Name: Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprenda a medir o número de cópias de DNA mitocondrial e a heteroplasmia de deleção em células individuais usando PCR de gotículas digitais. Este método preciso beneficia pesquisadores em biologia celular e neurociência.

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Obrigado ao Dr. L Bozhilova por conselhos sobre a análise estatística de dados de PCR de geração de gotículas. Obrigado ao Dr. H Zhang por fornecer os ovócitos usados para gerar dados na Figura 3C e na Figura 4B. Este trabalho foi realizado pela SPB na Unidade de Biologia Mitocondrial do Conselho de Pesquisa Médica (MC_UU_00015/9), Universidade de Cambridge, e financiado por uma bolsa de pesquisa principal da Wellcome Trust realizada pela PFC (212219/Z/18/Z).

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Sem conflitos de interesse a divulgar.

O protocolo descrito aqui é aplicável em uma ampla gama de tipos de células e espécies, além dos discutidos acima, embora a otimização cuidadosa de novos projetos de ensaio seja fundamental para garantir que a precisão e a repetibilidade do método sejam mantidas ao se afastar das combinações de primer/sonda previamente validadas. Ao trabalhar com células individuais, é vital garantir que a coleta de amostras seja realizada com a maior precisão possível (por exemplo, usando parâmetros rigorosos de célula única ao classifi...

O DNA mitocondrial (mt) de mamíferos é um genoma de DNA circular pequeno (aprox. 16,5 Kb) que reside na matriz mitocondrial que codifica 37 genes, compreendendo dois rRNAs, 22 tRNAs e 13 genes codificadores de proteínas1. Ao contrário do genoma nuclear, que contém uma (haploide) ou duas cópias (diploide) de cada gene por célula, o mtDNA está presente em múltiplas cópias nas mitocôndrias de cada célula, variando de dezenas de cópias (por exemplo, espermatócitos maduros) a centenas de milhares de cópias (por exemplo, ovócitos)2,3. Uma consequência dessa natureza multi-cópia é que mutações no genoma do mtDNA, que podem existir como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), deleções ou duplicações, podem estar presentes em níveis variados em qualquer célula, compondo de 0% a 100% da população total de mtDNA da célula. A existência de genomas de mtDNA do tipo selvagem e mutante na mesma célula é denominada heteroplasmia, e mutações patogênicas heteroplasmáticas de mtDNA são uma das principais causas de doença mitocondrial, com várias síndromes neurológicas comuns ligadas a mutações heteroplasmáticas de mtDNA subjacentes4.
Dois parâmetros-chave que contribuem para a probabilidade de uma mutação heteroplasmática do mtDNA causar doença clínica são o nível de heteroplasmia e o número de cópias do mtDNA. Muitas mutações heteroplasmáticas apresentam um efeito limiar, com fenótipos bioquímicos e clínicos apenas se tornando aparentes acima de um certo nível de heteroplasmia, tipicamente em torno de 80%5, e subsequentemente piorando à medida que a heteroplasmia aumenta ainda mais4. No entanto, também é importante considerar o número de cópias de mtDNA presentes na célula, pois isso influenciará o número de genomas de mtDNA do tipo selvagem (ou seja, "saudáveis") que estão presentes em um determinado nível de heteroplasmia. Estudos em pacientes com doença mitocondrial destacaram a importância dessa interação entre heteroplasmia e número de cópia5,6, e Filograna et al. relataram recentemente um aumento no número de cópias de mtDNA aliviando os sintomas, apesar da heteroplasmia inalterada em um modelo de camundongo de doença mitocondrial7.
Embora muito tenha sido feito nos últimos anos para melhorar a compreensão da patogênese e transmissão de doenças causadas pela heteroplasmia do mtDNA, a maior parte deste trabalho foi conduzida no nível de tecidos e não de células, comparando os níveis médios de heteroplasmia tecidual e as medições do número de cópias adquiridas a partir de biópsias de tecido a granel e amostras de sangue. Algumas técnicas bem estabelecidas, como a microdissecção por captura a laser, permitem tais medidas em nível celular 8,9; no entanto, a recente explosão de métodos de análise de célula única de alto rendimento, ou os chamados "Umics de célula única"10, criou um requisito para métodos que possam medir com precisão esses parâmetros cruciais do mtDNA no nível de célula única.
O método de PCR de geração de gotículas aproveita os recentes avanços na tecnologia microfluídica para melhorar os métodos existentes de quantificação de concentrações de DNA desconhecidas por meio da amplificação por PCR de amplificadores alvo específicos no DNA da amostra11. Ao contrário da qPCR, em que o DNA da amostra é amplificado em uma única reação, com a taxa relativa de acumulação do produto da PCR atuando como a leitura, esse método divide a amostra inicial em milhares de gotículas individuais, compartimentando assim as moléculas de DNA da amostra em reações espacialmente separadas12. A reação de PCR subsequente prossegue em cada gota individual, com o produto de PCR se acumulando apenas em gotículas que contêm o DNA alvo. O resultado dessa reação é uma saída digital na forma de um conjunto de gotículas que contêm uma cópia do DNA alvo e do produto de PCR amplificado ou não contêm o DNA alvo. Usando sondas de DNA fluorescentes ou um corante de ligação de DNA de fita dupla (ds), as gotículas contendo produto amplificado podem ser contadas, e a proporção de gotículas "positivas" para "negativas" pode ser usada para calcular o número absoluto de cópias de DNA que estavam presentes na amostra inicial. Essa medida absoluta, em oposição à medida relativa adquirida a partir de uma reação de qPCR, é o fator-chave que permite que essa metodologia seja utilizada para a mensuração precisa do número de cópias de mtDNA e da heteroplasmia em células isoladas11, e vários estudos recentes já utilizaram a tecnologia de PCR de geração de gotículas para esse fim13,14 . Este artigo apresenta um método para medir o número de cópias de mtDNA e a heteroplasmia de deleção em células individuais de tecidos humanos e de camundongos.

