Name: Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a medir taxas de rotatividade de proteínas em células senescentes usando rotulagem metabólica SILAC e espectrometria de massa. Este método permite calcular meias-vidas proteicas de alta vazão.

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Este trabalho contou com o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e do Programa de Pesquisa Intramuros (IRP), Instituto Nacional do Envelhecimento (NIA). N.B. foi apoiado pelo Longevity Impetus Grants, e pelo Programa de Estudiosos do Office of Dietry Supplements (ODS). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Os autores não têm revelações.

pSILAC é uma técnica poderosa que permite a quantificação global das taxas de rotatividade de proteínas em múltiplas condições celulares. Este artigo detalha o uso do pSILAC para comparar meias-vidas globais de proteína entre células senescentes e quiescentes, incluindo instruções para a preparação de células senescentes e quiescentes, rotulagem e colheita de SILAC e, finalmente, análise usando espectrometria de massa DDA. Além disso, um teste de duas etapas é descrito para validação do fenótipo de senescência usando análise SA-βGal e RT-qPCR de um painel de mRNAs codificando proteínas associadas à senescência. Além da validação da senescência com as duas abordagens descritas, uma terceira validação da senescência pode ser realizada após a análise de espectrometria de massa, buscando alterações nos marcadores de senescência conhecidos entre células senescentes e quiescentes no nível proteômico. As proteínas associadas à senescência que devem ser elevadas incluem p16, p21 e BCL2, entre outras, descritas em outroslugares 44,45. No protocolo descrito acima, a radiação ionizante foi utilizada para a indução da senescência e da fome de soro para células quiescentes. Para a indução da senescência, há múltiplas opções disponíveis e há heterogeneidade substancial entre elas 41,42,46. Atualmente, não há um método senescente que seja considerado o "mais fisiológico", por isso a escolha do indutor senescente é em grande parte baseada no contexto do experimento. No entanto, experimentos com o objetivo de afirmar um fenômeno geral sobre senescência são recomendados para usar pelo menos dois indutores senescentes diferentes. Discutir a gama de paradigmas de senescência está além do escopo deste artigo, mas alguns métodos comuns para induzir senescência incluem desencadear danos ao DNA (IR, doxorubicina, exaustão replicativa), expressar proteínas oncogênicas (HRAS, BRAF) e interromper a função mitocôndria2.
Além da escolha do indutor senescente, a escolha das células de controle é uma consideração igualmente importante. As células senescentes estão, por definição, sob prisão por crescimento indefinido, por isso uma comparação com outras células presas ao crescimento são frequentemente escolhidas. Para pSILAC, as células presas do ciclo celular são geralmente preferíveis porque não se replicam e, portanto, são mais fáceis de usar para cálculos de meia-vidaproteica 47. No entanto, uma vez que as células cultivadas muitas vezes retêm algumas células divisórias, é importante que os métodos usados para induzir a prisão do ciclo celular produzam uma resposta tão homogênea quanto possível para minimizar o erro das células que ainda estão se proliferando. Para calcular as taxas de degradação proteica para células ciclísticas usando pSILAC requer cálculos adicionais para compensar a taxa em que a proteína é diluída em célulasfilhas 27. No entanto, a prisão por crescimento quiescente em si não é sem complicações. Existem dois métodos gerais de parada do ciclo celular: privação de soro e inibição de contato48. Nem todas as células podem ser quiescentes através da inibição de contato, embora alguns fibroblastos tenham sido mostrados para demonstrar quiescência após vários dias de cultivo49. Este método usou a privação de soro porque é mais comumente usado para comparações de células senescentes, embora exija que a célula senescente seja igualmente privada de soro para comparações precisas. O soro ativa o complexo mTOR e, portanto, a privação de soro tem vários efeitos a jusante na célula, além da prisão do ciclocelular 50. Notavelmente, as células senescentes têm sido mostradas para exibir um SASP reduzido após a privação de soro ou inibição mTOR51,52.
Outro ponto importante a considerar no pSILAC é quantos pontos de tempo para testar. Este protocolo coletou células em um único ponto de tempo (3 dias de rotulagem leve ou pesada), o que simplifica substancialmente a análise resultante. A escolha do ponto de tempo deve base no objetivo do experimento. Para análise global, espera-se que 3 dias capturem a maioria das proteínas, embora meias vidas para proteínas de curta duração que tenham um volume de negócios total dentro de 3 dias (todo o sinal de luz é perdido) não podem ser medidos neste momento. Por outro lado, proteínas de longa duração com muito pouca rotatividade em 3 dias também são difíceis de quantificar e muitas vezes aparecem como tendo meias-vidas extremamente grandes (na ordem das semanas) que são tipicamente apenas uma consequência de muito pouco acúmulo de sinal pesado. Devido à relação não linear na proporção de sinais de peptídeos pesados e leves versus a porcentagem de proteína recém-sintetizada em pontos de tempo mais curtos e longos, a quantificação de meias vidas poderia ser melhorada adicionando pontos de tempo adicionais de rotulagem. Para comparações relativas entre dois estados celulares, como neste protocolo, uma meia-vida aproximada pode ser suficiente, mas pontos de tempo adicionais podem ser usados para melhorar a precisão quantitativa.
