeça em um tubo individual contendo 200 μL de meio RPMI 1640.</li>
		<li>Pegue o tórax com um tweezer, depois o penúltimo segmento do abdômen com outra pinça e puxe-o para fora. O intestino será arrancado. Limpe o intestino arrancado de qualquer tecido e órgãos perdidos.</li>
		<li>Lave o intestino com PBS e coloque cada intestino em um tubo individual contendo 200 μL de meio RPMI 1640. Conservar estes tubos a -80 °C para posterior determinação da taxa de infecção e da taxa de disseminação do vírus.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Análise dos dados
<ol><li>Extração de RNA<ol><li>Triture os tecidos em pedaços com uma máquina de moagem homogeneizadora de tecidos de baixa temperatura ajustada para os seguintes parâmetros: frequência de operação = 60 Hz, tempo de operação = 15 s, tempo de pausa = 10 s, ciclos = 2 e temperatura de ajuste = 4,0 °C.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Extrair o RNA total de cada amostra pelo sistema automatizado de extração de ácido nucleico seguindo as instruções do instrumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizando qRT-PCR<ol><li>Use o kit de RT-PCR de uma etapa para quantificar as cópias do RNA viral usando um instrumento de PCR quantitativo17. Use os seguintes primers para a detecção do segmento F do EBIV S: ATGGCATCACCTGGGAAAG e R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Definir o processo de reação como: estágio 1: 42 °C por 5 min, 95 °C por 10 s; estágio 2: 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 20 s.</li>
		<li>Determinar a dose de vírus mais baixa para a infecção nas células através das diluições seriadas de 10 vezes inoculadas nas células. Use as células BHK-21 para determinar a menor dose viral de EBIV, usando diluições até 10-7 , conforme descrito na etapa 1.2.</li>
		<li>Calcular o valor de Ct da menor dose de vírus por qRT-PCR. Use o valor de corte para EBIV-positivo por qRT-PCR como < 35. Use a seguinte equação para calcular as cópias de EBIV em cada amostra: y = -4,0312x + 3,384 [x = log (as cópias do EBIV), y = valor Ct, R2 = 0,9905]</li>
		<li>Calcule a taxa de infecção, a taxa de disseminação e a taxa de transmissão da seguinte forma: Taxa de infecção (%) = 100 x (o número de intestinos de mosquitos positivos para vírus / o número total de mosquitos) Taxa de disseminação (%) = 100 x (o número de cabeças de mosquito positivas para vírus / o número de intestinos de mosquito positivos para vírus) Taxa de transmissão (%) = 100 x (o número de saliva de mosquito positivo para vírus / o número de intestinos de mosquito positivo para vírus)</li>
		<li>Analisar as diferenças nas variáveis contínuas e diferenças nas taxas de infecção do mosquito, taxas de disseminação e taxas de transmissão usando a análise não paramétrica de Kruskal-Wallis para comparações múltiplas e o teste exato de Fisher, quando apropriado.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O objetivo deste método foi fornecer uma avaliação de risco abrangente de um vírus transmitido por mosquitos, avaliando a competência do vetor por meio de alimentação oral e inoculação intratorácica.
No experimento de alimentação oral, os mosquitos ingurgitados precisam ser colhidos e transferidos para um novo recipiente, representando um sério risco para os operadores. Isso porque qualquer mosquito, inclusive mosquitos não infectados, pode ser fonte de infecção19. Cons...