<table><tbody><tr><td>Solução Tween-20 de 50%</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>Óleo gerador automatizado de gotículas&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864110</td><td>Formulação de óleo comercial usada para gerar a emulsão de óleo/gotícula (usada na Etapa 4.1 do Protocolo)</td></tr><tr><td>Máquina de PCR C1000 com bloco de poço profundo</td> Termociclador de PCR <td>Bio Rad</td><td>1851197</td><td>equipado com um bloco de aquecimento de poço profundo, usado para lise celular (Etapa 2.1.2 do Protocolo) e ciclagem de PCR (Etapa 5 do Protocolo)</td></tr><tr><td>Bloco de resfriamento da placa de coleta</td><td>Bio Rad</td><td>12002819</td><td>Bloco de resfriamento que mantém as amostras resfriadas durante a geração de gotículas (usado na etapa 4.3 do protocolo)</td></tr><tr><td>placas ddPCR de 96 poços&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>pontas de pipeta de placas de 96 poços projetadas para uso no gerador de gotículas QX200 AutoDG, usadas para preparação de amostras (etapa do protocolo 3.4) e coleta de gotículas (etapa do protocolo 4.3)</td></tr> <tr><td>óleo do leitor de gotículas ddPCR&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>Formulação de óleo comercial usada pelo leitor de gotículas (usada na etapa 6.1 do protocolo)</td></tr><tr><td>Supermix ddPCR para Sondas (sem dUTP)</td><td>Supermix comercial Bio Rad</td><td>1863023</td><td>para uso em experimentos de ddPCR utilizando sondas (usado na Etapa 3.3 do Protocolo)</td></tr><tr><td>Cartuchos geradores de gotículas automatizados DG32&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864108</td><td>Cartuchos microfluídicos usados no gerador de gotículas QX200 AutoDG para gerar a emulsão de óleo/gotículas (usado na Etapa 4.3 do Protocolo)</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Soro fetal bovino qualificado</td></tr><tr><td>Tampas de placa de folha&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>Tampas de placa de folha usadas para selar placas de coleta de gotículas após a geração de gotículas (usadas na etapa 4.6 do protocolo)</td></tr> <tr><td>Células HEK 293T</td><td>Takara</td><td>632180</td><td>Subclone comercial da linha celular renal embrionária humana transformada, HEK 293, expressando as células HeLa do antígeno SV40 Large-T</td></tr><tr><td></td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>Células de carcinoma epitelóide do colo do útero humano</td></tr><tr><td>Glicose alta DMEM</td><td>Gibco</td><td>13345364</td><td>4.5g/L D-Glucose, com L-glutamina e piruvato de sódio</td></tr><tr><td>Cíbridos humanos</td><td>Universidade de Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionários de camundongos</td><td>Universidade de Newcastle</td><td>Imortalizado a partir de camundongos C57Bl/6</td> Água livre de nuclease Ambion AM9937 Selos de placa PCR Pierce SP-0027 Selos de placa adesiva transparente, usados apenas para geração de pré-gotículas (selo de folha deve ser usado na etapa 4.6)Lixeiras de ponta de pipeta Bio Rad 1864125 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Compartimento de coleta descartável usado para coletar pontas descartadas no gerador de gotículas QX200 AutoDG (usado na etapa 4.3 do protocolo)</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta para sistema AutoDG&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864120</td><td>Pontas de pipeta filtradas projetadas para uso no gerador de gotículas QX200 AutoDG (usado na etapa 4.3 do protocolo)</td></tr><tr><td>Células primárias de fibroblastos dérmicos humanos</td><td>Newcastle Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers/Sondas</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>As sequências exatas de primer/sonda dependerão do ensaio. Os primers e sondas usados neste estudo são fornecidos na Tabela 1</td></tr><tr><td>Solução de proteinase K 20 mg/mL</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR selador de placas</td> Bio <td>Rad</td><td>1814000</td><td>Aplica selos de folha a placas de amostra ddPCR após a geração de gotículas (usado na Etapa 4.6 do Protocolo)</td></tr><tr><td>Software QX Manager</td><td>Bio Rad</td><td>12012172</td><td>Software de configuração e análise do leitor de gotículas (usado nas Etapas 6 e 7 do Protocolo)</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas QX200 AutoDG</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>Gerador de gotículas microfluídico automatizado (usado na Etapa 4 do Protocolo)</td></tr><tr><td>Leitor de gotículas QX200</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>Leitor de gotículas (usado na Etapa 6 do Protocolo)</td></tr><tr><td>Cristais pré-definidos Trizma pH 8,3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo o número de cópias de dna mitocondrial de célula Única e a heteroplasmia usando a reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