Este protocolo descreve como realizar uma análise não-alvo baseada em DDA sobre o volume de negócios de proteínas. No entanto, os cálculos de rotatividade de proteínas podem ser aplicados geralmente a qualquer esquema de aquisição que seja capaz de derivar a abundância relativa de pares de peptídeos pesados e leves. Por exemplo, métodos baseados em MS2, como a aquisição independente de dados (DIA/SWATH), também podem ser aplicados para o cálculo das taxas de rotatividade com sucesso53. Além disso, os pipelines de instrumentação e software diferentes dos descritos neste protocolo podem ser usados para realizar análises de DDA, identificação de proteínas e quantificação de proteínas. Ao usar plataformas de software de quantificação de proteínas, como o Skyline, para extrair áreas de pico de peptídeos, é aconselhável inspecionar manualmente cromatogramas de íons extraídos no espaço de trabalho do documento, identificar picos que foram erroneamente integrados e não quantitativos e fazer a curadoria do documento de acordo. Uma extensa coleção de tutoriais está disponível online para Skyline (skyline.ms).
pSILAC representa um dos métodos mais ideais para quantificação global de meias-vidas proteicas em células cultivadas devido ao multiplexing superior (cobertura proteome) e throughput. Embora o pSILAC não forneça taxas diretas de síntese ou degradação, uma vez que a mudança no sinal leve e pesado é devido a uma confluência de fatores, o pSILAC é altamente útil para comparações entre condições e diferentes tipos de células. Os métodos de baixa produtividade geralmente caem em dois tipos: 1) tratamento de células com ciclohiteximida para bloquear a síntese proteica e colheita em intervalos de tempo após a adição à decadência monitor, ou 2) tratamento de células com um inibidor de decadência proteica e colheita em intervalos de tempo após a adição para monitorar o acúmulo de proteínas, inferindo assim as taxas de decomposição proteica. A limitação de ambos os métodos é que tais tratamentos inevitavelmente causarão mudanças substanciais na fisiologia celular. Em contraste, o pSILAC não requer nenhuma intervenção substancial e teoricamente não tem efeitos detectáveis na fisiologia celular, uma vez que os aminoácidos isotópicos diferem por apenas um único nêutron de suas contrapartes não isotópicas. Assim, o método aqui descrito para pSILAC representa um protocolo simples para a medição global da proteína mais fisiológica meia-vidas em células não-divisórias.
Alterações na rotatividade de proteínas têm uma relação próxima com o envelhecimento, doenças relacionadas à idade, neurodegeneração e longevidade54,55. Este protocolo descreve um método para interrogar essas relações usando isótopos estáveis rotulando aminoácidos na cultura celular para medir as taxas de rotatividade de proteínas em células de senescência. No entanto, existem inúmeros métodos análogos para a realização de estudos no contexto do envelhecimento e da neurodegeneração in vivo em organismos inteiros, como camundongos. De fato, esses estudos enfatizaram a importância de medir as taxas de rotatividade de proteínas no contexto de doenças relacionadas à idade 56,57,58,59.
Neste estudo, as proteínas ribossômicas e proteínas residentes no ânticulo endoplasmático destacaram-se como duas categorias de proteínas com diminuição e aumento de meias-vidas em células senescentes, respectivamente. Embora uma análise mais aprofundada dos níveis de estado estável seja necessária para conclusões definitivas, esses resultados sugerem ainda que as células senescentes podem regular exclusivamente a tradução através da diminuição da meia-vida das proteínas ribossômicas. Daqui para frente, aplicar abordagens estáveis de rotulagem de isótopos para estudar a relação entre senescência celular e neurodegeneração in vivo em modelos de camundongos será uma extensão promissora da abordagem de rotulagem de isótopos descrita por este protocolo.