Os vírus transmitidos por mosquitos (MBVs), um grupo heterogêneo de vírus de RNA, podem persistir em mosquitos vetores e subsequentemente se espalhar para hospedeiros vertebrados1. Os MBVs clinicamente importantes estão distribuídos majoritariamente em quatro famílias de vírus: Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae e Peribunyavividae 2,3. Nas últimas décadas, esses vírus têm sido relatados em todo o mundo, causando problemas de saúde pública. Como um dos MBVs mais conhecidos, o vírus da dengue (DENV) tornou-se o arbovírus emergente ou reemergente mais prevalente em mais de 100 países durante os últimos 20 anos4. Desde a descoberta do vírus Zika (ZIKV) no interior, quase todos os países e territórios tropicais e subtropicais do continente relataram infecções humanas pelo VZIK5. Com o objetivo de avaliar o risco de transmissão do vírus, inúmeros estudos nos últimos anos têm focado na competência do mosquito vetor para esses vírus 6,7. Como resultado, é fundamental prevenir e controlar eficazmente as doenças transmitidas por vetores.
O Aedes aegypti (Ae. aegypti), um dos mosquitos mais facilmente criados em laboratório, é um importante vetor do DENV, ZIKV, Chikungunya virus (CHIKV) e vírus da febre amarela (YFV)8. Durante muito tempo, o Aedes aegypti foi encontrado apenas no continente africano e no sudeste asiático, mas nos últimos anos colonizou quase todos oscontinentes9. Além disso, a abundância global de Aedes aegypti vem crescendo continuamente, com um aumento estimado de 20% até o final do século10. De 2004 a 2009, na China, foi evidente o aumento da competência do vetor Aedes aegypti para o DENV devido às temperaturas mais elevadas no dia-a-dia11. O status do Aedes aegypti como vetor patogênico aumentou significativamente na China. Consequentemente, para enfrentar esses desafios, é necessário investigar a competência vetorial do Aedes aegypti para transmitir vírus.
Como um artrópode hematófago, a fêmea do mosquito perfura a pele de um hospedeiro vertebrado e se alimenta do sangue. Os mosquitos ocasionalmente adquirem vírus de hospedeiros infectados por vírus e, em seguida, transferem os vírus para um novo hospedeiro. Assim, para determinar a competência vetorial, os mosquitos são alimentados com uma farinha de sangue artificial contendo arboviroses por meio de um sistema de alimentação em ambiente de laboratório12. Os mosquitos individuais são separados em cabeças, corpos e secreções de saliva vários dias após a infecção. Para medir a infecção, disseminação e taxas de transmissão do vírus, os títulos virais foram detectados por PCR quantitativo de transcrição reversa (qRT-PCR) ou ensaio de placa. No entanto, nem todos os mosquitos desenvolvem infecções do intestino médio e a capacidade de transferir um vírus para o próximo hospedeiro após a alimentação sanguínea. Está ligada às barreiras fisiológicas dos mosquitos, que impedem a penetração de patógenos no organismo e desempenham papel vital em sua imunidade inata13. As barreiras do intestino médio, particularmente a barreira de infecção do intestino médio (MIB) e a barreira de escape do intestino médio (MEB), influenciam se o vírus poderia infectar o vetor sistemicamente e a eficiência com que ele se espalha. Dificulta a análise da infecção de outros tecidos, como as glândulas salivares, que também apresentam infecção das glândulas salivares e barreiras de escape13,14. Para melhor caracterizar a infecção do intestino médio e glândulas salivares no vetor, um protocolo detalhado para alimentação oral e inoculação intratorácica de arbovírus em Aedes aegypti é apresentado. Este protocolo pode ser aplicado a arboviroses adicionais em uma variedade de mosquitos vetores, como a infecção por DENV e ZIKV em Aedes spp., e pode ser um procedimento praticável.

