Name: Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a isolar lisados de proteína celular inteira de processos faciais de camundongos e células de mesenquima palatal para análise de fosfoproteínas em desenvolvimento craniofacial.

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Os ratos 129S4 foram um presente do Dr. Philippe Soriano, da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai. Este trabalho foi apoiado com recursos dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH)/Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 para K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 para B.J.C.D.

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz e realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos institucionais. Camundongos 129S4 femininos com 1,5-6 meses de idade e alojados a uma temperatura sub-termoneutral de 21-23 °C foram usados para colheitas de embriões. Um fluxo de trabalho esquemático do protocolo está representado na Figura 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos, softwares, reagentes e animais utilizados neste protocolo.
1. Colheita de embriões de camundongos E11.5
<ol><li>Eutanize o camundongo gestante 11,5 dias após a detecção de plugue vaginal durante o acasalamento cronometrado em uma câmarade CO 2 usando a taxa de fluxo de CO2 aprovada pela IACUC necessária para aproximadamente 50% de deslocamento (2,95 L/min em um 360 em3 câmara) e duração da exposição (ver Tabela de Materiais). Realizar luxação cervical como método secundário de eutanásia. Prossiga imediatamente para dissecção.</li>
	<li>Coloque o corpo do rato em uma placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima. Pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominal beliscando e levantando a pele anterior à abertura vaginal com fórceps semken retos e cortando a pele levantada e camadas subjacentes com tesoura cirúrgica de lâmina reta em um ângulo de 45° em ambos os lados para gerar uma forma "V" que se estende a cada superfície lateral aproximadamente no meio do caminho entre os membros dianteiros e os retas.</li>
	<li>Usando as fórceps Semken, segure um dos chifres uterinos e corte abaixo do oviduto e acima do colo do útero com a tesoura cirúrgica. Corte o mesometrium para permitir a remoção completa do chifre uterino.</li>
	<li>Transfira o chifre uterino dissecado para 10 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobásico, 10,14 mM Na2HPO4 dibasic, pH 7.4] em uma placa de Petri de 10 cm.</li>
	<li>Remova o segundo chifre uterino no lado oposto da cavidade abdominal usando o mesmo procedimento descrito nas etapas 1.4-1.5.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri de 10 cm contendo ambos os chifres uterinos no gelo se não proceder imediatamente à dissecção de embriões individuais (ou seja, se um segundo rato fêmea for dissecado).</li>
	<li>Sob um microscópio estéreo dissecado, disseca cuidadosamente cada embrião dos chifres uterinos com fórceps finos Dumont #5. Lentamente afastar o miométrio, decidiua e chorão. Rasgue e remova o amnion relativamente transparente ao redor do embrião, e corte o cordão umbilical que liga o embrião à placenta.</li>
	<li>Transfira cada embrião dissecado para 2,5 mL de histologia PBS em um poço individual de uma placa de cultura celular de 12 poços no gelo usando uma tubulação de transferência de plástico cortada ou uma colher de embrião. NOTA: Se trabalhar com uma ninhada que possa conter embriões de mais de um genótipo, salve o amnion em torno de cada embrião para genotipagem colocando cada um em seu próprio tubo de microcentrifuuge de 0,5 mL pré-rotulado no gelo.</li>
</ol>2. Dissecando processos maxilares de embriões de camundongos E11.5
<ol><li>Prepare três pratos petri de 10 cm contendo 10 mL de histologia PBS e mantenha-as no gelo para serem usadas em rotação entre embriões.</li>
	<li>Transfira um embrião de um poço individual da placa de cultura celular de 12 poços para uma das placas de Petri de 10 cm com histologia PBS no gelo usando um tubo de transferência de plástico cortado ou uma colher de embrião.</li>
	<li>Sob o microscópio de dissecação, separe cada processo maxilar do rosto usando as fórceps finas. Primeiro, corte o lado anterior de um processo maxilar ao longo da recuo natural que separa o processo nasal lateral e o processo maxilar (Figura 2A).</li>
	<li>Em segundo lugar, corte o lado posterior do processo maxilar ao longo da recuo natural que separa o processo maxilar e o processo mandibular (Figura 2A).</li>
	<li>Em terceiro lugar, para separar completamente o processo maxilar, faça um corte vertical dos lados anterior para posterior do processo maxilar no lado dos olhos do processo maxilar onde as entradas naturais referenciadas acima da extremidade (Figura 2A-C).</li>
	<li>Repita estes três cortes para o processo maxilar no lado oposto do rosto.</li>
	<li>Usando uma tubulação Pasteur de 9" com uma pequena lâmpada de látex de 2 mL, transfira o par dissecado de processos maxilarias e uma pequena gota de aproximadamente 30 μL de histologia PBS para uma placa de Petri de 35 mm rotulada no gelo (Figura 2D).</li>
	<li>Siga os passos 2.3-2.7 para cada embrião, girando as três placas de Petri de 10 cm contendo histologia PBS no gelo entre embriões. Coloque pares individuais de processos maxilares dissecados em placas de Petri separadas de 35 mm no gelo. NOTA: A separação do ectoderme do processo maxilar e do mesenquime (etapas 2.9-2.17) pode ser realizada após dissecar os processos maxilais de todos os embriões na ninhada. Se forem desejados processos maxilais intactos contendo o ectoderme e o mesenchyme, proceda à etapa 2.18 abaixo.</li>
	<li>Prepare 250 μL de 2% de trippsina fresca na cultura tecidual PBS e 250 μL de 10% de soro bovino fetal (FBS) na cultura tecidual PBS e armazenar no gelo.</li>
	<li>Coloque uma segunda gota pequena de aproximadamente 30 μL de 2% de trippsina na placa de Petri de 35 mm separada da primeira gota pequena da histologia PBS contendo os processos maxilais. Transfira o par de processos maxilarários para a pequena gota de 2% de trippsina usando a pipet Pasteur (Figura 2D).</li>