O DNA mitocondrial (mt) de mamíferos é uma molécula de DNA intramitocondrial pequena, circular, de fita dupla, que codifica 13 subunidades da cadeia de transporte de elétrons. Ao contrário do genoma nuclear diploide, a maioria das células contém muito mais cópias de mtDNA, variando de menos de 100 a mais de 200.000 cópias, dependendo do tipo de célula. O número de cópias do mtDNA é cada vez mais usado como um biomarcador para uma série de condições degenerativas e doenças relacionadas à idade e, portanto, a medição precisa do número de cópias do mtDNA está se tornando uma ferramenta fundamental em ambientes de pesquisa e diagnóstico. Mutações no mtDNA, muitas vezes ocorrendo como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou deleções, podem existir em todas as cópias do mtDNA dentro da célula (denominada homoplasmia) ou como uma mistura de cópias de mtDNA mutadas e WT (denominadas heteroplasmia). As mutações heteroplasmáticas do mtDNA são uma das principais causas de patologia mitocondrial clínica, seja em doenças raras ou em um número crescente de doenças comuns de início tardio, como a doença de Parkinson. Determinar o nível de heteroplasmia presente nas células é um passo crítico no diagnóstico de doenças mitocondriais raras e em pesquisas destinadas a entender distúrbios comuns de início tardio em que as mitocôndrias podem desempenhar um papel. O número de cópias de mtDNA e a heteroplasmia têm sido tradicionalmente medidos por ensaios quantitativos baseados em (q)PCR ou sequenciamento profundo. No entanto, a recente introdução da tecnologia ddPCR forneceu um método alternativo para medir ambos os parâmetros. Ele oferece várias vantagens em relação aos métodos existentes, incluindo a capacidade de medir o número absoluto de cópias de mtDNA e sensibilidade suficiente para fazer medições precisas de células individuais, mesmo com números de cópia baixos. Apresentamos aqui um protocolo detalhado que descreve a medição do número de cópias de mtDNA em células individuais usando ddPCR, referido como PCR de geração de gotículas doravante, com a opção de medição simultânea de heteroplasmia em células com deleções de mtDNA. A possibilidade de expandir este método para medir a heteroplasmia em células com SNPs de mtDNA também é discutida.

