Name: Sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de Gerbil Envelhecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a avaliar a integridade sináptica em cócleas de gerbil jovens e envelhecidos usando imunolabeling e inibição de autofluorescência. Este protocolo rápido gera dados quantitativos para pesquisa em perda auditiva relacionada à idade.

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Os autores reconhecem Lichun Zhang por ajudar a estabelecer o método e a Unidade de Serviço de Microscopia de Fluorescência, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, para o uso das instalações de imagem. Esta pesquisa foi financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2177/1.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+and+age-related+hearing+loss%3A+new+perspectives+and+potential+therapies+%5Bversion+1%3B+peer+review%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li>
<li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+cochlea%3A+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing%22%5BJournal%5D)">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li>
<li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve%2Fhair-cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li>
<li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li>
<li>Pangršič, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li>
<li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+synapse+number%2C+structure+and+function+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li>
<li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li>
<li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li>
<li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells%3A+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933(2020).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).</li>
<li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil%3A+Round+window+assays+of+synapse+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).</li>
<li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li>
<li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gerbil%3A+A+unique+model+for+research+on+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Aging+Research%22%5BJournal%5D)">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li>
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<li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).</li>
<li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+aging%3A+a+matter+of+toxic+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+Aging+Knowledge+Environment%3A+SAGE+KE%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).</li>
<li>Li, H. -S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%3B+Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li>
<li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+%28Mus+musculus%29+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li>
<li>Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).</li>
<li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).</li>
<li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea%3A+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li>
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Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Com o método descrito neste protocolo, é possível imunolabel IHCs e estruturas sinápticas em cócleas de gerbils jovens adultos e idosos, identificar supostas sinapses funcionais por co-localização de elementos pré e post-sinápticos, alocá-los para IHCs individuais e quantificar seu número, volume e localização. Os anticorpos utilizados nesta abordagem também rotularam células ciliadas externas (OHCs; myoVIIa) e suas fitas pré-sinápticas. Além disso, uma alternativa viável para a imunolabelagem de ambos os IHCs e OHCs é u...