	<li>Incubar o prato no gelo por 15 minutos.</li>
	<li>Retire a placa de Petri de 35 mm do gelo e coloque sob o microscópio de dissecação.</li>
	<li>Utilizando as fórceps finas, retire lentamente e cuidadosamente a camada de ectoderm de cada processo maxilar (Figura 2E). NOTA: Se o ectoderme não estiver se separando do mesenquime em uma folha intacta, incubar em 2% a trippsina à temperatura ambiente (RT) por até 5 minutos adicionais antes de continuar com a separação. Se o tecido começar a se desintegrar na trippsina de 2%, mova os processos maxilais para o FBS de 10%, como descrito abaixo para neutralizar a trippsina e terminar a separação do ectoderme e do mesenquime.</li>
	<li>Uma vez separados o ectoderme do processo maxilar e o mesenquime (Figura 2F), transfira os tecidos desejados do par de processos maxilarianos para uma terceira gotícula pequena de aproximadamente 30 μL de 10% FBS - separada das duas gotículas pequenas anteriores - usando o tubo Pasteur (Figura 2D).</li>
	<li>Coloque a placa de Petri de 35 mm no gelo para parar a trippsinização.</li>
	<li>Incubar os tecidos do processo maxilar no gelo em 10% FBS por 1-2 min, e depois transferir os tecidos de ambos os processos maxilarianos para uma quarta gota pequena de aproximadamente 30 μL de histologia pré-aplacida PBS no gelo - separada das três gotículas pequenas anteriores - usando o tubo Pasteur (Figura 2D).</li>
	<li>Incubar os tecidos de processo maxilar na histologia PBS por 1 min enquanto gira suavemente a histologia PBS em torno dos tecidos de processo maxilar com a ponta da tubulação Pasteur para garantir que todo fbs seja enxaguado do tecido.</li>
	<li>Transfira o par de tecidos de processo maxilar para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL rotulado no gelo usando o tubo Pasteur, minimizando a transferência da histologia PBS. Remova qualquer excesso de histologia PBS no tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL com a tubulação Pasteur.</li>
	<li>Siga os passos acima para dissecar os processos maxilarários de cada embrião na ninhada.</li>
	<li>Processe as amostras imediatamente para isolar as proteínas celulares inteiras (abaixo) ou armazenar a -80 °C a longo prazo. Antes do armazenamento a longo prazo, congele o tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL em um banho de EtOH 100% em gelo seco por 5 minutos.</li>
</ol>3. Isolar proteínas celulares inteiras de processos maxilares de camundongos
<ol><li>Se os processos maxilarários foram previamente congelados a -80 °C, descongele-os no gelo.</li>
	<li>Adicione 0,1 mL de tampão de lise NP-40 gelado (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; armazenado a 4 °C) com inibidores de protease e fosfatase (1x coquetel inibidor de mini-protease completo [dissolvido em água; armazenado a -20 °C], 1 mM PMSF [dissolvido em isopropanol; armazenado a 4 °C], 10 mM NaF [armazenado a -20 °C; evite congelar/descongelar], 1 mM Na3VO4 [armazenado a -20 °C], 25 mM β-glicerofofofesfato [armazenado a 4 °C]) adicionado imediatamente antes do uso no gelo. NOTA: O fracionamento celular pode ser realizado alternativamente para isolar frações citoplasmáticas, nucleares, membranas ou proteínas mitocondriais.</li>
	<li>Pipet para cima e para baixo 10 vezes com um pipetman de 200 μL.</li>
	<li>Vórtice para 10 s, e depois pipet para cima e para baixo 10 vezes com um pipetman de 200 μL. Evite gerar bolhas.</li>
	<li>Incubar a 4 °C por 2h enquanto gira a extremidade sobre a extremidade usando uma raquete de 1,5 mL/2 mL com um revólver de tubo.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 13.500 × g por 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Colete o supernatante a um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL no gelo com um pipetman de 200 mL.</li>
	<li>Quantifique a concentração de proteína com o kit de ensaio proteico, utilizando 10 μL de proteína lysate + 10 μL de tampão de lise NP-40 para amostras experimentais e 3-5 diluições de albumina de soro bovino (fração V) (BSA) em NP-40 lysis buffer em uma faixa de 0,25-2,0 mg/mL como padrão de proteína.</li>
	<li>Proceda com a eletroforese de gel de sulfato-poliacrilamida de sódio de sódio (SDS-PAGE) (passo 5) ou congele rapidamente os demais lises em gelo seco e armazene a -80 °C a longo prazo.</li>
</ol>4. Isolar as células inteiras de proteínas celulares das células primárias e/ou imortalizadas do mesenquime palatal do camundongo (MEPM)
NOTA: O isolamento e a cultura das células mepm primárias dos embriões de camundongos E13.5 e das células MEPM imortalizadas foram descritos anteriormente 32,33,34. A estimulação de células com fator de crescimento (etapas 4.1-4.7) pode ser realizada antes da lise celular. Se forem desejadas células não estimuladas, siga para a etapa 4.8 abaixo.
<ol><li>Aspire o meio de crescimento [O meio de Águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 10% FBS] das células MEPM a ~70% de confluência em um prato de cultura celular de 6 cm usando um tubo pasteur de 5,75" anexado a um sistema de vácuo.</li>
	<li>Lave as células com 1 mL de cultura tecidual PBS.</li>
	<li>Adicione 3 mL de meio de fome sárica [DMEM com 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 0,1% FBS] pré-enlagada em um banho de água de 37 °C.</li>
	<li>Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 23 h.</li>
	<li>Substitua o meio de fome de soro por 3 mL de meio de fome de soro fresco e pré-armado.</li>
	<li>Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 1h.</li>
	<li>Estimule as células com o fator de crescimento escolhido em uma concentração empiricamente determinada pelo tempo desejado.</li>
	<li>Aspire o meio das células MEPM a 80%-100% de confluência usando uma tubulação Pasteur de 5,75" ligada a um sistema de vácuo.</li>
	<li>Lave as células duas vezes com cultura de tecido gelado PBS (1 mL para um prato de cultura celular de 6 cm); incline a placa para o lado durante a última lavagem para garantir que toda a cultura do tecido PBS seja aspirada.</li>