Após a geração de gotículas, uma camada clara de gotículas opacas é visível flutuando sobre a fase de óleo em cada poço (Figura 1B). A formação de gotículas pode ser afetada negativamente pela presença de detergentes no lisado de entrada ao realizar experimentos em células individuais. Utilizando o protocolo de lise descrito em 2.1.2., rendimentos de gotículas acima do nível recomendado de 10.000 são rotineiramente alcançados, apesar da presença de uma pequena quantidade residual de TWEEN-20...

Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.

Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Este protocolo pode ser usado para medir com precisão o número de cópias de DNA mitocondrial presentes em células individuais e o nível de certos tipos de mutação do DNA mitocondrial. Métodos anteriores podem fazer com precisão essas medições em amostras de tecido contendo muitas células. A principal vantagem desta técnica é que podemos fazer as mesmas medições em células individuais.Este método é particularmente útil para aqueles que estudam mitocôndrias e terá amplas aplicações neste campo. O isolamento eficaz e a lise de células individuais são fundamentais para esta técnica. A experiência anterior com a classificação de célula única seria muito útil.Para começar, prepare a mistura mestra para a PCR sem o DNA da amostra no gelo, conforme descrito no texto. Após o vórtice brevemente, distribua o volume necessário da mistura mestra preparada para cada poço de uma placa de 96 poços de geração de gotículas, organizando as amostras em colunas completas. Em seguida, adicione a mistura mestre a qualquer poço vazio em colunas incompletas para usá-las como controles que não sejam de modelo.Em seguida, adicione o DNA de entrada a cada poço para fazer o volume total de cada poço 22 microli

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Neste vídeo, demonstramos a técnica de PCR digital duplex (ddPCR) - uma modificação da técnica tradicional de PCR que é útil na detecção de dois marcadores genéticos diferentes simultaneamente. Uma única reação de PCR é particionada em gotículas emulsionadas do tamanho de nanolitros que são amplificadas independentemente, e a detecção de sinais de amplificação de fluorescência de cores diferentes da fração de gotículas é usada para calcular a concentração inicial das sequências alvo.

PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

Este vídeo demonstra a técnica de reação em cadeia da polimerase por gotículas multiplex para a quantificação simultânea de regiões de DNA metilado em diferentes populações de glóbulos brancos como um biomarcador precoce para diagnóstico clínico e prognóstico.

Reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex para detectar metilação do DNA em leucócitos

Um método sensível e preciso para quantificação de microRNAs livres de células usando uma química baseada em corante e tecnologia de PCR digital de gotículas é descrito.

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Nós convertemos com sucesso o ensaio padrão do protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) a ser empregado em reações Chain digitais do polymerase da gota. Este novo ensaio, chamado ddTRAP, é mais sensível e quantitativo, permitindo uma melhor detecção e análise estatística da atividade de telomerase dentro de várias células humanas.

ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas

Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem de glóbulos brancos (WBC) através da quantificação dos padrões de metilação de DNA. Este protocolo apresenta um método de reação em cadeia de polimerase de gotícula multiplex (mdPCR) usando um dispositivo microfluido baseado em elastômero termoplástico (TPE) para geração de gotículas permitindo quantificação de alvo específica e multiplex específica da contagem diferencial WBC.

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR usando dispositivo gerador de gotícula de polímero para diagnósticos hematológicos

Os ensaios de pirosequenciamento permitem a genotipagem robusta e rápida de polimorfismos de nucleotídeo único do DNA mitocondrial em células ou tecidos heteroplasmáticos.

Genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Genoma Mitocondrial por Pirosequenciamento

Um procedimento para estudar a dinâmica do metabolismo do DNA mitocondrial (mtDNA) em células usando um formato de placa multi-poço e imagens automatizadas de imunofluorescência para detectar e quantificar a síntese e distribuição do mtDNA é descrito. Isso pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA.

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

Este estudo apresenta um método rápido de ddPCR para quantificar biomassa microbiana do solo e proporções fúngico-bacterianas. Embora o carbono microbiano derivado da ddPCR apresente apenas fraca correlação com estimativas de fumigação com clorofórmio, o método oferece uma abordagem molecular sensível e escalável para avaliar a abundância microbiana sem amostragens adicionais do solo ou uso agressivo.

Determinação da Biomassa Microbiana no Solo usando PCR Digital por Gotículas (ddPCR)

Aprenda a medir o número de cópias de DNA mitocondrial e a heteroplasmia de deleção em células individuais usando PCR de gotículas digitais. Este método preciso beneficia pesquisadores em biologia celular e neurociência.

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