Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.
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Artigo de método
* These authors contributed equally
Retraction Notice
This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.
Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.
O interesse na microscopia líquida-eletrônica (EM-líquido) disparou nos últimos anos, já que os cientistas agora podem observar processos em tempo real em nanoescala. É extremamente desejável emparelhar informações crio-EM de alta resolução com observações dinâmicas, pois muitos eventos ocorrem em escalas de tempo rápidas - na faixa de milissegundos ou mais rápido. Um melhor conhecimento de estruturas flexíveis também pode ajudar no projeto de novos reagentes para combater patógenos emergentes, como o SARS-CoV-2. Mais importante ainda, a visualização de materiais biológicos em um ambiente fluido fornece um vislumbre único de seu desempenho no corpo humano. Apresentamos aqui métodos recém-desenvolvidos para investigar as propriedades em nanoescala de conjuntos de vírus em gelo líquido e vítreo. Para atingir esse objetivo, amostras bem definidas foram utilizadas como sistemas modelo. Comparações lado a lado dos métodos de preparação de amostras e informações estruturais representativas são apresentadas. Características sub-nanômetros são mostradas para estruturas resolvidas na faixa de ~3,5-Å-10 Å. Outros resultados recentes que apoiam essa estrutura complementar incluem insights dinâmicos de candidatas a vacinas e terapias baseadas em anticorpos com imagens em líquido. No geral, essas aplicações correlativas avançam nossa capacidade de visualizar a dinâmica molecular, fornecendo um contexto único para seu uso na saúde e na doença humanas.
A pesquisa biomédica melhora nossa compreensão da saúde e da doença humanas através do desenvolvimento de novas tecnologias. A imagem de alta resolução está transformando nossa visão do nanomundo - permitindo-nos estudar células e moléculas em detalhes requintados 1,2,3,4,5. Informações estáticas de componentes dinâmicos, como polímeros moles, conjuntos de proteínas ou vírus humanos, revelam apenas um instantâneo limitado de sua narrativa complexa. Para entender melhor como as entidades moleculares operam, ....
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1. Carregamento do suporte do provete para o líquido-EM
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Um TEM líquido operando a 200 kV foi utilizado para todos os experimentos de imagem de EM líquido e um TEM crio-TEM operando a 300 kV foi usado para toda a coleta de dados de crio-EM. Imagens representativas e estruturas de vários vírus são apresentadas para demonstrar a utilidade dos métodos em vários sujeitos de teste. Estes incluem vírus adenoassociado recombinante subtipo 3 (AAV), SARS-CoV-2 sub-conjuntos virais derivados do soro do paciente e partículas de dupla camada de rotavírus símio (DLPs), cepa SA11. Primeiram.......
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Novas oportunidades são apresentadas para agilizar os fluxos de trabalho atuais de EM líquido usando novas ferramentas e tecnologias automatizadas adaptadas do campo crio-EM. As aplicações que envolvem a nova técnica de sanduíche de microchip são significativas em relação a outros métodos, pois permitem a análise de imagens de alta resolução em gelo líquido ou vítreo. Uma das etapas mais críticas do protocolo é a produção de espécimes com a espessura líquida ideal para visualizar detalhes requintados no nível de nanoesca.......
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. A autora, Madeline J. Dressel-Dukes, é funcionária da Protochips, Inc. e Michael Spilman é funcionário da DirectElectron.
Os autores reconhecem o Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Departamento de Oftalmologia) por fornecer AAV-3 purificado. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Instituto Nacional do Câncer (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetona | Fisher Scientific | A11-1 | Ferramenta |
| de recorte de carregador automático | ThermoFisher Scientific | N / A | Também fornecedor SubAngstrom |
| Clipes de grade de carregador automático | ThermoFisher Scientific | N / A | clipes superiores e inferiores Grades |
| EM de ouro revestido de carbono Electron | Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400 mesh, 5 nm de espessura |
| Soro do paciente COVID-19 | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microlitros de Metanol sérico PCR+ |
| Fisher Scientific | A412-1 | ||
| Microchips integrados a micropoços de | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm matrizes de janelas |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 janelas grandes, microchips |
| TEMWindows | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 janelas pequenas, 5 nm de espessura |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm janela |
| Whatman #1 papel de filtro | Whatman | 1001 090 | 100 peças, 90 mm |
| Equipamento Detector de elétrons direto | |||
| DirectView | Espaçamento | elétrons de elétrons de 6 mícrons | |
| Detector de elétrons direto Falcon 3 EC | ThermoFisher Espaçamento de | pixels de 14 mícrons | |
| Estação de bombeamento seco Gatan 655 Gatan | , Inc. | Ponta do suporte da bomba para 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Unidade de preparação de espécimes de | última geração da Scientific | |
| PELCO easiGlow, unidade de descarga de brilho | Ted Pella, Inc. | Modo de polaridade negativa | |
| Poseidon Selecione o suporte de amostra | Protochips, Inc. | Compatível com FEI; porta-amostras | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Líquido-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Software disponível gratuitamente | Link do site< | strong>Comentários (opcional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | outro software de processamento de imagem | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | programa de localização CTF | |
| MotionCorr2 | |||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | pacote de software de análise de estrutura molecular |
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