	<li>Lise as células adicionando tampão de lise NP-40 gelado com inibidores de protease e fosfatase adicionados imediatamente antes do uso (0,1 mL para um prato de cultura celular de 6 cm) no gelo.</li>
	<li>Incubar a placa no gelo por 5 minutos com rotação aproximadamente cada minuto para garantir a cobertura completa da placa.</li>
	<li>Raspe as células da placa usando um levantador de células pré-cozido e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge pré-cozido de 1,5 mL no gelo.</li>
	<li>Incubar a suspensão da célula a 4 °C por 30 min enquanto gira a extremidade sobre a extremidade usando uma pás de 1,5 mL/2 mL com um revólver de tubo.</li>
	<li>Prossiga com as etapas 3.6-3.9 descritas acima.</li>
</ol>5. Mancha ocidental de lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de camundongos e/ou células MEPM para fosfoproteínas
<ol><li>Prepare amostras inteiras de proteína celular para SDS-PAGE.<ol>
<li>Determinar a quantidade de proteína a ser carregada, dependendo da abundância de proteínas no tecido/célula; 12,5 μg é geralmente suficiente para proteínas robustamente expressas em proteínas celulares inteiras.</li>
		<li>Adicione um volume igual de tampão laemmli 2x [20% glicerol, 4% SDS, 0,004% azul bromofenol, 0,125 M Tris HCl pH 6.8] com 10% β-mercaptoetanol adicionado imediatamente antes do uso. ATENÇÃO: β-mercaptoetanol é corrosivo de pele ou olho corrosivo, tóxico, perigoso se engolido, e tem toxicidade aquática. Manuseie luvas, um casaco de laboratório, escudo facial e óculos de segurança em um capuz de fumaça química. Descarte de acordo com as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental.</li>
		<li>Misture por vórtice.</li>
		<li>Aqueça as amostras a 100 °C por 5 min em um mini banho seco.</li>
		<li>Misture por vórtice e coloque as amostras no gelo.</li>
		<li>Centrifugar a 9.400 × g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Coloque as amostras brevemente no gelo antes de carregar em gel SDS-PAGE ou armazene a -20 °C a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute o SDS-PAGE usando uma célula de eletroforese com um gel de proteína pré-moldado de 4%-15% e tampão de eletroforese35.</li>
	<li>Eletrotransfera as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinida (PVDF) utilizando tampão de transferência com 0%-20% de metanol (0%-10% para proteínas superiores a 100 kDa; 20% para proteínas inferiores a 100 kDa) adicionadas imediatamente antes do uso35.</li>
	<li>Bloqueie a membrana e a sonda para fosfoproteína de interesse.<ol>
<li>Após a transferência, lave a membrana em 1x trifás-tampão (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7.6] por 5 min em uma caixa de mancha ocidental.</li>
		<li>Incubar a membrana em 5 mL de tampão de bloqueio [1x TBS, 0,1% Interpol 20, 5% c/v BSA; misturado bem e filtrado através de um filtro de seringa de 25 mm com poros de 0,2 μm usando uma seringa de 10 mL com ponta de lunte] por 1 h em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um shaker orbital. NOTA: Não use o leite como agente de bloqueio ao caracterizar fosfoproteínas, pois contém a fosfoproteína caseína, que pode causar um sinal de fundo alto e não específico.</li>
		<li>Lave a membrana três vezes por 5 min cada em TBS-T [1x TBS, 0,1% Interpol 20] em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.</li>
		<li>Incubar a membrana em 5 mL de anticorpo primário diluído no tampão de bloqueio a 4 °C durante a noite em um tubo cônico de 50 mL usando uma pá de 50 mL com um revólver de tubo. NOTA: Consulte a ficha técnica de anticorpos para obter a concentração adequada para a mancha ocidental.</li>
		<li>Lave a membrana três vezes em RT por 5 min cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.</li>
		<li>Incubar a membrana em 5 mL de peroxidase de rabanete apropriada (HRP) anticorpo secundário conjugado diluído em tampão de bloqueio por 1 h em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.</li>
		<li>Lave a membrana três vezes por 5 minutos cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.</li>
		<li>Incubar a membrana em substrato de manchas ocidentais de chemiluminescência aprimorada (ECL) ocidental [misturando volumes iguais das garrafas 1 e 2; 0,5 mL de cada para membranas grandes (8,6 cm x 6,7 cm) por 1 min, garantindo que toda a membrana esteja continuamente exposta ao substrato de manchas ocidentais da ECL.</li>
		<li>Escorra a membrana do substrato de manchas ocidentais ECL em excesso e desenvolva-se imediatamente usando um imager de quimiomina.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire a membrana e a reprovação para a proteína total de interesse.<ol>
<li>Coloque a membrana PVDF em uma bolsa transparente com revestimento de polietileno contendo 5 mL de tampão de descascamento [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6.8] com 8 μL/mL de β-mercaptoetanol adicionado imediatamente antes do uso.</li>
		<li>Incubar a 50 °C por 30 min com balanço em forno de hibridização a 11 revoluções por minuto.</li>
		<li>Lave a membrana três vezes em RT por 5 min cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.</li>
		<li>Prossiga com as etapas 5.4.2-5.4.9 descritas acima.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantitam as densidades de banda de blot ocidental usando o software ImageJ, normalizando os níveis da proteína fosfoilada de interesse para os níveis da proteína total de interesse36.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito aqui permite que os pesquisadores testem eventos críticos de sinalização dependentes de fosforilação durante o desenvolvimento craniofacial de forma robusta e reprodutível. Existem várias etapas críticas neste protocolo que garantem a coleta adequada de dados e análise dos resultados. Seja isolando fosfoproteínas de processos faciais de camundongos e/ou células de mesenquime palatal cultivadas, é imperativo mover-se de forma rápida e eficiente, mantendo todos os reagentes e materiais no gelo quando i...