A perda auditiva relacionada à idade é uma das doenças mais prevalentes do mundo que afeta mais de um terço da população mundial com 65 anos oumais de 1 ano. As causas subjacentes ainda estão em debate e estão sendo investigadas ativamente, mas podem incluir a perda das sinapses especializadas que conectam células ciliadas internas (IHCs) com diferentes fibras nervosas auditivas2. Estas sinapses de fita compreendem uma estrutura pré-sináptica que tem vesículas preenchidas com o glutamato neurotransmissor amarrado a ele, bem como receptores de glutamato α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA)receptores de glutamato 3,4,5. No gerbil, ~20 fibras nervosas auditivas diferentes entram em contato com um IHC 6,7,8. As fibras no IHC voltadas para o modiólus se opõem a grandes fitas sinápticas, enquanto as fibras que se conectam no lado do pilar do IHC enfrentam pequenas fitas sinápticas (ou seja, em gatos9, gerbils7, cobaias10 e ratos 3,11,12,13,14). Além disso, no gerbil, o tamanho das fitas pré-sinápticas e as manchas de glutamato postsintáptico estão correlacionados positivamente 7,14. As fibras que se opõem a grandes fitas no lado modiolar do IHC são pequenas de calibre e têm baixas taxas espontâneas e limiares elevados15. Há evidências de que as fibras de baixa taxa espontânea são mais vulneráveis à exposição ao ruído10 e drogas ototóxias16 do que fibras de baixo limiar espontâneos, que estão localizadas no lado pilar dos IHCs15.
A perda de sinapses de fita é o mais antigo evento degenerativo na perda auditiva relacionada à idade neural coclear, enquanto a perda de células de gânglio espiral e suas diferentes fibras nervosas auditivas fica atrásde 17,18. Correlações eletrofisiológicas incluem gravações de respostas auditivas do troncocerebral 17 e potenciais de ação composta8; entretanto, não refletem as sutilezas da perda de sinapse, uma vez que as fibras de baixa taxa espontânea não contribuem para essas medidas16. Métricas eletrofisiológicas mais promissoras são o índice neural derivado de massa19 e a resposta ao tempo peristimulus20. No entanto, estes só são confiáveis se o animal não tiver outras patologias cocleares, além da perda auditiva de fibras nervosas, que afetam a atividade das fibras nervosas auditivas restantes8. Além disso, os limiares avaliados comportamentalmente no gerbil não foram correlacionados com os números da sinapse21. Portanto, a quantificação confiável das sinapses de fita sobreviventes e, assim, o número de fibras nervosas auditivas funcionais só é possível mediante o exame direto do tecido coclear.
O gerbil mongol (Meriones unguiculatus) é um modelo animal adequado para estudar a perda auditiva relacionada à idade. Tem uma vida útil curta, tem audição de baixa frequência semelhante aos humanos, é fácil de manter, e mostra semelhanças com patologias humanas relacionadas à perda auditiva relacionada à idade 2,22,23,24. Os gerbils são considerados idosos quando chegam aos 36 meses de idade, o que está perto do fim de sua média de vida22. É importante ressaltar que uma perda relacionada à idade das sinapses de fita tem sido demonstrada em gerbils criados e envelhecidos em ambientes tranquilos 8,21.
Aqui, é apresentado um protocolo para imunolabel, dissecar e analisar cócleas de gerbils de diferentes idades, de adultos jovens a idosos. Anticorpos direcionados contra componentes da presinapse (CtBP2), patches de receptor de glutamato postânaptic (GluA2) e IHCs (myoVIIa). Aplica-se um quencher de autofluorescência que reduz o fundo em cóclea envelhecida e deixa o sinal de fluorescência intacto. Além disso, é dada uma descrição de como dissecar a cóclea para examinar tanto o epitélio sensorial quanto a estria vascularis. O comprimento coclear é medido para permitir a seleção de locais cocleares distintos que correspondem às melhores frequências específicas25. A quantificação dos números da sinapse é realizada com o software disponível livremente ImageJ26. A quantificação adicional de volumes e locais de sinapse dentro do HC individual é realizada com software personalizado escrito no Matlab. Este software não é disponibilizado publicamente, pois os autores não têm recursos para fornecer documentação profissional e suporte.

<table><tbody><tr><td>Albumina Fração V sem biotina</td><td>Carl Roth</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 (camundongo monoclonal IgG1)</td><td>BD Biosciences, Eysins</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-GluA2 (camundongo monoclonal IgG2a)</td><td>Millipore</td><td>MAB39</td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo (IgG1)-AF 488</td><td>Molecular Probes Inc.</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>anti-MyosinVIIa (coelho policlonal IgG)</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25e6790</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de lâmina e Quebrador - Mandíbulas Planas</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Artéria de Bonn - Ponta de Bola</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>Espessura da lamínula 1.5H, 24 x 60 mm</td> Lâmina Cirúrgica Descartável <td>Carl Roth</td><td>LH26.1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Henry Schein</td><td>0473</td><td></td></tr><tr><td>burro anti-coelho (IgG)-AF647</td><td>Life Technologies-Sondas Moleculares</td><td>A-31573</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Fórceps Fino</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de #5SF Dumont</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absoluto 99,8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>12468750</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Carl Roth</td><td>8040.2</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feather Lâmina de borda dupla</td><td>PLANO</td><td>112-9</td><td></td></tr><tr><td>G19 Cânula</td><td>Henry Schein</td><td>9003633</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-rato (IgG2a) -AF568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21134</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essentials</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol, Óleo de imersão 518F</td><td>Carl Zeiss</td><td>10539438</td><td></td></tr><tr><td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (com Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td><td>Braun</td><td>4062957E</td><td></td></tr><tr><td>ISM596D</td><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec</td><td></td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>Schott</td><td>150.600</td><td>fonte de luz para estereomicroscópio</td></tr><tr><td>Leica Application suite X</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mayo Tungston Carbide ToghCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14512-17</td><td></td></tr><tr><td>Mini-100 Orbital-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-M100</td><td>para uso em ambiente frio</td></tr><tr><td>Narcoren (pentobarbital)</td> <td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri sem aberturas</td><td>Avantor VWR</td><td>390-1375</td><td></td></tr><tr><td><forte>Salina tamponada com fosfato:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dissódico</td><td>AppliChem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotássico</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-M</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes com tampa de rosca</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.300</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Aluno Adson Fórceps</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Estudante Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Ferramentas</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio de Adesão Superfrost</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescência Quencher</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Vannas, 3mm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Montagem Média</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>0002819000</td><td></td></tr><tr><td>VX 7 Prato de fixação para Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>953300</td><td></td></tr><tr><td>Wild TYP 355110 (Estereomicroscópio)</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td>não está mais disponível</td></tr></tbody></table>

sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de gerbil envelhecido

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

A perda de sinapses de fita que conectam células ciliares internas e fibras nervosas auditivas diferentes é considerada uma das causas da perda auditiva relacionada à idade. O método mais comum para detectar a perda de sinapses de fita é o imunolabeling porque permite a amostragem quantitativa de vários locais tonotópicos em uma cóclea individual. No entanto, as estruturas de interesse estão enterradas no interior da cóclea óssea. Gerbils são usados como modelo animal para perda auditiva relacionada à idade. Aqui, protocolos de rotina para fixação, montagens inteiras de gerbil coclear de imunolabeling, imagens confocal e números e volumes de sinapse de fita quantificando são descritos. Além disso, destacam-se os desafios particulares associados à obtenção de bons materiais de indivíduos valiosos do envelhecimento. 
Gerbils são eutanizados e ou perfundidos cardiovascularmente, ou suas bípricas timpânicas são cuidadosamente dissecadas para fora do crânio. A cóclea é aberta no ápice e base e diretamente transferida para o fixador. Independentemente do método inicial, a cóclea é postfixada e posteriormente descalcificada. O tecido é então rotulado com anticorpos primários contra estruturas pré e postiáticas e células ciliadas. Em seguida, a cóclea é incubada com anticorpos com marca de fluorescência secundária que são específicos contra seus respectivos primários. A cóclea de gerbils envelhecidos é então tratada com uma quencher de autofluorescência para reduzir a fluorescência de fundo tipicamente substancial dos tecidos dos animais mais velhos. 
Finalmente, a cóclea é dissecada em segmentos 6-11. Todo o comprimento coclear é reconstruído de tal forma que locais cocleares específicos podem ser determinados de forma confiável entre os indivíduos. Pilhas de imagens confocal, adquiridas sequencialmente, ajudam a visualizar células ciliadas e sinapses nos locais escolhidos. As pilhas confocal são desconvolvadas, e as sinapses são contadas manualmente usando ImageJ, ou a quantificação mais extensa de estruturas sinápticas é realizada com procedimentos de análise de imagem escritos sob medida no Matlab.

A cóclea foi colhida após perfusão cardiovascular com fixação de todo o animal ou rapidamente dissecada após eutanásia do animal e imersão fixada. Com este último método, os IHCs permaneceram no lugar durante a dissecção, enquanto, em casos de perfusão mal sucedida e, portanto, tecido insuficientemente fixo, o epitélio sensorial foi muitas vezes destruído. Note-se que os autores encontraram casos em que a fixação da cóclea após a perfusão transcárlica foi insuficiente enquanto a fixação do cérebro ainda era adequada. O t...

Um protocolo para processar a cópula gerbil jovem e envelhecida imunolabelando as estruturas sinápticas e células ciliadas anciavelmente, saciando a autofluorescência no tecido envelhecido, dissecando e estimando o comprimento da cóclea, e quantificando as sinapses em pilhas de imagens obtidas com imagens confocalas.

Sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de Gerbil Envelhecido

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Este protocolo permite a avaliação da integridade sináptica na cóclea do gerbil de todas as idades. Isso é importante para pesquisas fundamentais sobre problemas auditivos, em particular, devido ao envelhecimento. O protocolo é relativamente rápido e produz dados quantitativos de vários locais ao longo da cóclea.Além disso, aborda um problema específico do envelhecimento do tecido usando uma saciador de autofluorescência. A degeneração das sinapses é o primeiro sinal de perda de função na cóclea. Quantificá-lo é uma ferramenta importante na pesquisa para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico não invasivas para a sinaptopatia.A dissecção coclear é a parte mais crucial que precisa de prática, por isso é melhor começar com cochli não experimental. Comece removendo o bullae. Corte o osso com uma tesoura ou quebre o osso com fórceps e remova-o com fórceps para alcançar a cóclea.Remova os canais malleus, incus e semicircular. Remova cuidadosamente o osso que cobre o ápice da cóclea e arranhe o osso coclear com fórceps para fazer pequenos orifícios no ápice e na curva basal ou cuidadosamente fazer buracos em ambos os locais. Transfira imediatamente o bullae para pelo menos 50 mililitros de fixação fria.Para cortar o cochli ao meio, posicione um pedaço de lâmina de barbear por mais tempo do que o comprimento enrolado da cóclea em um suporte de lâmina. Em seguida, coloque a cóclea em uma placa de Petri sob um microscópio estéreo. Corte o excesso de tecido com uma lâmina de barbear ou com uma tesoura fina.Segure a cóclea no lugar com fórceps finos e corte ao meio ao longo do modiolo. Prepare uma solução de 5% do quencher de autofluorescência misturando-o com 70% de etanol. Coloque o cochli nesta solução e incuba-o por um minuto à temperatura ambiente em um shaker seguido de lavagem três vezes com um mililitro de PBS por cinco minutos.Para a dissecção da cóclea, colete duas fórceps finas, fórceps super finos, vannas, tesouras de mola, um porta-lâminas, uma lâmina de barbear, e encha a placa de Petri de polistyrol e sua tampa com PBS. Quebre peças da lâmina de barbear para obter uma superfície de corte de dois a quatro milímetros. Corte a cóclea ao meio, conforme mostrado na seção para preparação do tecido.Fixar cuidadosamente a metade coclear com os fórceps de tal forma que a borda de corte esteja voltada para cima. Use uma tesoura de mola fina para cortar o osso da cóclea acima do helicotrema que cobre o ápice. Em seguida, use a tesoura para isolar a curva apical cortando através do mólico e nervo auditivo e scala vestibuli.Faça dois cortes em cada lado do osso coclear acima, ou se a estria vascularis não for necessária para avaliação posterior, diretamente através da estria vascularis da curva média. Use a lâmina de barbear para separar as peças cocleares. Alternativamente, corte entre o órgão de Corti e a estria vascularis.Deixe a estria vasculare conectada ao ligamento espiral e remova o osso descalcificado usando fórceps. Em seguida, transfira as peças cocleares em uma tampa de placa de Petri cheia de PBS. Remova o excesso de tecido no pilar e nos lados do modiolar de tal forma que todas as montagens mais tarde deitem-se na lâmina o mais plana possível.Grandes peças cocleares, em particular, aquelas originárias da curva basal, devem ser cortadas em duas peças. Remova cuidadosamente a membrana tectorial com fórceps super finos. Coloque as peças cocleares sobre um slide em uma gota de meio de montagem, garantindo que o órgão de Corti se enlouqueça.Desloque a peça coclear para o plano sagital e procure a invaginação do limbus espiral nas proximidades das células ciliares internas. Esta invaginação do limbus espiral pode ser vista mais claramente nas peças coclear médias e basais. Transfira toda a cóclea e toda a estria vascularis para o slide do microscópio repetindo esses passos.Cubra deslize o slide e adicione esmalte