A senescência foi identificada pela primeira vez como um estado de prisão por crescimento indefinido exibida por células primárias cultivadas após atingir a exaustão replicativa1. Desde então, foi demonstrado que a senescência pode surgir em resposta a numerosos insultos celulares, incluindo tensões genotoxilicas, mitocondriais e oncogênicas, entre outros2. Embora a senescência tenha vários papéis fisiologicamente importantes, como supressão de tumor e cicatrização de feridas, o acúmulo de células senescentes durante o envelhecimento está associado a uma série de efeitos deletérios na saúde3, incluindo várias condições neurodegenerativas 4,5,6. A senescência celular ocorre em múltiplos tipos de células cerebrais, incluindo neurônios 7,8,9,10, astrócitos11, microglia 12 e precursores do oligodendrocyte13, e contribui para neurodegeneração e disfunção cognitiva. Os oligômeros beta amiloides, uma das marcas da doença de Alzheimer14, têm sido mostrados para acelerar a senescência neuronal 13,15,16. Um aumento da prevalência de células senescentes também tem sido associado à doença de Parkinson17, especialmente decorrente de estressores ambientais11,18. É importante ressaltar que a eliminação seletiva de células senescentes em modelos pré-clínicos prolonga a vida útil e mitiga uma infinidade de doenças relacionadas à idade 3,5,12 e melhora os déficits cognitivos 8,11,12,13. As células senescentes emergiram, portanto, como alvos terapêuticos promissores para o tratamento de muitas condições relacionadas à idade.
Grande parte do efeito prejudicial das células senescentes é causada pelo fenótipo secreto associado à senescência (SASP), uma mistura complexa de moléculas bioativas secretadas por células senescentes que podem causar inflamação local, angiogênese, destruição da matriz extracelular e propagação da senescência no tecido circundante 19,20,21 . O SASP também representa um interessante fenômeno biológico de senescência porque requer um considerável esforço transcricional e translacional durante um estado de prisão do ciclo celular. De fato, as células senescentes têm mostrado uma diminuição na biogêneseribosa 22,23,24 que deve reduzir a síntese proteica. Em vez disso, as células senescentes traduzem robustamente algumas proteínas, particularmente fatores SASP, e influenciam o metabolismo do tecido circundante25. Assim, há um interesse considerável em entender como as células senescentes submetidas a uma parada permanente do ciclo celular continuam a manter a homeostase proteica e, ao mesmo tempo, expressam robustamente os fatores SASP e outras proteínas selecionadas.
Este método descreve como usar espectrometria de massa e rotulagem de isótopos pulsados-estáveis por aminoácidos na cultura celular (pSILAC) para medir globalmente as meias-vidas de proteínas em células senescentes em uma escala proteome-em toda a escala. No SILAC tradicional, as células cultivadas são completamente metabolicamente rotuladas com isótopos pesados e leves não radioativos de aminoácidos para análise a jusante da abundância de proteínas. Este método foi previamente aplicado para avaliar as mudanças de abundância de forma abrangente e quantitativa no SASP dos fibroblastos cultivados26. No pSILAC, as células são metabolicamente rotuladas com um pulso de isótopo pesado que segue a pré-rotulagem com isótopo leve, e depois colhidas em intervalos de tempo ou mais. As taxas de incorporação de isótopos pesados em referência ao isótopo leve pré-existente são então utilizadas para calcular taxas relativas de rotatividade de proteínas. Geralmente, isótopos de arginina e liseina são usados porque a trypsin se corta nesses resíduos; assim, todos os peptídeos da digestão padrão conterão potencialmente o rótulo pesado. Pares de peptídeos que diferem apenas pela presença ou ausência de lisetopesina ou arginina são quimicamente idênticos e podem ser diferenciados e quantificados por um espectrômetro de massa. Após a análise da espectrometria de massa, os peptídeos podem ser identificados como recém-sintetizados ou pré-existentes com base na presença ou ausência do rótulo isotópico nas identificações de peptídeos resultantes. As taxas de rotatividade de proteínas podem então ser determinadas montagem da razão de peptídeos leves (13 C-15 N)para uma determinada proteína a modelos cinéticos para crescimento exponencial ou decadência27,28. o pSILAC tem sido usado em várias comparações das taxas de rotatividade de proteínas 29,30,31,32 e é atualmente o método mais abrangente e de alto rendimento para a medição de meias-vidas proteicas.