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. No camundongo, esse processo começa no dia embrionário (E) 9.5 com a formação da proeminência frontonasal e pares de processos maxilares e mandibulares, cada um dos quais contém células de crista neural craniana pós-migratória. Os processos nasais laterais e mediais surgem do destaque frontonasal com o aparecimento das covas nasais e eventualmente se fundem para formar as narinas. Além disso, os processos nasais medial e processos maxilarários se fundem para gerar o lábio superior. Simultaneamente, a palatogênese é iniciada com a formação de crescimentos distintos - as prateleiras palatais secundárias - do lado oral dos processos maxilares em E11,5. Com o tempo, as prateleiras palatais crescem para baixo em ambos os lados da língua, elevam para uma posição oposta acima da língua, e eventualmente se fundem na linha média para formar um paladar contínuo que separa as cavidades nasais e orais por E16,51.
Essas alterações morfológicas ao longo do desenvolvimento craniofacial são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Por exemplo, receptores de membrana celular, como subfamílias de fator de crescimento transformador (TGF)-β receptores, incluindo receptores de proteína morfogenética óssea (BMPRs), e várias famílias receptoras de tyrosina quinase (RTK), são autofosforilados sobre ligação de ligante e ativação em células de crista neural craniana 2,3,4 . Além disso, o receptor de transmembrano acoplado à proteína G Smoothened torna-se fosforilado em células de crista neural craniana e ectoderme craniofacial a jusante do ligante de ouriço Sonic (SHH) ligado ao receptor Patched1, resultando em acúmulo de liso na membrana ciliar e ativação da via SHH5. Tais interações ligantes-receptor podem ocorrer através de sinalização autocrina, paracrina e/ou justacrina em contextos craniofaciais. Por exemplo, BMP6 é conhecido por sinalizar de forma autocririna durante a diferenciação de condrocito6, enquanto o fator de crescimento do fibroblasto (FGF) 8 é expresso no arco faringeal e se liga aos membros da família FGF de RTKs expressas no arco faringeal mesenchyme de forma paracrina para o início do padrão e crescimento do arco faringeal7, 8,9,10. Além disso, a sinalização de Entalhe é ativada em condrócitos e osteoblastos durante o desenvolvimento esquelético craniofacial através da sinalização justacririna quando os ligantes delta e/ou irregulares se ligam aos receptores de notch transmembrano em células vizinhas, que são posteriormente cortados e fosfoilados11. No entanto, existem outros pares de ligantes e receptores importantes para o desenvolvimento craniofacial que têm a flexibilidade de funcionar tanto na sinalização autocrina quanto na paracrina. Como exemplo, durante a morgênese dentária murina, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)-AA foi demonstrado para sinalizar de forma autocrina para ativar o RTK PDGFRα no epitélio do órgão de esmalte12. Em contraste, nos processos faciais murinos durante a gestação média, as transcrições que codificam os ligantes PDGF-AA e PDGF-CC são expressas no ectoderme craniofacial, enquanto o receptor PDGFRα é expresso no mesenchyme craniano-derivado, resultando em sinalização paracrina 13,14,15, 16,17 . Independentemente do mecanismo de sinalização, esses eventos de fosforilação receptora frequentemente resultam no recrutamento de proteínas adaptadoras e/ou moléculas de sinalização, que frequentemente se tornam fosforilatos para iniciar cascatas de quinase intracelular, como a via de quinase de proteína ativada por mitogênio (MAPK)18,19.
Os efeitos intracelulares terminais dessas cascatas podem então fosforilarar uma matriz de substratos, como fatores de transcrição, RNA-binding, citoskeletal e proteínas de matriz extracelular. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 e Sox926 estão entre os fatores de transcrição fosfoilados no contexto do desenvolvimento craniofacial. Essa modificação pós-translacional (PTM) pode afetar diretamente a suscetibilidade a PTMs alternativos, dimerização, estabilidade, decote e/ou afinidade de vinculação de DNA, entre outras atividades 20,21,25,26. Além disso, a proteína de ligação de RNA Srsf3 é fosfoilada no contexto do desenvolvimento craniofacial, levando à sua translocação nuclear27. Em geral, a fosforilação de proteínas de ligação de RNA tem sido demonstrada para afetar sua localização subcelular, interações proteína-proteína, ligação RNA e/ou especificidade de sequência28. Além disso, a fosforilação da actomiose pode levar a rearranjos citosqueletal em todo o desenvolvimento craniofacial29,30, e a fosforilação de proteínas da matriz extracelular, como pequenas ligatérias integrinas ligadas à N-proteína, contribui para a biomineralização durante o desenvolvimento esquelético31. Através dos exemplos acima e numerosos, é evidente que há amplas implicações para a fosforilação proteica durante o desenvolvimento craniofacial. Adicionando um nível adicional de regulação, a fosforilação proteica é ainda mais modulada por fosfattases, que neutralizam as quinases removendo grupos de fosfato.
Esses eventos de fosforilação nos níveis de receptor e molécula de efeitos são críticos para a propagação de vias de sinalização e, em última instância, resultam em mudanças na expressão genética no núcleo, conduzindo atividades celulares específicas, como migração, proliferação, sobrevivência e diferenciação, que resultam na formação adequada da face mamífera. Dada a especificidade do contexto das interações proteicas com quinases e fosfates, as mudanças resultantes nos PTMs e seus efeitos sobre a atividade celular, é fundamental que esses parâmetros sejam estudados em um cenário fisiologicamente relevante para obter uma compreensão completa da contribuição dos eventos fosforilação para o desenvolvimento craniofacial. Aqui, são fornecidos exemplos de dois contextos para estudar a fosforilação de proteínas e, assim, a ativação de vias de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilares E11,5, e células mesenquima palatinas embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5 - ambas primárias32 e imortal33 . Na E11.5, os processos maxilarianos estão em processo de fusão com os processos nasais laterais e mediais1, representando assim um ponto de tempo crítico durante o desenvolvimento craniofacial do rato. Além disso, processos maxilares e células derivadas das prateleiras palatais foram escolhidos aqui porque essas últimas estruturas são derivadas da primeira, proporcionando aos pesquisadores a oportunidade de interrogar a fosforilação proteica em ambientes vivos e in vitro em contextos relacionados. No entanto, este protocolo também é aplicável a processos faciais alternativos e pontos de tempo de desenvolvimento.