preto ao redor das bordas para vedação. Seque no escuro e armazene-os a 4 graus Celsius. Abra uma cópia das pilhas desconvolved no software ImageJ carregado com plugin BioVoxxel.Divida os canais clicando em Imagem, depois Cores e, em seguida, Canais Divididos. Mescle-os clicando em Imagem, depois Cores e, em seguida, Mesclar canais para atribuir cores diferentes. Converta a imagem em uma pilha de RGB clicando em Imagem e, em seguida, vá para Color e clique em Pilha para RGB.Ajuste o brilho e o contraste clicando em Imagem, Ajuste e, em seguida, Brilho/Contraste. Use auto ou controle deslizante para garantir que as estruturas pré e pós-sináptica e as etiquetas internas das células ciliadas sejam distintas do plano de fundo. Rotule cinco células ciliares internas com a ferramenta de texto clicando no local desejado dentro da pilha.Em seguida, vá para Analisar, em seguida, Ferramentas e selecione ROI Manager. Verifique as etiquetas da caixa de marcação para rotular os pontos com um número. Amplie a célula ciliada interna de interesse.Clique com o botão direito do mouse na ferramenta ponto para escolher o modo de vários pontos. Role a dimensão Z e conte as sinapses de fita funcional, que são identificadas por uma fita pré-sináptica em justaposição a um patch de glutamato pós-sináptico. Depois de selecionar todas as estruturas de interesse, clique em Adicionar o Gerenciador de ROI e, em seguida, clique no nome arbitrário e escolha Renomear.Com a ferramenta manual, ajuste a imagem para exibir completamente a próxima célula ciliada interna. Mude de ferramenta de vários pontos para ferramenta Ponto para evitar adicionar mais puncta aos dados armazenados anteriormente. Clique em uma estrutura de interesse dentro da próxima célula ciliada interna e mude para ferramenta de vários pontos.Continue adicionando a sinapse da fita funcional no GERENCIADOr de ROI até que todas as células ciliadas internas sejam avaliadas. Clique em um conjunto de dados no Gerenciador de ROI e, em seguida, em Measure. Aguarde que uma nova janela apareça que liste os pontos de dados medidos e clique em Arquivo e Salvar Como salvar esta lista como uma planilha.Salve a imagem ativando Show All no ROI Manager. Clique em Achatar para adicionar permanentemente as etiquetas de ponto à pilha e clique em Concordar em fechar salvando as alterações. Projeções de pilha de Z da cóclea de um jovem gerbil de 10 meses mostram que as células de cabelo interiores rotuladas myosin 7A delineadas aqui por linhas brancas tracejadas estavam em contraste acentuado com o fundo.As fitas pré-sinápticas foram rotuladas com anti-CtBP2 duas mostradas em verde, enquanto as manchas de glutamato pós-sináptica foram rotuladas com anti-GluA2 mostrado em vermelho. A cóclea de um velho gerbil de 38 meses foi tratada com a quencher de autofluorescência e mostrou distintas células ciliadas internas com estruturas pré e pós-sinápticas claramente visíveis. Para testar a estabilidade do imunolabelamento, a mesma peça de cóclea do jovem gerbil foi imageda após três meses e 29 meses e meio.Apesar da redução da relação sinal-ruído, as sinapses funcionais eram distintas e quantificáveis. Mesmo que um corte falhe, monte o pedaço restante de tecido para mais tarde estimar o comprimento coclear completo com mais precisão. Os dados deste protocolo são particularmente valiosos se precedidos por, e então individualmente correlacionados com testes eletrofisiológicos ou psicofísicos auditivos.

immunolabeling-counting-ribbon-synapses-young-adult-aged-gerbil

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

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Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

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Avaliação de sinapses de fita em regiões de frequência específicas da cóclea de camundongo

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Sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de Gerbil Envelhecido

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