Este protocolo detalha a preparação de células senescentes em paralelo com células quiescentes presas em crescimento semelhante na cultura, seguidas pela rotulagem metabólica com pSILAC. As células são então colhidas, homogeneizadas em lises e processadas para aquisição e análise de espectrometria de massa. Os dados obtidos a partir da espectrometria de massa são então usados para determinar meias-vidas proteicas usando um método quantitativo simplificado empregando um único ponto de tempo e cálculos de meia-vida realizados em uma planilha. Usando essa abordagem, as estimativas de meia-vida proteica podem ser medidas de forma abrangente e quantitativa que seja mais autêntica às condições celulares não perturbadas do que protocolos que usam bloqueadores de síntese proteica ou rotatividade.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrila (grau LC-MS)</td><td>Grainger</td><td>AH015</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreotol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>12430112</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, certificado, inativado pelo calor</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Fórmico</td><td>Sigma</td><td>27001</td><td></td></tr><tr><td>Gammacel 40 Exactor</td><td>Melhor Irradiador de Césio Theratronics</td><td></td><td>para células</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos pulmonares primários IMR-90 sensíveis à</td> luz <td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td></td></tr><tr><td>iRT Kit (tempo de retenção indexado)</td><td>Biognosys</td><td>Ki-3002-2</td><td>Tempo de retenção indexado Padrões de peptídeos</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>ThermoFisher</td><td>423835000</td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>Matrix Science</td><td>Mascot Daemon 2.8</td><td>Software de busca de banco de dados proteômico</td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nano LC System</td><td>ThermoFisher</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Extração em Fase Sólida Cartirdges</td><td>Águas</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de Massa Orbitrap</td><td>ThermoFisher</td><td>Q Exactive HF Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), EDTA 100 mM, pH 8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>327110025</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (tripsina) -DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A33972</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Sistema de PCR em tempo real</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Random Hexamer Primer</td><td>ThermoFisher</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Senescência &beta;-Kit de Coloração de Galactosidase</td><td>Sinalização Celular</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td><td>University of Washington</td><td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td><td>Software proteômico qantiativo gratuito e de código aberto. Disponível em www.skyline.ms</td></tr><tr><td>Sonicator Branson</td><td></td><td>CPX-952-516R</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>Referido como fenol no texto; perigoso</td></tr><tr><td>TRYPle Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (grau de sequenciamento)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnase (2U / uL)</td> <td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr>Água <td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td></td>da <td>ureia</td></tr><tr><td>(categoria LC-MS)</td><td>Grainger</td><td>AH365</td><td></td></tr></tbody></table>

medição das taxas de rotatividade de proteínas em células cultivadas senescentes e não-divisórias com rotulagem metabólica e espectrometria de massa

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Evidências crescentes mostraram que o acúmulo de células senescentes no sistema nervoso central contribui para distúrbios neurodegenerativos como Alzheimer e Doenças de Parkinson. Senescência celular é um estado de prisão permanente do ciclo celular que normalmente ocorre em resposta à exposição a estresses sub-letais. No entanto, como outras células não-divisórias, as células senescentes permanecem metabolicamente ativas e realizam muitas funções que requerem demandas transcricionais e translacionais únicas e mudanças generalizadas nos proteomes intracelulares e secretados. Entender como as taxas de síntese e decadência das proteínas mudam durante a senescência pode iluminar os mecanismos subjacentes da senescência celular e encontrar potenciais caminhos terapêuticos para doenças exacerbadas por células senescentes. Este artigo descreve um método para avaliação em escala proteome de meia-vidas proteoma em células não-divisórias usando rotulagem de isótopos estáveis pulsados por aminoácidos na cultura celular (pSILAC) em combinação com espectrometria de massa. pSILAC envolve rotulagem metabólica de células com versões de isótopos pesados estáveis contendo aminoácidos. Juntamente com as abordagens modernas de espectrometria de massa, o pSILAC permite a medição do volume de negócios proteicos de centenas ou milhares de proteínas em misturas complexas. Após a rotulagem metabólica, a dinâmica de volume de negócios das proteínas pode ser determinada com base no enriquecimento relativo de isótopos pesados em peptídeos detectados pela espectrometria de massa. Neste protocolo, um fluxo de trabalho é descrito para a geração de culturas de fibroblastos senescentes e fibroblastos quiescentes da mesma forma presos, bem como um ponto simplificado, um único ponto de rotulagem de tempo-curso que maximiza a cobertura das taxas de rotatividade de proteínas previstas. Além disso, é apresentado um pipeline para análise dos dados de espectrometria de massa do pSILAC e cálculo fácil de usar das taxas de degradação de proteínas usando planilhas. A aplicação deste protocolo pode ser estendida além das células senescentes para quaisquer células cultivadas não-divisórias, como neurônios.

Este protocolo descreve um método para comparar globalmente meias-vidas proteicas entre células de controle senescentes e não-divisórias usando pSILAC e pontos de tempo mínimos. Este protocolo detalha a geração de células senescentes e quiescentes na cultura, rotulagem metabólica de células com isótopos estáveis de arginina e lise ao longo de 3 dias, quantificando as abundâncias relativas de isótopos de peptídeos pesados e leves por espectrometria de massa, e um cálculo simples e acessível de meias-vidas proteicas usando fórmulas (Figura 1). Este método é altamente flexível e pode ser adaptado a inúmeros tipos e condições celulares.