Um problema crítico no estudo de proteínas fosfoiladas é que elas são facilmente desfosforiladas durante o isolamento de proteínas por fosfattases ambientais abundantes. Para superar essa barreira, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento de proteínas fosforilaladas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de proteínas fosforilalatadas. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinos, podem ser usadas para obter maior visão sobre a dinâmica e os papéis de várias vias de sinalização ativas durante o desenvolvimento craniofacial.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td>Block para mini banho seco Research Products International Corp 400783 sistema de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>imagem ChemiDoc XRS+ com software Image Lab</td><td>Gerador de imagens de quimioluminescência</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td></tr><tr><td>incubadora de CO2, camisa de ar</td><td>VWR</td><td>10810-902</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> placa, 11 x 13 pol.</td><td>Fisher Scientific</td><td>09 002 12</td><td></td></tr><tr><td>Célula de eletroforese, 4 gels, para mini géis pré-moldados com módulo mini trans-blot</td> Forno de hibridização <td>Bio-Rad</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga UVP95003001 Fisher Scientific 5415 D com rotor F45-24-11 (Eppendorf)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z604062</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Mini banho seco Produtos de pesquisa <td></td></tr><tr><td></td><td> International Corp</td><td>400780</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>VWR</td><td>89231-662</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação para SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Panela de gelo retangular, maxi 9 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-093</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 508 microscópio estéreo com suporte K Lab, anel de luz LED</td><td>Zeiss</td><td>microscópio</td><td>de dissecação</td>4350649020000000</tr><tr><td>Timer</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>Revólver de tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11 676 341</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td>02 215 414</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VWR</td><td>89501-472</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de mata-borrão ocidental</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9358182</td><td></td></tr><tr><td> Materiais</forte>Placas de</td> cultura de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>células, 6 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células, 12 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>Elevadores de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos, polipropileno, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinça fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Colher de embriões</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89000-010</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Pasteur, 5,75"</td><td>Fisher Pipeta Pasteur Scientific</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>, 9"</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas, transparente, forro de polietileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-25B</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Fisher Pinça Científica</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Semken</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Pequena lâmpada de látex, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa, 25 mm, 0.2 &mu; m tamanho do poro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-108</td><td></td></tr><tr><td>Seringa com ponta luer, 10 mL</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Alavanca de abertura de Western blot</td><td>Bio-Rad</td><td>4560000</td><td></td></tr><tr><td>Papel de cromatografia Whatmann 3MM chr</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td> Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-15% Géis de proteína pré-moldados, 10 poços, 30 &micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato sal dissódico hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5422-25G</td><td>concentração de estoque 1 M</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, fração V, testada contra choque térmico Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>AC403140050</tr><tr><td>Coquetel completo de inibidor de mini protease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836153001</td><td>concentração estoque 25x</td></tr><tr><td>kit de ensaio de proteína DC II</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glicose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>E7, anticorpo primário monoclonal de beta tubulina de camundongo, concentrado 0,1 mL</td><td>Estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Substrato de western blotting ECL</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI32106</td><td>baixa faixa de picograma</td></tr><tr><td>Substrato de western blotting ECL</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-302B</td><td>baixa faixa de femtograma</td></tr><tr><td>Tampão de eletroforese, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>concentração de estoque 10x</td></tr><tr><td>Etanol, 200 provas, 1 galão</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2705HC</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético, Di Na sal di-hidratado. (powd. cristalino/eletrophor.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, caracterizado, origem americana, 500 mL</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (certificado ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com HRP, cabra anti-camundongo IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>115-035-146</td><td>1:20.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com HRP, cabra anti-coelho IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-003</td><td>1:20.000</td></tr><tr><td>Solução de ácido clorídrico, 6N (certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA56-500</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Igepal Ca - 630 detergente não iônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19859650</td><td>Nonidet P-40</td></tr><tr><td>Isopropanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>concentração de estoque 200 mM</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primário</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9102S</td><td>1:1.000; anti-Erk1/2</td></tr><tr><td>PDGF-BB ligante recombinante, rato</td><td>Fisher Scientific</td><td>520BB050</td><td></td></tr><tr><td>Receptor PDGF &beta; anticorpo primário</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>3169S</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>concentração estoque 100 U/mL, 100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de fluoreto de fenilmetanossulfonil, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740100</td><td>PMSF; concentração de estoque 100</td></tr><tr><td>mM Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primário</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9101S</td><td>1:1.000, anti-fosfo-Erk1/2</td></tr><tr><td>Receptor de Fosfo-PDGF &alfa; /Receptor de PDGF &beta; anticorpo primário</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>3170S</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (cristais brancos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico (cristais brancos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>SDS solução, 10%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (cristalino/biológico, certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio (pó/ACS certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S299-100</td><td>NaF; alíquota para uso único; concentração de estoque 1 M</td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205330500</td><td>Na3VO4; concentração de estoque 100 mM</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico anidro (granular ou em pó/ACS certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Cultura de tecidos PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de transferência, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td>concentração de estoque 10x</td></tr><tr><td>base Tris (cristais brancos ou pó cristalino/biologia molecular)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>BioWorld</td><td>21560033</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Western blot marcador de peso molecular</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fêmeas camundongos</td><td></td> <td>129S4</td><td>presente do Dr. Philippe Soriano, Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai</td></tr></tbody></table>

