Name: Triphosforilação química de Oligonucleotídeos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Aprenda a trifosforilação química de oligonucleotídeos usando salicil fosforocloridito e pirofosfato. Este método versátil permite sintetizar oligonucleotídeos 5'-trifosforilados de qualquer sequência, incluindo L-RNA não natural, ampliando as aplicações em biotecnologia e biologia sintética.

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Os autores são gratos a Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea Jr., Jonathan Sczepanski e Katrina Tjhung por discussões úteis sobre as melhores práticas para reações de triptoria química e a Gerald Joyce por comentários úteis. Este trabalho foi apoiado pela concessão da MCB 2114588 da Fundação Nacional de Ciência.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O procedimento de triphosforilação descrito aqui é amplamente compatível com a síntese de oligonucleotídeos usando química fosforamidita padrão. Os fosforamiditos nucleoídeos devem ter grupos de proteção de laboratório base compatíveis com desproteção rápida na AMA39, incluindo o padrão β-cianoetil no fosfito, e isobutíryl, dimetilformamidil, acetil, fenoxiacetil, ou 4-isopropilphenoxyacetyl nos grupos exocíclicos das nucleobases. Os grupos ribose 2'-hidroxil devem ser protegidos por grupos protetores de silyl, seja t-butyldimethylsilyl (TBDMS) ou tri-iso-propylsilyloxymetil (TOM)40,41. O grupo de pivaloyloxymetil de laboratório base (PivOM) também foi relatado como compatível com triphosforilação química30.
Foram descritos múltiplos métodos para a triphosforilação química de oligonucleotídeos sintéticos 28,29,30,31,32,33,34,35. Encontramos triphosforilação usando o reagente Ludwig-Eckstein37 para ser um dos mais acessíveis, não exigindo nenhuma síntese especializada de reagentes e nenhum equipamento especializado. Oligonucleotídeos 5'-triphosfatos preparados por este método têm sido usados rotineiramente como substratos para ribozymes ligase RNA, incluindo o uso de triptosfatos L-RNA enzimáticas inacessíveis para alcançar síntese dependente de modelos e replicação deste ácido nucleico "imagem espelho" 14,16,17,18 . O método também é adequado para a preparação de pequenos RNAs de alça-tronco de 5′triphosforilados que são potentes ativadores da resposta imune inata em vertebrados 6,7.
O reagente Ludwig-Eckstein, salicyl phosphorochloridite37, é altamente reativo à água, e efetivamente limpa qualquer água introduzida ao dissolver o reagente antes de carregar na coluna oligonucleotídeo. Após este ponto, no entanto, o oligonucleotídeo 5′-fosfitylado reagirá preferencialmente com qualquer água introduzida no sistema sobre pirofosfato, formando um produto lateral de 5′H-fosfosfonato após o trabalho 28,37,38. Preparação cuidadosa dos reagentes de triphosforilação e da câmara de reação de triphosforilação garantem que este produto lateral não esteja formado. Para secagem de solventes, as peneiras moleculares tipo 4 Å são vendidas pré-embaladas em sacos de Teflon compatíveis com a maioria dos solventes orgânicos sob várias marcas pela maioria das empresas de reagente de síntese de oligonucleotídeos. Precauções adicionais, como realizar triphosforilação em um porta-luvas sob uma atmosfera anidro, geralmente não são necessárias.
A reação do oligonucleotídeo 5′-fosfito com TBAP forma uma solução cíclica de 5′-trimetafosfito, que é então oxidada ao cíclico 5′-trimetafosfato usando solução oxidante de síntese de oligonucleotídeo (iodo em água/piridina/THF). Deve-se notar que as soluções comerciais de oxidante utilizam quantidades variadas de iodo, e é essencial usar a alta concentração de iodo de 0,1 M para garantir a oxidação completa ao triphosfato. O produto cíclico é hidrolisado para o último 5′-triphosphate na mesma solução37, e soluções alternativas de oxidante anidro devem ser utilizadas se a linearização com nucleófilos que não sejam desejadas água (veja abaixo para aplicações)33. Qualquer trimetafosfato cíclico residual, no entanto, será linearizado durante a subsequente desproteção alcalina do oligonucleotídeo. A hidrólise do 5′-trimetaphosphate cíclico produz apenas o triphosfato 37,46 linear, em vez de triptofatoramificado 37,46.