Como parte da geração de células senescentes para este protocolo, dois métodos de validação de senescência são utilizados: células SA-βGal-positivas visualizadas por microscopia e níveis aumentados de marcadores senescentes quantificados através da análise RT-qPCR. A medição dos marcadores senescentes deve produzir distinções claras entre células quiescentes e senescentes para comparações das populações das duas células a serem consideradas válidas. Para a atividade SA-βGal, as células senescentes devem parecer azuis, enquanto as células de controle quiescentes não têm ou muito pouca cor (Figura 2A). Este ensaio pode ser quantificado contando as células positivas e manchadas de azul como uma porcentagem do número total de células e, em seguida, comparando a taxa de positividade percentual entre o controle quiescente e as células senescentes. É importante que este protocolo seja realizado ao mesmo tempo para a comparação de ambos os estados celulares; A atividade SA-βGal baseia-se no pH da solução de coloração, de modo que os resultados podem variar substancialmente entre os ensaios e devem ser considerados uma medida qualitativa.
A análise RT-qPCR dos marcadores senescentes mostrará altos níveis dos mRNAs codificando fatores SASP (IL6, CXCL8, IL1B) e os inibidores do ciclo celular (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) na maioria dos modelos senescentes. Embora alguma variação seja esperada com base no tipo celular, condição de cultura e indutor senescente41,42, a maioria das células senescentes apresentam níveis cinco vezes maiores de IL6, CXCL8 e CDKN1A/p21 mRNAs em comparação com células de controle quiescentes; por outro lado, os níveis de LMNB1 e PCNA mRNAs, marcadores de proliferação de codificação, devem ser baixos ou ausentes em células senescentes em comparação com células quiescentes (Figura 2B). Juntos, uma porcentagem significativa da positividade SA-βGal e a expressão esperada de um painel de marcadores mRNA associados à senescência são suficientes para confirmar a indução da senescência em um experimento.
O processamento de amostras de proteína para análise de espectrometria de massa consiste em digestão em solução (2 dias) e extração em fase sólida (4-6 h). Para realizar análises proteômicas não-marcadas, os peptídeos resultantes são submetidos à análise LC-MS/MS por meio de aquisição dependente de dados (DDA). Nos instrumentos Orbitrap, um método DDA pode ser especificado no editor do método de software de instrumento de espectrometria de massa. As configurações do espectrômetro de massa utilizadas neste estudo são mostradas na Figura 3A. As configurações de cromatografia líquida também podem ser especificadas dentro do editor do método. Para este estudo, utilizou-se um gradiente linear de 90 minutos com fase orgânica crescente (acetonitrila) (Figura 3B). Após uma aquisição bem sucedida, a corrente de íon total (TIC) deve conter um sinal intenso durante a porção linear de gradiente do método (Figura 3C). Este protocolo descreve um protocolo de exemplo em um instrumento Orbitrap, mas o cálculo de meias-vidas proteicas pode ser realizado em dados obtidos a partir de qualquer espectrômetro de massa que foi coletado no modo DDA, que está disponível em vários tipos de instrumentos (por exemplo, Orbitraps e instrumentos de tempo de voo) e fornecedores. As configurações de aquisição serão exclusivas do tipo e configuração do instrumento utilizado, e recomenda-se usar as configurações sugeridas pela instalação de espectrometria de massa. Este método também é compatível com métodos não-DDA (SRM, PRM, DIA), desde que áreas quantitativas de pico cromatográficos para picos pesados e leves possam ser extraídas dos arquivos de dados brutos e inseridas nas fórmulas de planilha.
Os arquivos de espectrometria de massa bruta são pesquisados com uma das muitas ferramentas de pesquisa de banco de dados proteômicos disponíveis para identificar peptídeos e proteínas. Por exemplo, este estudo utilizou o mecanismo de busca Mascot43. Para obter áreas de pico cromatográficas para quantificação de peptídeos pesados e leves, os resultados de pesquisa de banco de dados são importados para um software proteômico capaz de áreas de pico cromatográficas, como o Skyline39,40. O exame dos cromatógrafos de íons extraídos dos peptídeos (Figura 4) revelará a proporção relativa de sinais de peptídeos pesados e leves. Uma menor proporção de sinal de peptídeo pesado em relação ao sinal de peptídeo leve em células senescentes indica uma taxa de rotatividade de proteínas mais lenta (Figura 4A), e um sinal de peptídeo pesado mais alto em relação à luz indica uma taxa de rotatividade de proteínas mais rápida (Figura 4B). As amostras não rotuladas devem mostrar pouco ou nenhum sinal de peptídeo pesado. Qualquer sinal aparente de peptídeo pesado nas amostras não rotuladas é considerado ruído de fundo e será subtraído durante os cálculos finais. A quantificação de áreas de pico cromatográficos para peptídeos leves e pesados para todas as condições de tratamento e rotulagem deve ser exportada para o cálculo subsequente das taxas de rotatividade de proteínas e análise estatística.