isolamento de lysatos de proteína celular inteira de processos faciais de camundongos e células de mesenchyme palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. Essas alterações morfológicas são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Aqui, são fornecidos dois exemplos de contextos fisiologicamente relevantes para estudar a fosforilação de proteínas durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilarres E11,5, e células de mesenquime palatina palatina embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5. Para superar a barreira comum da desfosforilação durante o isolamento de proteínas, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento das fosfoproteínas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de fosfoproteínas após a mancha ocidental de lises de proteínas celulares inteiras. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinas, podem ser usadas para obter maior percepção sobre a dinâmica e os papéis de várias fosfoproteínas ativas durante o desenvolvimento craniofacial.

Ao tentar caracterizar a fosforilação de proteínas isoladas dos processos faciais do camundongo e/ou células de mesenquima palatal cultivadas, os resultados representativos revelarão idealmente uma faixa distinta e reprodutível após a mancha ocidental com um anticorpo antifosfoproteína que corre na altura ou perto da altura da faixa de proteína total correspondente (Figura 3 ). No entanto, se ocorrer uma fosforilação extensiva da proteína, pode haver uma ligeira mudança ascendente da banda d...

O protocolo apresenta um método para isolar os lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de embriões de camundongos dissecados ou células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas e realizar posteriormente manchas ocidentais para avaliar os níveis de proteína fosfoilada.

