Caracterização rápida da Viscoelástica do Muco das Vias Aéreas usando um Reômetro Benchtop

As doenças muco-obstrutivas são caracterizadas pela viscosidade anormal do muco das vias aéreas. O protocolo mostra como usar a reologia para quantificar a viscosidade do muco e analisar dados para testar tratamentos direcionados ao muco. A reologia do muco fornece biomarcadores quantitativos específicos.

O uso de um dispositivo benchtop simplifica muito a logística de medir esses biomarcadores em espécimes clínicos como amostras de escarro humano. O uso da reologia do muco como ferramenta de diagnóstico para doenças obstrutivas ainda é um desafio. Um conjunto crescente de evidências mostra uma forte correlação entre propriedades reológicas, inflamação e infecção bacteriana.

O muco está sempre presente na interface corporal onde lubrifica e desempenha um papel protetor. A reologia do muco pode ser aplicada a outros sistemas como as faixas gastrointestinal e genital. Para obter medidas precisas, o manuseio correto e a colocação da amostra são fundamentais.

Uma demonstração visual pode melhorar a precisão deste ensaio. Demonstrando este procedimento estará Kendall Shaffer, um técnico de pesquisa do laboratório aéreo. Comece pela triagem da escarro das vias aéreas coletada ou muco em copos de espécimes estéreis.

No caso da escarro, remova o excesso de saliva da amostra imediatamente após a coleta. Coloque as amostras no gelo para transporte. Limite o tempo de transporte para menos de quatro horas.

Analise as amostras no momento da coleta. Homogeneize o muco ao escoar suavemente três a cinco vezes com uma pipeta de deslocamento positiva. Ou pipeta diretamente nos tubos de microcentrifuuagem.

Armazene as amostras a 80 graus Celsius até que seja processada. Alíquotar as amostras para armazenamento em volumes maiores ou iguais a 500 microliters para garantir volume suficiente para experimentos. Antes de aliquotação, pipeta e escarro fresco e congelado ou muco diretamente ou homogeneizam espécimes.

Reparar as alíquotas necessárias para repita medições e tratamentos. Incubar as alíquotas a serem testadas a 37 graus Celsius durante pelo menos cinco minutos antes da medição. Para testar agentes farmacológicos, utilize altas concentrações de soluções de estoque para evitar a diluição da amostra.

Adicione entre 1% a 10% de volume do reagente desejado diretamente na amostra. Certifique-se de que nenhuma gota do composto fique na lateral do tubo. Incubar as amostras a 37 graus Celsius pelo tempo necessário, para permitir uma reação química.

Misture a amostra de muco e o reagente movendo o fundo do tubo de microcentrifuge a cada dois minutos para permitir a penetração progressiva do reagente na amostra de muco sem comprometer a rede de mucina. Ao comparar vários reagentes medicamentosos, certifique-se de que o tempo de incubação seja semelhante. Ligue a máquina e inicialize o software.

Selecione nova medição. Digite o número de identificação da amostra em Measure ID e o nome do operador em Operador para continuar. Insira informações adicionais ou comentários nos comentários.

Selecione um conjunto de geometria e inspecione cuidadosamente placas grandes e pequenas, para garantir que as placas estejam limpas e em perfeitas condições. Insira a placa grande firmemente no púlpito inferior. Insira a placa pequena suavemente no púlpito superior e bloqueie a placa girando ligeiramente até ouvir um clique, o que indica que a placa está devidamente presa.

Note que a oscilação livre da placa superior é normal. Aguarde até que a temperatura atinja 37 graus Celsius. Em seguida, inicie a calibração automática, conforme solicitado pelo software.

Utilizando uma pipeta de deslocamento positiva, pipeta lenta entre 250 e 500 microliters da amostra no centro da grande placa inferior. Uma vez depositadas na placa, amostras viscosas adotarão uma forma de cúpula, enquanto que amostras altamente elásticas podem exigir corte físico. Abaixe a cabeça de medição carregando a pequena placa através do software e observe a amostra.

Se estiver devidamente carregada na placa inferior, a amostra fará contato e será centrada entre as duas placas. Para garantir que a amostra preencha a lacuna, use a função de lacuna reduzida até que a amostra não esteja mais na forma biconcava ou alinhada com a borda da placa. A função de abertura reduzida reduz a borda de medição em incrementos de 0,1 milímetro e é limitada a 7 incrementos.

Se uma lacuna permanecer após os 7 incrementos, clique em Redo Instalação para retornar à posição inicial e ajustar a posição e o volume da amostra. Se a lacuna for extremamente reduzida, remova a amostra em excesso com uma espátula por um movimento circular ao longo da borda da placa superior. Corte a amostra em excesso suavemente para evitar o estresse da tesoura.

Abaixe a tampa protetora para evitar qualquer projeção acidental de fluidos contaminados durante a oscilação. Para iniciar a medição, clique em Iniciar Análise. Um ciclo inteiro levará de quatro a sete minutos.

Evite falar alto e toque no dispositivo ou no banco durante toda a duração do ciclo. Um ambiente tranquilo é crucial para os dois primeiros minutos. Uma vez que o ciclo esteja concluído, clique ao lado para levantar a cabeça de medição e gerar o relatório de análise da amostra.

Uma vez que a cabeça de medição esteja totalmente retraída, levante a tampa protetora. Descarte a amostra e remova cuidadosamente as placas. Limpe e desinfete as placas usando água morna e sabão.

As características viscoelásticas de oito peo megadalton foram medidas em cinco concentrações e diretamente comparadas entre o reômetro avaliado no topo do banco e um reômetro a granel tradicional. Em contraste com as soluções peo, o muco asmático de status representa um comportamento elástico de forma sólida dominado em baixa tensão e apresenta um crossover em alta tensão. Além disso, as medições triplicadas realizadas em solução de PEO de 1,5% e amostra de muco de ensaio clínico, confirmaram que as características viscoelásticas lineares eram altamente repetíveis para os valores obtidos da amostra biológica.

As alterações foram medidas nas propriedades viscoelásticas do muco após o tratamento com um agente mucolítico. Os efeitos de TCEP no ensaio muco viscoelasticity foram testados em um ambiente clínico utilizando o reômetro benchtop. O tratamento mucolítico resultou em uma amostra mais fluida com uma diminuição no módulo complexo em 4,6 vezes, módulo elástico por 5,1 dobra, módulo viscoso em 1,9 vezes, cepa de crossover em 3,3 vezes e estresse de rendimento cruzado em 5,7 vezes, e aumento da taxa de amortecimento em 2,8 vezes.

Medir a viscoelasticidade do muco das vias aéreas em um ambiente clínico acelerado pode ajudar a adaptar o tratamento dos pacientes caso a caso, bem como fornecer um protocolo padronizado para testar novos compostos farmacológicos. Esta técnica é atualmente usada para examinar os efeitos de moduladores cftr altamente eficazes no escarro de fibrose cística e para testar a potência de várias drogas destinadas a alterar propriedades do muco.