Usando a análise de ponto único, a quantificação de meias-vidas proteicas é simples de realizar e pode ser feita convenientemente em planilhas. Na Tabela 3, foram calculadas as meias-vidas para 695 proteínas identificadas a partir da análise de espectrometria de massa. A partir de abundâncias de isótopos pesados e leves em nível de proteína para cada proteína nas amostras (entrada para a folha de dados brutos 1 ), um isótopo por cento pesado (chamado de Razão, R) é então calculado automaticamente na folha intitulada 2) Razão H | H + L. Nesta etapa, o R de amostras rotuladas pesadas é normalizado subtraindo o R de amostras não rotuladas para produzir um R final para os triplicados quiescentes e senescentes. Uma vez que amostras não rotuladas não devem ter nenhum isótopo exogenously adicionado, eles são usados para eliminar o sinal de fundo. A partir de R, o kdeg (taxa de rotatividade) é calculado usando a seguinte fórmula:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
A meia-vida (H, em dias) é determinada para cada proteína no controle quiescente e triplicados senescentes (folha intitulada 3) Half-Life (dias)) usando a seguinte fórmula:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Essas meias-vidas são então mediadas entre os triplicados quiescentes e senescentes para gerar uma meia-vida quiescente e senescente para cada proteína, bem como um valor p. Meias-vidas calculadas são então filtradas para valores negativos, o que ocorre quando o sinal pesado de células de rotulagem leve (o fundo) é maior do que o sinal pesado de células de rotulagem pesada. Esta filtragem resultou em 707 proteínas de 841 identificadas com meias-vidas válidas para os resultados aqui apresentados.
A meia-vida é então relatada como uma proporção de log2 de senescente sobre células de controle quiescente (log2FC) e plotada em um enredo de vulcão (Figura 5). Por exemplo, olhando para a folha de análise 5) a proteína do receptor de trombina coagulação II (F2R) pode ser vista com meia-vida em células quiescentes de 0,51 dias (coluna B) e meia-vida em células senescentes de 1,07 dias (coluna C) que rendeu um registro2FC de ~1,06 (coluna D) com um valor p de 0,001.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama do fluxo de trabalho pSILAC para células de controle senescentes e quiescentes. Os fibroblastos humanos IMR-90 foram usados para preparar culturas celulares quiescentes (baixo soro) ou senescente (IR) para comparação de meias-vidas proteicas. As células foram então rotuladas com mídia SILAC Light ou SILAC Heavy com arginina isotópica e liseina por 3 dias. Os lysatos foram extraídos de células, digeridos, desácidos e analisados por espectrometria de massa. Picos de isótopos de peptídeos pesados e leves correspondem a peptídeos recém-sintetizados e pré-existentes, respectivamente. Meias-vidas foram calculadas usando uma equação para decadência exponencial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Figura 2: A validação de fenótipos senescentes usando análises SA-βGal e RT-qPCR. (A) As células senescentes e quiescentes são re-banhadas no momento da colheita em uma placa de 6 poços e manchadas para SA-βGal usando o kit de coloração SA-βGal. A cor azul no corpo celular é positiva para senescência. As imagens são tiradas em campo brilhante com cor a 10x de ampliação, marcador de tamanho em vermelho. (B) Análise RT-qPCR comparando células senescentes (vermelhas) e células ciclísticas (cinza) de um experimento não relacionado. Aumentos nos níveis de CDKN1A/p21, CXCL8 e IL6 mRNAs são indicativos de senescência, assim como a diminuição dos níveis de LMNB1 mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Figura 3: Métodos representativos para varreduras de aquisição dependentes de dados (DDA) e gradiente de cromatografia líquida das culturas pSILAC no espectrômetro de massa Q-Exactive HF orbitrap. (A) Configurações de instrumentos recomendadas no software de instrumento para análise dependente de dados de lysatos de células inteiras a partir de um experimento pSILAC. (B) Exemplo de configurações do método de gradiente de fluxo de cromatografia líquida. Peptídeos são elucidos sobre um gradiente linear de 90 min variando de 5% a 35% de tampão B (0,2 % ácido fórmico e 99,8% de acetonitrilo), seguido por uma lavagem de 10 min com 80% de tampão B, e 25 min de equilíbrio com 5% tampão B. (C) Um cromatógrama de íon total (TIC) representativo de uma aquisição de espectrometria de massa de peptídeos fibroblastos IMR-90 adquiridos com as configurações especificadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Figura 4: Cromatógramas de