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Este protocolo pode ser usado para obter maior visão sobre a dinâmica e os papéis das fosfoproteínas ativas durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos. Este protocolo supera a barreira comum da desfosforilação durante o isolamento de proteínas a partir de dois contextos fisiologicamente relevantes, processos faciais do rato e células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas. É imperativo mover-se rapidamente mantendo todos os reagentes e materiais no gelo e usar inibidores de fosfatase em todos os tampões de lise para manter a integridade das proteínas fosfoiladas.Para começar, coloque o corpo do rato em uma placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima, e pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol. Em seguida, abra a cavidade abdominal beliscando e levantando a pele antes da abertura vaginal com fórceps semken retos. Em seguida, corte a pele levantada em camadas subjacentes com tesoura cirúrgica de lâmina reta em um ângulo de 45 graus em ambos os lados para gerar uma forma em V que se estenda a cada superfície lateral aproximadamente no meio do caminho entre os quatro membros e membros traseiros.Usando as fórceps Semken, segure um dos chifres uterinos e corte abaixo do oviduto e acima do colo do útero com uma tesoura cirúrgica. Para permitir a remoção completa do chifre uterino, corte o mesometrium, em seguida, transfira o chifre uterino dissecado para 10 mililitros de histologia PBS em uma placa de Petri de 10 centímetros. Da mesma forma, remova o segundo chifre uterino no lado oposto da cavidade abdominal.Depois, coloque a placa de Petri de 10 centímetros contendo ambos os chifres uterinos no gelo. Sob um microscópio estéreo dissecado, disseca cuidadosamente cada embrião dos chifres uterinos com 5 fórceps finos de Dumont. Em seguida, lentamente afastar o miométrio, decidirua, e chorão.Em seguida, rasgue e remova o amnion relativamente transparente ao redor do embrião e corte o cordão umbilical que liga o embrião à placenta. Em seguida, transfira cada embrião dissecado para 2,5 mililitros de histologia PBS em um poço individual de uma placa de cultura celular de 12 poços no gelo usando uma tubulação de transferência de plástico cortada. Prepare três pratos petri de 10 centímetros contendo 10 mililitros de histologia PBS e mantenha-os no gelo para serem usados em rotação entre embriões.Em seguida, transfira um embrião de um poço individual da placa de cultura celular de 12 poços para uma das placas de Petri de 10 centímetros com histologia PBS no gelo usando uma pipeta de transferência de plástico cortada. Sob o microscópio dissecador, separe cada processo maxilar da face usando as fórceps finas, primeiro fazendo um corte no lado anterior de um processo maxilar ao longo do recuo natural que separa o processo nasal lateral no processo maxilar. Em seguida, corte o lado posterior do processo maxilar ao longo da recuo natural que separa o processo maxilar e o processo mandibular.Em seguida, separe completamente o processo maxilar fazendo um corte vertical dos lados anteriores para posteriores do processo maxilar no lado dos olhos do processo maxilar onde as recuos naturais referenciadas acima da extremidade. Usando uma pipeta Pasteur de nove polegadas com uma pequena lâmpada de látex de dois mililitros, transfira o par dissecado de processos maxilares em uma pequena gota de aproximadamente 30 microliters de histologia PBS para uma placa de Petri de 35 milímetros rotulada no gelo. Em seguida, transfira o par de tecidos de processo maxilar para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado no gelo usando a pipeta Pasteur, minimizando a transferência de PBS histologia.Além disso, remova qualquer excesso de histologia PBS no tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com a pipeta Pasteur. Adicione 0,1 mililitro de tampão de lise NP40 gelado com inibidores de protease e fosfatase adicionados imediatamente antes do uso no gelo. Em seguida, pipeta para cima e para baixo 10 vezes com um PIPETMAN de 200 microliter.Em seguida, vórtice por 10 segundos, e depois pipeta para cima e para baixo 10 vezes com um PIPETMAN de 200 microliter, evitando a geração de bolhas. Incubar a quatro graus Celsius por duas horas enquanto gira de ponta a ponta usando uma raquete de 1,5 mililitro ou dois mililitros com um revólver de tubo. Em seguida, centrifufique as amostras a 13.500 x g por 20 minutos a quatro graus Celsius e colete o supernascer a um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro no gelo com um PIPETMAN de 200 mililitros.Primeiro, aspire o meio das células de mesenquime palatal embrionárias do camundongo usando uma pipeta Pasteur de 5,75 polegadas anexada a um sistema de vácuo. Em seguida, lave as células duas vezes com a cultura do tecido gelado PBS e incline a placa para o lado durante a última lavagem para garantir que toda a cultura do tecido PBS seja aspirada. Em seguida, adicione o tampão de lise NP40 gelado com inibidores de protease e fosfatase adicionados imediatamente antes do uso no gelo para lise as células.Incubar a placa no gelo por cinco minutos com rotação aproximadamente a cada minuto para garantir a cobertura completa da placa. Em seguida, raspe as células da placa usando um levantador de células pré-resfriado, e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro no gelo. Depois, incubar a suspensão celular a quatro graus Celsius por 30 minutos enquanto gira de ponta a ponta usando uma pá de 1,5 mililitro ou dois mililitros com um revólver de tubo.Em seguida, centrifufique as amostras a 13.500 x g por 20 minutos a quatro graus Celsius e colete o supernascer a um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro no gelo com um PIPETMAN de 200 mililitros. A análise de manchas ocidentais de lises celulares inteiras de células mesenquimos palatinas embrionárias de camundongos imortalizados após a estimulação com ligante PDFG-B de 2 a 15 minutos revelou bandas distintas reprodutíveis para fosfoproteínas que funcionam na altura ou perto da faixa proteica total correspondente. Observou-se aumento nas intensidades da banda de fosfoproteína após o tratamento com um fator de crescimento comparado com as de células não tratadas, enquanto as intensidades totais de banda proteica foram relativamente iguais entre as amostras.Este protocolo pode ser usado para sondar como perturbações e fosforilação influenciam diretamente a sinalização intercelular, expressão genética e atividade celular em contextos craniofaciais.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O vídeo demonstra a análise do estado de palmitoilação de proteínas da membrana celular isoladas do tecido cerebral de camundongos. O processo envolve expor as cisteínas não palmitoiladas e bloqueá-las, usando um polímero que se liga às cisteínas palmitoiladas, auxiliando na avaliação do estado de palmitoilação das proteínas isoladas.