A desproteção do oligonucleotídeo normalmente não precisa ser modificada para acomodar 5′-triphosforilação, mas algumas precauções devem ser tomadas. O triphosfato é relativamente estável à breve exposição a condições alcalinas, mas deve-se tomar cuidado para não expor o triphosfato à AMA por mais tempo do que o necessário. Devem ser evitados grupos de proteção que requerem tratamento mais prolongado em amônia ou AMA por mais de 10 minutos a 65 °C. Tratamentos mais suaves, como 2 h em amônia à temperatura ambiente são aceitáveis quando compatíveis com outros grupos de proteção de fosforamidita. Um método comum de desproteção rápida para oligonucleotídeos sintéticos de RNA protegidos por silyl usa trietilamina trihidrofluoreride e alta temperatura47; no entanto, isso deve ser evitado ao preparar rna 5'-triphosfatos à medida que as condições ácidas prolongadas são encontradas para acelerar a hidrólise triptosfato31,32.
O Preparae PAGE provou ser o método mais simples e confiável para purificação pós-proteção de oligonucleotídeos triphosforilados (Figura 3 e Figura 4). No entanto, o INTUS de fase inversa preparatória também pode ser usado para purificar produtos triphosforilados. A presença de 5'-difosfato e, em menor grau, 5'-monofosfatos é observada rotineiramente ao verificar a triphosforilação por espectrometria de massa. Observamos a fragmentação de 5′triphosfato durante a espectrometria de massa a partir de material altamente puro preparado por síntese química ou transcrição, particularmente se o instrumento não for otimizado para análise de oligonucleotídeos. No entanto, a análise rp-LC frequentemente mostra que 10%-20% do produto lateral 5'-diphosphate está presente em oligonucleotídeos mais longos de 5′-triphosforilados (Figura 4). Preparações comerciais de pirofosfato de tributylammonium podem ser contaminados com até 20% de monofosfato, que produzirá 5'-difosfato como um produto lateral durante a triptosforilação30,31. A preparação cuidadosa deste reagente internamente pode render estoques TBAP muito mais puros31. No entanto, encontramos oligonucleotídeos triphosforilados usando fontes comerciais de TBAP ainda mostram reatividade comparável ou maior quando usado como substratos em reações enzimáticas (Figura 5B), em comparação com o material preparado pela transcrição in vitro.
Um uso mais notável de triphosforilação de oligonucleotídeos com o reagente Ludwig-Eckstein aproveita o trimetafosphito cíclico intermediário33. Se a etapa de oxidação subsequente for conduzida com peróxido de 1 M t-butilo em hexanos, que é frequentemente usado para oxidação de oligonucleotídeos em condições anidrasas, a oxidação do fosfito ocorre sem hidrolise de abertura do anel, produzindo o trimetafosfato cíclico. Este intermediário pode então ser reagido com nucleófilos primários de amina ou álcool para produzir 5'-triphosphates com modificações no γ-fosfato. Essas modificações incluem a adição de uma tag lipofílica ligada por uma ligação fosforamidata, que facilita a rápida purificação específica do triptosfato por RP-LC, seguida de hidrólise ácida da tag do triphosfato33. Modificações fluorescentes na posição γ-fosfato também podem ser introduzidas para uso como repórteres fluorescentes em tempo real para reações de ligadura catalisada por ribozyme15,33.

A forma de RNA de 5′triphosphorylated é onipresente na biologia, pois é gerada pela transcrição do RNA em todos os domínios da vida e pela replicação do RNA durante o ciclo de vida de muitos vírus RNA. Estes triptofatos servem como substrato para a formação de mRNA de 7-metilguanilate em eucariotes e, portanto, desempenham um papel essencial na expressão proteica1. Em contrapartida, o triphosfato é retido em bactérias e vírus; assim, os RNA 5'-triphosphates são reconhecidos pelos reguladores de resposta à imunidade inata em eucariotes 2,3,4,5,6,7. Fora da biologia, uma série de ribozymes de ligase RNA foram evoluídos para usar o 5'-triphosphate in vitro8 e modificados para uso em ensaios diagnósticos 9,10,11,12,13,14,15. Uma dessas ribozyme pode ser usada para síntese dependente de modelos de L-RNA, o enantiomer não biológico de "imagem espelho" do D-RNA natural, do pequeno Oligonucleotídeo L-RNA 5′-triphosphates 16,17,18. A preparação rotineira de oligonucleotídeos triphosforilados de sequência variada e composição de espinha dorsal é essencial para investigar esses sistemas.