íons extraídos representativos de peptídeos com rotatividade alterada durante senescência. (A) Áreas de pico cromatugráficas do peptídeo FQMTQEVVCDECPNVK++ da proteína DnaJ homólogo membro subfamiliar B 11 (DNAJB11) em células senescentes e não-senescentes. Após 3 dias de SILAC, as células senescentes incorporam isótopos menos pesados neste peptídeo em comparação com células quiescentes (não senescentes), como indicado por uma redução na área de pico de peptídeos pesados contendo isótopos (azul) em relação ao peptídeo leve (vermelho), indicando que este peptídeo reduziu a rotatividade em células senescentes. (B) Áreas de pico cromatográficas do peptídeo VQAQVIQETIVPK++ da proteína Splicing Factor 3a Subunit 1 (SF3A1) em células senescentes e não senescentes. Após 3 dias de SILAC, as células senescentes incorporam uma maior proporção de isótopo pesado neste peptídeo em comparação com células quiescentes (não senescentes), como indicado por uma redução na área de pico de peptídeo pesado contendo isótopos (azul) em relação ao peptídeo leve (vermelho), indicando que este peptídeo aumentou a rotatividade em células senescentes. As condições não rotuladas (Dia 0) não mostram incorporação de isótopos pesados para ambos os peptídeos, como esperado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Figura 5: Comparação de meia-vidas proteicas em células senescentes e quiescentes determinadas a partir da rotulagem pSILAC. (A) Enredo vulcânico exibindo a proporção log2 de senescente /controle (quiescente) para cada uma das 695 proteínas identificadas; neste experimento, a mídia de rotulagem leve e pesada não continha glicose e nenhum vermelho fenol. (B) Tabelas que mostram as 10 proteínas mais aumentadas ou diminuídas em células quiescentes versus células senescentes (esquerda e direita, respectivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Mídia e buffers usados neste protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 2: Primers RT-qPCR usados neste protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 3: Pasta de trabalho de análise do SILAC para cálculo de meias-vidas proteicas, alterações de dobra e testes T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para rotulagem metabólica de células senescentes e não-divisórias com SILAC pulsado, análise de espectrometria de massa não-alvo, e um cálculo simplificado de meias-vidas proteicas.

Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Como as células mantêm a homeostase proteica não é bem compreendida no contexto do estresse celular e da senescência. Neste protocolo, fornecemos uma maneira simples e precisa de calcular a rotatividade de proteínas, que é um componente-chave da homeostase proteica em células vivas. Pulse SILAC dá a um experimentador a capacidade de medir a rotatividade de proteínas para proteínas individuais e todo o proteome de uma maneira de alto rendimento que também é mais autêntico para sistemas biológicos do que outros métodos.Os princípios deste método podem ser aplicados a qualquer sistema que possa ser rotulado metabolicamente, incluindo organismos inteiros. Esse método também pode levar a insights sobre senescência celular, envelhecimento e doenças neurodegenerativas. A análise de espectrometria em massa é altamente sensível a certos contaminantes químicos, como detergentes.Use reagentes de grau LC-MS durante este procedimento para garantir a coleta de dados de alta qualidade. Para iniciar a rotulagem metabólica das células, substitua a mídia por três placas cada uma das células senescentes e quiescentes por 30 mililitros de mídia SILAC Light. Separadamente, substitua o médio por três placas senescentes e três quiescentes por 30 mililitros de SILAC Heavy.Cresça as células por três dias sem mudar o meio. Para separar as células das placas de cultura, adicione cinco mililitros de reagente de trippsina pré-aquecido a cada placa e incubar as placas por cinco minutos a 37 graus Celsius. Mais tarde, resuspende as células separadas em cinco mililitros da mesma mídia usada para a cultura para um volume total de 10 mililitros.Em seguida, transfira as células para o gelo e centrifugar as células a 300 vezes G a quatro graus Celsius. Depois de lavar a pelota duas vezes, gire as células novamente e remova o supernasciente antes de reutilizar a pelota em 150 microliters de ureia de oito molares recém-preparada e 50 milimônios tampão de bicarbonato de bicarbonato. Misture o conteúdo do tubo por tubulação para cima e para baixo.Alíquota de 50 microgramas da amostra de proteína em um novo tubo e leva amostras a volumes iguais com tampão de lise. Em