Técnicas moleculares e imunológicas em um modelo de rato geneticamente modificado de tumor estrommal gastrointestinal

Nosso protocolo descreve a reprodução, manutenção, dissecção e processamento de amostras do único modelo de camundongo imunocompetente, GIST, atualmente em uso. Esperamos que os futuros pesquisadores possam utilizar esse modelo de mouse para promover a pesquisa translacional no GIST. As terapias tradicionais em GIST envolvem terapia molecular direcionada com inibidores de tyrosina quinase.

Este modelo permite que os pesquisadores testem imunoterápicos em GIST. Para começar, esterilize todos os instrumentos, use luvas durante todo o procedimento e mantenha um campo estéril. Prepare a área de incisão com 70% de etanol.

Usando uma tesoura, faça uma incisão vertical de linha média de dois centímetros e entre na cavidade abdominal. Lise severamente qualquer aderência intra-abdominal. Para remover o linfonodo mesentérico drenante, identifique o ceco e levante sua mesenteria superiormente.

Aproximadamente no meio do caminho até a base da mesenteria colonia, identifique o linfonodo mesentérico e dissefique-o bruscamente. Conforme necessário, divida o tecido linfático em terços para isolamento de proteínas, histologia e suspensão de células únicas. Coloque tecido linfático em 20 mililitros de meio RPMI para suspensões unicelulares e mantenha no gelo.

O ceco é substituído principalmente por um GIST nos ratos Kit558. Para o isolamento do GIST e do ceco, divida cuidadosamente a junção ileocólica da base do tumor. Em seguida, divida o ceco novamente, dois centímetros dísistal para a base do tumor.

Em 50 a 60% dos camundongos Kit558, a cabeça do tumor contém uma tampa de tecido cecal, que normalmente contém fluido sêmérico, mas raramente pode conter pus. Disseca o tecido da tampa para longe do tecido tumoral. Divida o tecido tumoral e o ceco em terços para isolamento de proteínas, histologia e suspensão unicelular.

Para suspensões unicelulares, coloque tecido tumoral ou ceco no HBSS com 2% de FCS, o suficiente para cobrir a amostra e mantenha no gelo. Despeje a mídia RPMI com a amostra do linfonodo sobre um filtro de 100 micrômetros. Mova o filtro para um novo cônico de 50 mililitros, e amasse o linfonodo com a extremidade macia de uma seringa de plástico de três mililitros.

Lave o filtro com 20 mililitros de mídia RPMI. Centrifugar as amostras e aspirar o supernante. Resuspenja a pelota em 20 mililitros de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 micrômetros.

Pegue o filtrado da célula. Conte células usando um hemócito. Centrifugar as amostras e descartar o supernaspeso.

Em seguida, resuspend em tampão de contas para citometria de fluxo. Prepare o tampão de colagem como descrito no manuscrito do texto. Coloque GIST em um prato estéril e adicione 2,5 mililitros de tampão de colagenase.

Usando um bisturi estéril e uma tesoura, pique o tumor até que ele esteja em fragmentos finos. Use uma pipeta de furo grande para aspirar o tumor e colagenase em um tubo de 50 mililitros. Incuba-o a 37 graus Celsius por 30 minutos a 100 rotações por minuto, em seguida, sacie a reação com dois mililitros de FBS.

Despeje colagenase com espécime GIST sobre um filtro de 100 micrômetros e amasse o tumor com a extremidade macia de uma seringa plástica de três mililitros e colete em um tubo de 50 mililitros. Lave o filtro com 20 mililitros de HBSS. Centrifugar o filtrado a 450 RCF por cinco minutos a quatro graus Celsius, em seguida, descartar o sobrenante.

Resuspenja a pelota em 20 mililitros de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 micrômetros Coletar o filtrado e contar células usando um hemócito. Centrifugar e aspirar o supernasciente, em seguida, resuspend em tampão de contas para citometria de fluxo. Usando uma tesoura, divida o ceco longitudinalmente para expor a mucosa interna.

Corte-o em seções de 0,5 centímetros e coloque-o em um tubo de 50 mililitros com cinco mililitros de HBSS e 2%FBS. Agite vigorosamente por 30 segundos e centrífuga a 450 RCF por 20 segundos. Então, descarte o supernatante.

Adicione de cinco a 20 mililitros de HBSS com EDTA de dois mililitros. Incuba-o a 37 graus Celsius a 100 rotações por minuto durante 15 minutos. Centrifugar e descartar o supernaspeico, em seguida, resuspend a pelota em cinco a 20 mililitros de HBSS.

Agite a mistura vigorosamente por 30 segundos, depois centrífugue a 450 RCF por 20 segundos e descarte o supernatante. Repita este processo mais uma vez. Resuspenque a pelota em cinco mililitros de tampão de colagenase, em seguida, incuba-la a 37 graus Celsius por 30 minutos a 100 rotações por minuto.

Agite vigorosamente a cada 10 minutos e sacia a reação com dois mililitros de FBS. Despeje colagenase com espécime de ceco sobre um filtro de 100 micrômetros e amasse com a extremidade macia de uma seringa de plástico de três mililitros. Lave o filtro com 20 mililitros de HBSS e colete o filtrado.

Centrifugar e descartar o supernaspe. Resuspenja a pelota em 20 mililitros de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 micrômetros. Coletar células filtras e contar usando um hemótmetro.

Repita o processo de centrifugação mais uma vez e resuspense a pelota no tampão de contas para citometria de fluxo. Os camundongos Kit558 tiveram uma vida útil média de oito meses devido à obstrução intestinal progressiva. Tumores dos camundongos Kit558 expressaram marcadores canônicos de GIST, incluindo o KIT de quinase de tyrosina, o canal transmembrano Dog1, e o fator de transcrição ETV1.

Os tumores foram estudados para alterações na via de sinalização kit, como os marcadores a jusante ERK e AKT ou microambiente imunológico, que imitavam de perto o GIST humano. A ressonância magnética ou tomografia foi utilizada para rastrear o volume do tumor como uma medição precisa da resposta do tumor. Dissecar o tumor longe da junçãoileocólica e longe da tampa cecal é importante para capturar o peso tumoral verdadeiro e a análise imunológica e molecular.

Dentro do GIST, esse modelo permitiu a investigação do microambiente tumoral, bem como imunoterápicos.