Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental
9 de setembro de 2022
O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.
Atualmente não há cura completa para a esclerose múltipla. Nosso protocolo permite a construção efetiva de um modelo experimental de encefalomielite autoimune para ajudar a explorar terapias para a doença da esclerose múltipla. A principal vantagem do nosso protocolo é uma avaliação mais abrangente do tratamento da encefalomielite autoimune experimental a partir de múltiplas perspectivas.
Primeiro, prepare a emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina dissolvendo peptídeo liofilizado e PBS estéril pré-resfriado sem íons cálcio e magnésio em pH 7,4. Adicione uma esfera de aço esterilizada de cinco milímetros a um tubo de microcentrífuga limpo de dois mililitros. Em seguida, adicione 500 microlitros de adjuvante completo de Freuds contendo cinco miligramas por mililitro de microbactéria liofilizada tuberculose e 500 microlitros da emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina ao tubo.
Agora oscile o tubo em um lisador de tecido por 10 minutos. Em seguida, esfrie os tubos no gelo por 10 minutos. Repita o processo quatro vezes até que uma solução viscosa branca seja formada.
Em seguida, dilua a solução de caule de toxina pertussis 50 vezes em PBS estéril de pH 7,4 sem íons cálcio e magnésio para atingir uma concentração final de 200 nanogramas por 100 microlitros. Para precipitar toda a emulsão de peptídeo glicoproteico de oligodendrócitos de mielina inicialmente preparada no fundo do tubo, centrifugar o tubo a quatro graus Celsius por dois a três segundos, pressionando o botão de pulso no equipamento. Aspirar a emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina com uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 22 e transferir a emulsão para um novo barril de seringa de 1 mililitro.
Fixe uma agulha de calibre 26 ao cano e prenda a conexão com um filme de vedação. Injete 100 microlitros da emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina por via subcutânea em cada lado da coluna dorsal de um rato. Após a injeção, observe a formação automática de massas bulbosas sob a pele e o dorso.
Em seguida, por via intraperitoneal, injete 100 microlitros de toxina pertussis no mesmo rato. Prepare uma câmara de reação de campo aberto e configure um sistema de análise de vídeo para registrar a locomoção do rato. Para limpar a câmara de reação antes do experimento, borrife etanol a 70% em toda a área e limpe com uma toalha de papel limpa.
Em seguida, coloque um rato no canto de uma câmara de reação. Para começar a filmar, clique no botão Iniciar captura na barra de menus do sistema de gravação de vídeo e registre o tempo. Mantendo silêncio na sala de testes, deixe o mouse se mover livremente por cinco minutos.
Em seguida, pare a gravação e salve o vídeo. Coloque o mouse de volta em sua gaiola. Em seguida, limpe a área de teste com etanol a 70% e prossiga para o próximo mouse.
Mantenha o rato eutanasiado plano em uma bandeja de dissecação e fixe as extremidades. Segure a pele do membro posterior no rato com fórceps e abra a pele e os músculos com uma tesoura. Em seguida, separe o fêmur da tíbia e do osso do quadril usando cuidadosamente a tesoura.
Remova os músculos aderentes ao fêmur com uma tesoura. Em seguida, coloque o fêmur em etanol a 70% à temperatura ambiente. Neste estudo, avaliou-se a capacidade do peptídeo derivado da glicoproteína oligodendrócitos da mielina de induzir EAE.
Ratos injetados com o peptídeo experimentaram perda de peso progressiva. Após seis a nove dias de injeção, eles desenvolveram sintomas de EAE que atingiram o pico após 14 a 16 dias. Gráficos de pista do teste de campo aberto demonstraram que o EAE altera o comportamento exploratório normal dos camundongos.
Em comparação com ratos normais, os ratos com EAE viajaram significativamente menos distância nas fases iniciais de início, pico e remissão. Camundongos com EAE também tiveram uma duração de atividade significativamente reduzida nas fases de pico e remissão da doença. Além disso, em todas as três fases, os camundongos EAE tiveram significativamente menos distância de viagem e tempo gasto no centro.
Tomografia computadorizada de fêmures de camundongos EAE revelou uma arquitetura trabecular diferente de camundongos normais. Os fêmures de camundongos EAE tiveram significativamente menos densidade mineral óssea e relação volume ósseo/volume tecidual do que aqueles de camundongos normais. Além disso, fêmures de camundongos com EAE apresentaram menor densidade de conexão trabecular, número trabecular e espessura trabecular do que aqueles de camundongos normais.