Avaliando o estado de palmitoilação de proteínas da membrana celular do tecido cerebral de camundongos

Um protocolo para a separação da ectoderme embrionária facial e mesênquima é descrito. Usamos Dispase II para tratar embriões inteiros primeiro, dissecar todo proeminências faciais, e então separar o ectoderma facial e mesênquima.

Separação de Ectoderma embrionárias de camundongos Facial e mesênquima

A análise proteômica de qualquer tipo de célula é altamente dependente da pureza e do pré-fracionamento do material de partida, a fim de descomplexificar a amostra antes da espectrometria de massa (MS) por cromatografia líquida. Usando técnicas de retrolavagem, espermatozóides puros podem ser obtidos de roedores. Após a digestão, os fosfopeptídeos podem ser enriquecidos com TiO2.

Fosfopéptido Análise de Rodent epidídimo Espermatozóides

A análise da expressão de proteínas em válvulas embrionárias jovens de camundongos foi dificultada pelo tecido limitado disponível. Este manuscrito fornece um protocolo para preparar proteínas a partir de regiões de válvulas embrionárias de camundongos em desenvolvimento para análise de western blot.

Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

Neste método, apresentamos procedimentos bioquímicos para isolamento rápido e eficiente de proteínas de filamento intermediário (IF) a partir de tecidos de múltiplos ratos. IFs isoladas podem ser usadas para estudar mudanças em modificações pós-translacionais por espectrometria de massa e outros ensaios bioquímicos.

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

Apresentamos um protocolo de isolamento e cultura de células mesenquimais palatinas embrionárias primárias para imagens de lapso de tempo de crescimento bidimensional (2D) e ensaios de reparação de feridas. Também fornecemos a metodologia para análise dos dados de imagem de lapso de tempo para determinar a formação de fluxo celular e a motilidade direcional.

Isolamento e imagem de lapso de tempo das células mesenquima palatinas embrionárias do camundongo primário para analisar atributos de movimento coletivo

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura dos queratinócitos orais derivados do paladar do rato adulto. Um método de avaliação utilizando imunostaining também é relatado.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Aqui, apresentamos um protocolo para o enriquecimento de fosfatrofames fosfoproteínas e suas proteínas interativas a partir de células e tecidos e sua identificação e quantificação por proteômica baseada em espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em espectrometria de massa para identificar fosfofamina fosfates e seus interacttores

Aprenda a isolar lisados de proteína celular inteira de processos faciais de camundongos e células de mesenquima palatal para análise de fosfoproteínas em desenvolvimento craniofacial.

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

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