<table><tbody><tr><td>Aedes aegypti&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Cepa Rockefeller</td></tr><tr><td>Sistema automatizado de extração de ácido nucleico&nbsp;</td><td>NanoMagBio</td><td>S-48</td><td></td></tr><tr><td>BHK-21 células</td><td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buckets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C6/36 células&nbsp;</td><td>Centro Nacional de Recursos de Vírus, Instituto de Virologia</td><td></td><td></td>de Wuhan</tr><tr><td>Pistola de pulverização de dióxido de carbono&nbsp;</td><td></td> máquina centrífuga <td>de YHDFPCO2</td><td></td>de Yihong da wuhan</tr><tr><td></td><td>Himac&nbsp;</td><td>CF16RN</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96 Touch</td><td></td></tr><tr><td>Ebinur Lake virus</td><td></td><td></td><td>Cu20-XJ isolamento</td></tr><tr><td>Formaldeído&nbsp;</td><td>Wuhan Baiqiandu</td><td>B0003</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de luvas&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óleo</td><td>de</td> imersão <td>Glucose Hushi 10010518</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cargille</td><td>16908-1</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de Insetos</td><td>Memmert</td><td>HPP750T7</td><td></td></tr> Máquina <tr><td>de Moagem de Homogeneizador de Tecidos de Baixa Temperatura&nbsp;</td>Kit de Extração de Genoma de Vírus Magnético <td>Servicebio</td><td>KZ-III-F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NanoMagBio</td><td>NMG0966-16</td><td></td></tr><tr><td>gaiolas de malha (30 x 30 x 30 cm)</td><td>Huayu</td><td>HY-35</td><td></td></tr><tr><td>metilcelulose</td><td>Calbiochem</td><td>17851</td><td></td></tr><tr><td>ração para camundongos em pó&nbsp;</td>Extrator de Microeletrodos <td>BESSN</td><td>BS018</td><td></td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>PUL-1000</td><td>PUL-1000&nbsp; é um extrator horizontal controlado por microprocessador para fazer micropipetas ou microeletrodos de vidro usados em gravação intracelular, estudos de patch clamp, microperfusão ou microinjeção.</td></tr><tr><td>Malhas de rede mosquiteira&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injetor Programável de Nanolitros Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR096A</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>151140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copos de plástico (7 oz)&nbsp;</td><td>Copos de plástico Hubei Duoanduo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(24 oz)&nbsp;</td><td>Anhui shangji</td><td>PET32-Tub-1</td><td></td></tr><tr><td>Conta-gotas descartáveis de plástico</td><td>Biosharp</td><td>BS-XG-O3L-NS</td><td></td></tr><tr><td>Geladeira (-80 &deg; C)</td><td>Capilares de Vidro de Substituição Sanyo</td><td>MDF-U54V</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>RPMI médio 1640&nbsp;</td><td>Tubos</td> de armazenamento com tampa de rosca <td>Gibco C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>(2 mL) biofil</td><td></td><td>&nbsp; </td><td></td>FCT010005</tr><tr><td>Pratos rasos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esponja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estéril desfibrilada sangue de cavalo</td><td>Wuhan Purity Biotechnology</td><td>CDHXB413</td><td></td></tr><tr><td>T75 frasco de cultura</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>O sistema artificial de alimentação de mosquitos&nbsp;</td><td>Hemotek</td><td>Hemotek PS6</td><td></td></tr><tr><td>O microscópio de dissecação&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>&nbsp; stemi508</td><td></td></tr><tr><td>As placas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de gelo A máquina de absorção de mosquitos</td><td>Ningbo Bangning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>As pontas da pipeta&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>TF</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Dumont</td><td>0203-5-PO</td><td></td></tr></tbody></table>

infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Os vírus transmitidos por mosquitos (MBVs), que são patógenos infecciosos para vertebrados, são transmitidos por muitas espécies de mosquitos, representando uma grave ameaça à saúde pública. Uma vez ingeridos, os vírus devem ultrapassar a barreira do intestino médio do mosquito para chegar à hemolinfa, de onde podem potencialmente se espalhar para as glândulas salivares. Quando um mosquito pica, esses vírus são espalhados para novos hospedeiros vertebrados. Da mesma forma, o mosquito pode pegar vírus diferentes. Em geral, apenas uma pequena porção de vírus pode entrar nas glândulas salivares através do intestino. A eficiência de transmissão desses vírus para as glândulas é afetada pelas duas barreiras físicas encontradas em diferentes espécies de mosquitos: as barreiras do intestino médio e as barreiras das glândulas salivares. Este protocolo apresenta um método para detecção de vírus em glândulas salivares de Aedes aegypti após alimentação oral e infecção por injeção intratorácica. Além disso, determinar se o intestino e/ou as glândulas salivares impedem a disseminação viral pode auxiliar na avaliação de risco de MBVs transmitidos pelo Aedes aegypti.

Para examinar a distribuição de EBIV nos mosquitos infectados via alimentação sanguínea artificial (o título final viral foi de 6,4 x 106 UFP/mL) e injeção intratorácica (a dose viral foi de 340 UFP), RNAs virais na saliva, cabeças e intestinos dos mosquitos aos 10 dias pós-infecção (dpi) foram determinados.
Para o Aedes aegypti, o título viral de EBIV no intestino, cabeça e saliva das fêmeas inoculadas intratoracicamente foi muito maior do que nas fêmeas infectada...