Em comparação com camundongos normais, o espaçamento trabecular foi aumentado e a espessura óssea cortical foi reduzida em camundongos EAE. Também podemos isolar o cérebro e o código espinhal de camundongos EAE no pico da doença e analisar a produção de células imunes e citocinas por citometria da gripe.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) em camundongos utilizando glicoproteína da mielina oligodendrócito (MOG). Oferece uma avaliação abrangente do processo da doença por meio de escores clínicos, tomografia computadorizada microscópica e testes comportamentais.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Neuroimunologia
- Pesquisa em esclerose múltipla
- Modelagem de doenças autoimunes
Antecedentes
- Existência de diversos modelos experimentais para o estudo da esclerose múltipla.
- Importância de um modelo confiável para a avaliação de tratamentos.
- MOG é um componente fundamental na patologia da esclerose múltipla.
Métodos Utilizados
- Indução de EAE usando emulsão do peptídeo MOG e toxina da pertússis.
- Modelo de camundongo
- Tomografia computadorizada micro e testes de campo aberto para avaliação.
Resultados Principais
- Os camundongos exibiram perda progressiva de peso e desenvolveram sintomas de EAE dentro de duas semanas após a injeção de MOG.
- A análise comportamental revelou comportamento exploratório prejudicado e locomoção reduzida em camundongos com EAE.
- A microtomografia computadorizada indicou densidade óssea diminuída e arquitetura trabecular alterada em camundongos com EAE.
Conclusões
- O estudo estabelece com sucesso um modelo abrangente de EAE para a exploração adicional de terapias para esclerose múltipla.
- Os achados são significativos para a compreensão do mecanismo da doença e de possíveis intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os modelos de encefalomielite autoimune experimental (EAE) fornecem uma plataforma translacionalmente relevante para avaliar hipóteses terapêuticas e desvios mecanicistas no descobrimento de fármacos para esclerose múltipla (EM). A integração de indicadores comportamentais, esqueléticos e imunológicos aumenta a confiança preditiva e apoia decisões de portfólio ajustadas ao risco nos estágios iniciais de descobrimento e pontos de inflexão pré-clínicos. O fenotipamento abrangente na EAE permite uma validação de alvo mais robusta e orienta decisões de avançar/não avançar para candidatos a tratamento da EM.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em um modelo de neuroinflamação autoimune relevante para a doença.
- Apoia a validação funcional de alvos ao associar intervenções moleculares a fenótipos clínicos, comportamentais e esqueléticos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio de leituras multidimensionais além da pontuação clínica tradicional.
- Melhora a confiança preditiva para a triagem de portfólios ao capturar diversos desfechos relevantes para a esclerose múltipla.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas validados in vivo para triagem de eficácia e mecanismos downstream de candidatos a medicamentos para esclerose múltipla.
- Padroniza a avaliação com escores clínicos reprodutíveis, análise comportamental e resultados de micro-TC.
- Permite a avaliação quantitativa dos efeitos do composto sobre neuroinflamação, comportamento e saúde óssea.
- Apoia plataformas escaláveis e reutilizáveis para perfilhamento comparativo de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os desfechos pré-clínicos às manifestações em pacientes com EM, incluindo comportamento semelhante à ansiedade e osteoporose.
- Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, integrando biomarcadores imunológicos e fenotípicos.
- Reduz os riscos nas decisões de avanço ao fornecer evidências multiparamétricas de eficácia e segurança.
- Fortalece a relevância translacional para a seleção de candidatos e a estratégia de biomarcadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de EAE conecta a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica de terapêuticas para a EM, permitindo a verificação de hipóteses, a clarificação de vias moleculares e a avaliação quantitativa dos efeitos de intervenções.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação da hipótese nula e a exploração mecanicista de vias neuroimunes na EM.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas, reprodutíveis e quantitativas para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medições multimodais — escores clínicos, métricas comportamentais e microarquitetura óssea — para comparação robusta de condições.
- Pesquisa Translacional: Alinha achados pré-clínicos com fenótipos relevantes para pacientes e pontos finais de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma in vivo reutilizável para descoberta iterativa de fármacos e biomarcadores para EM.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos em ES.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de estudos de eficácia in vivo.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/interromper e melhora a eficiência do capital ao integrar diversos indicadores de avaliação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos terapêuticos em ES.
Considerações de Implementação
- Exige especialização em neuroimunologia, análise comportamental e imagem óssea.
- Requer acesso à infraestrutura de micro-TC, rastreamento de vídeo e citometria de fluxo.
- Necessita padronização entre equipes para escores clínicos e protocolos comportamentais.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de camundongos ou intervenções relevantes para a esclerose múltipla.
- A complexidade da avaliação aumenta com pontos finais multiparamétricos e integração de dados.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Preparation of Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein Peptide (MOG35-55) Emulsion and Pertussis Toxin
1:55
Establishment of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Animal Model
2:55
Open Field Test
3:42
Analysis of Bone Phenotype
4:16
Results: Induction of EAE by MOG35-55 Treatment
5:49
Conclusion