seguida, adicione dithiothreitol a uma concentração final de 20 milimôlares ao tubo e incubar a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação. Deixe a amostra esfriar à temperatura ambiente por 10 minutos antes de adicionar iodoacetamida a uma concentração final de 40 mililitros e incubar à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.Em seguida, dilua a amostra para abaixo de uma ureia molar com um tampão de bicarbonato de amônio de 50 mililolar. Adicione um micrograma de trippsina para 50 microgramas de proteína inicial ou às 1:50 trippsina à razão proteica à amostra. Incubar a amostra durante a noite a 37 graus Celsius com agitação para digerir proteínas em peptídeos.No dia seguinte, adicione ácido fórmico a 1% em volume da amostra para saciar a digestão proteica. Para a limpeza da amostra, coloque um cartucho de extração em fase sólida em um coletor de vácuo, utilizando um cartucho de extração para cada amostra, de acordo com as diretrizes do fabricante. Após a extração, remova as amostras de peptídeos do coletor de vácuo e seque-as completamente em um concentrador de vácuo.A secagem leva aproximadamente três horas. Para a espectrometria de massa, ou análise de MS, resuspenque a amostra de peptídeo a uma concentração de 400 nanogramas por microliter em um buffer de ácido fórmico de 0,2%. Para resolubilizar os peptídeos, misture a amostra por cinco minutos.Em seguida, sonicate por cinco minutos em um sonicator banho de água. Em seguida, centrifuufique a amostra para pelotar os materiais insolúveis e transfira os supernantes peptídeos em frascos de MS. Submeta as amostras para a análise proteômica usando espectrometria de massa cromatografia líquida tandem, ou LC-MS-MS.Use as configurações recomendadas para análise não-fixada pela instalação de espectrometria de massa. Carregue as amostras em uma coluna analítica com uma taxa de fluxo de 400 nanolitadores por minuto para elute os peptídeos sobre um gradiente linear de 90 minutos usando uma mistura de solventes orgânicos e inorgânicos, com o solvente orgânico variando de 5 a 35% Adquira dados de espectrometria de massa no modo dependente de dados, com um ciclo contínuo de varreduras de pesquisa MS1 seguidas por 20 tomografias MS2 dependentes de dados com fragmento de HCD. Quantifique as áreas de pico de peptídeos para peptídeos pesados e leves na ferramenta de software Proteome Quantitation.Em seguida, exporte as áreas de pico de peptídeos pesados e leves. Para o cálculo de meias-vidas proteicas, abra a Pasta de Trabalho de Análise SILAC para a primeira folha chamada Raw Data e cole nos IDs UniProt, nomes de genes, áreas de pico pesado e leve nas colunas indicadas. Em seguida, abra a quarta folha chamada Análise e remova as linhas onde as colunas G e H indicam que a amostra está fora de alcance e mantenha linhas que lêem dentro do intervalo.Os fenótipos senescentes foram validados utilizando-se a atividade beta-galactosidase associada à senescência e a análise rt-qPCR. Para a atividade beta-galactosidase, as células senescentes pareciam azuis, enquanto as células de controle quiescente não tinham cor mínima ou mínima. Na análise RT-qPCR, as células senescentes apresentaram maior interleucina-6, CXCL8 e CDKN1A-P21 mRNAs em comparação com as células quiescentes.Por outro lado, o nível de codificação lamin B1 para marcador de proliferação foi baixo ou ausente nas células senescentes. Os cromatogramas de íons extraídos de peptídeos revelaram a proporção relativa de sinais de peptídeos pesados e leves. Uma proporção menor de sinais de peptídeos pesados em relação às células senescentes leves indicaram uma taxa de rotatividade de proteínas mais lenta, e um sinal de peptídeo pesado mais alto em relação à luz indicou uma taxa de rotatividade de proteínas mais rápida.As amostras não rotuladas mostraram pouco ou nenhum sinal de peptídeo pesado. Foram calculadas as meias-vidas para 695 proteínas identificadas a partir da análise de espectrometria de massa. A meia-vida é relatada como uma proporção de log-dois de senescente sobre células quiescentes e plotada em um complô vulcâneo.Após o cálculo das taxas de rotatividade de proteínas em células senescentes, a análise a jusante pode revelar caminhos biológicos candidatos que são regulados por mecanismos de proteostase. O Pulse SILAC abriu caminho para os pesquisadores estudarem a dinâmica proteica com granularidade e throughput sem precedentes, permitindo-nos estudar mudanças na homeostase proteica em muitas proteínas individuais.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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