Essa metodologia, que incluiu alimentação por via oral e infecção por injeção intratorácica, foi capaz de avaliar efetivamente a influência das barreiras do intestino médio e/ou glândulas salivares na infecção por arbovírus.

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Esse protocolo pode determinar se o intestino e as glândulas tireoides impedem a disseminação viral e pode auxiliar nas avaliações de risco de vírus transmitidos por mosquitos transmitidos pelo Aedes aegypti. Nosso protocolo incluiu dois métodos de infecção, a alimentação por via oral e a injeção intratorácica, que puderam avaliar efetivamente a competência vetorial das arboviroses. Este protocolo pode ser aplicado a infecções adicionais por arbovírus em uma variedade de mosquitos vetores, como a infecção pelo vírus da dengue e pelo vírus Zika no Aedes, e pode ser um procedimento viável.Quem demonstrará o procedimento será Fei Wang, assistente de pesquisa do meu laboratório. Para realizar a alimentação artificial usando o sistema de alimentação artificial do mosquito, corte as membranas de colágeno no tamanho adequado e fixe-as aos reservatórios com os anéis O. Adicione três mililitros da mistura vírus-sangue aos reservatórios e sele os reservatórios usando tampões plásticos para evitar vazamentos.Coloque os copos plásticos contendo mosquitos no porta-luvas. Rosqueie os reservatórios selados no alimentador FU1 e coloque um reservatório em um copo. Ligue a unidade de energia e alime

experimental-viral-infection-adult-mosquitoes-oral-feeding

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos para usar os sistemas de alfavírus transdução de expressar repórteres fluorescentes in vitro e em mosquitos adultos são descritos. Esta técnica pode ser adaptada para expressar toda a proteína de interesse em vez de ou em adição a um repórter.

Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Fonte: Liu, X., et al. Um ensaio de alimentação oral bacteriana com mosquitos tratados com antibióticos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a diminuição da microbiota intestinal nativa em mosquitos usando uma solução contendo sacarose com antibiótico. Isso é seguido por uma recolonização controlada com uma suspensão bacteriana administrada por meio de um sistema de alimentação por membrana para estabelecer uma população bacteriana definida no intestino do mosquito.

Estabelecimento de uma População Bacteriana Intestinal Definida em Mosquitos Adultos

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para realizar uma nanoinjeção de um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo em moscas Drosophila machos adultos e, posteriormente, estudamos as respostas antivirais iniciadas devido à infecção. A análise da reação em cadeia da polimerase identifica a regulação positiva de genes específicos nas moscas infectadas que indicam a ativação das vias de resposta imune, incluindo interferência de RNA e sinalização JAK / STAT.

Nanoinjeção viral intratorácica para estudar interações vírus-hospedeiro em moscas adultas

Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.

Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

Este artigo apresenta um protocolo para investigar o efeito de bactérias intestinais individuais do mosquito, incluindo isolamento e identificação de micróbios cultivados de mosquitos midgut, esgotamento de antibióticos de bactérias intestinais de mosquitos e reintroduzir uma espécie específica de bactérias.

Um ensaio de alimentação oral bacteriana com mosquitos tratados com antibióticos

O objetivo deste protocolo é entregar refeições de sangue derivadas de animais e artificiais aos mosquitos Aedes aegypti através de um alimentador de membrana artificial e quantificar precisamente o volume de refeições ingeridas.

Alimentação e quantificação de sangue derivados de animais e refeições artificiais em mosquitos Aedes aegypti

A administração oral do dsRNA produzido por bactérias, um método de entrega para interferência de RNA (RNAi) que é rotineiramente utilizado em caenorhabditis elegans, foi aplicada com sucesso aqui em mosquitos adultos. Nosso método permite estudos robustos de genética reversa e estudos de vetores de bloqueio de transmissão sem o uso de injeção.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

Aprenda métodos de infecção viral em mosquitos Aedes aegypti por alimentação oral e microinjeção intratorácica. Este protocolo avalia a competência vetorial de arbovírus e as barreiras do intestino médio e glândulas salivares.

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

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