O método mais comum e acessível para preparar RNA 5'-triphosfatos em laboratório é por transcrição in vitro. No entanto, o RNA produzido por este método é restrito em sequência e tamanho pelos requisitos de promotor e substrato da enzima polimerase RNA. A polimerase T7 RNA e derivados especializados são os polímeros mais comuns utilizados para este fim 19,20,21,22. O RNA transcrito in vitro preparado com essas enzimas deve ser iniciado com uma purina de 5′terminais e é fortemente tendencioso em direção às purinas nos primeiros 10 nucleotídeos23,24. Além disso, a incorporação enzimática de nucleotídeos modificados por base ou espinha dorsal é na melhor das hipóteses ineficiente e mais frequentemente impossível com polímerases naturais, limitando a oportunidade de produzir oligonucleotídeos 5′-triphosfatos compostos de qualquer coisa menos D-RNA natural. Outro fator limitante é que o RNA gerado pela transcrição in vitro pode conter heterogeneidade substancial de 5′- e 3′- e é produzido como produtos extremamente heterogêneos quando menor que 20 nt 23,24,25,26,27.
Em contraste, a triphosforilação química de oligonucleotídeos preparados pela síntese de fosforamidite em fase sólida 28,29,30,31,32,33,34,35 podem ser usados para preparar oligonucleotídeos 5'-triphosphates 3-50 nt de comprimento, de qualquer sequência. Além disso, uma vasta gama de modificações de ácido nucleico acessíveis à síntese de fosforamidita pode ser adicionada aos oligonucleotídeos antes de 5′-triphosforilação 14,15,16,17,18,29,36. Muitos desses métodos utilizam o reagente de fosfelidade salicyl phosphorochloridite, que foi desenvolvido por Ludwig e Eckstein para a triphosforilação de fase de solução de mononucleosídeos37. A triptosforilação de oligonucleotídeos com este reagente é alcançada na fase sólida pela fosfísica do oligonucleotídeo 5′-hidroxil, conversão ao triphosfato por reação com pirofosfato e oxidação, seguido por procedimentos padrão para o decote do oligonucleotídeo a partir do suporte sólido, desproteção e purificação (Figura 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema para triphosforilação de oligonucleotídeos sintéticos. No primeiro passo, o oligonucleotídeo 50-hidroxil é fosfílico com SalPCl. No próximo passo, o fosfito de 50 salicílicos é reagido com TBAP para formar o metfosfito cíclico, em seguida, na terceira etapa oxidada para gerar o cíclico 50-trimetafosfato na solução de oxidação do sintetizador DNA/RNA (0,1 M Iodo/piridina/H2O/THF), que é rapidamente hidrolisado para produzir o linear 50-triphosfato na mesma solução28,33, 37 anos. O decote alcalino subsequente do sólido suporte de CPG e a desproteção do oligonucleotídeo no aquoso MeNH2/amônia hidraturará qualquer trimetafosfato cíclico residual à forma linear. Abreviaturas: SalPCl = fosforcloroida salicilal; TBAP = pirofosfato de tributylammonium; THF = tetrahidrofurano; CPG = vidro poroso controlado; MeNH2 = metilamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Embora os primeiros relatórios publicados usando este método muitas vezes sofriam de rendimentos ruins e produtos laterais indesejados 28,37,38, a manutenção cuidadosa das condições anidros é tudo o que é necessário para obter rotineiramente altos rendimentos. Isso pode ser alcançado com a preparação cuidadosa dos reagentes e o uso de um simples dispositivo de reação montado a partir de componentes plásticos padrão. Aqui, demonstramos os passos apropriados para a triphosforilação química de oligonucleotídeos, incluindo preparação de reagentes, montagem da câmara de reação, reação de triphosforilação, e posterior desproteção e purificação dos oligonucleotídeos triptosforilados. Também está incluído o uso representativo de oligonucleotídeos triphosforilados como substratos para ribozymes ligase para a síntese de produtos maiores de ácido nucleico com backbones L-RNA naturais e abióticos L-RNA.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtro de seringa de polietersulfona</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>Filtro de seringa para remover partículas de gel de poliacrilamida trituradas (Seção 5)</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro de seringa PTFE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>Filtro de seringa para remover resina CPG (Seção 5)</td></tr><tr><td>Seringas de plástico de 1 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>Componentes do aparelho de trifosforilação (seções 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>1,4-Dioxano, anidro</td><td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>Solvente de trifosforilação (seções 2- 4)</td></tr> <tr><td>2-Cloro-4H-1,3,2-benzodioxafosforin-4-ona, Salicil Fosforocloridito (SalPCl)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>Reagente de trifosforilação (seções 2 - ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Garrafas de vidro de 30 mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>Garrafas para preparação de solventes de trifosforilação e solução TBAP (seção 2)</td></tr> <tr><td>Torneira de 3 vias, policarbonato/polipropileno</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7328103</td><td>Componente do aparelho de trifosforilação (seções 2- 4)</td></tr> <tr><td>Solução de acrilamida / bis-acrilamida a 40%, 19: 1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>For PAGE (seções 5 - ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Acetonitrila, anidra, 100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Solvente de trifosforilação (seções 2- ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Armadilha neutralizadora de amônia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 e ANS121</td><td>Para uso com Speedvac DNA130 (seção 5)</td></tr> <tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td> <td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>Para PAGE, catalisador para polimerização de acrilamida (seções 5- 7)</td></tr> <tr><td>Amônia aquosa, 28%</td> <td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>Para preparar o reagente de desproteção AMA (seção 5)</td></tr> <tr><td>Metilamina aquosa, 40%</td> <td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>Para preparar o reagente de desproteção AMA (seção 5)</td></tr> <tr><td>Sintetizador automatizado de DNA / RNA oligonucleotídeo</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 Sintetizador de DNA / RNA</td><td>qualquer sintetizador baseado em coluna é aceitável (seção 1)</td></tr><tr><td>Ímã de captura de esferas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>Para captura de esferas de estreptavidina (seção 7)</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610404</td><td>Para tampão de carregamento de ureia PAGE (seção 5)</td></tr><tr><td>Bomba de óleo de vácuo profundo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>Para uso com liofilizador (seção 5)</td></tr><tr><td>Dessecante de drierita, malha 10-20</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>Dessecante para armazenar produtos químicos e equipamentos de trifosforilação (seções 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>D-RNA 27.3t polimerase quiral cruzada</td><td>preparada em casa18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3&prime;</td><td>Para reações de ribozima quiral cruzada (secção 7)</td></tr><tr><td>Suportes sólidos D-RNA CPG, 1.000&Aring;, pré-embalados 1 &micro; colunas de síntese de toupeiras</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>representante, para síntese de oligonucleotídeos D-RNA (seção 1)</td></tr><tr><td>Fosforamiditos protegidos por D-RNA TOM ChemGenes</td><td></td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>representante, para síntese de oligonucleotídeos D-RNA (seção 1)</td></tr><tr><td>Colunas de Síntese Expedite Vazias, 1&micro; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Colunas de síntese para uso com sintetizador de DNA/RNA Expedite (seção 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N-(2-hidroxietil)piperazina-N&prime;-(ácido 3-propanossulfônico), componente tampão de</td> reação <td>de ribozima MilliporeSigma</td><td>E1894</td> sólido <td>(seção 6</td></tr><tr><td>)Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), quelante de íons metálicos bivalente MilliporeSigma</td><td></td><td>EDS</td> sólido <td>para uso em vários tampões ( seções 5- 7)</td></tr> <tr><td>Filtros para colunas de síntese Expedite</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Filtros de coluna de síntese de estilo Expedite, para uso com colunas de síntese vazias (seção 1)</td></tr> <tr><td>Scanner de gel fluorescente / fosforescente</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>Para visualizar PAGE analítico (seções 6- 7)</td></tr> <tr><td>Formamida, deionizada</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>Para tampão de carregamento de gel de formamida PAGE (seções 6- 7)</td></tr><tr><td>Software de quantificação de imagem de gel</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>Para quantificar imagens de gel digitalizadas (seção 6)</td></tr><tr><td>Dessecador de vidro</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Armazenamento de solvente de trifosforilação (seção 2)</td></tr><tr><td>Suportes sólidos L-RNA CPG, 1.000&Aring;, ChemGenes a granel</td><td></td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>Síntese de oligonucleotídeos L-RNA (seção 1)</td></tr><tr><td>Modelo de cabeça de martelo de L-RNA</td><td>preparado em casa18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>Para reações de ribozima quiral cruzada (secção 7)</td></tr><tr><td>Primer de L-RNA</td><td>preparado em casa18</td><td>5&prime;-fluoresceína-GGCUCGA-3&prime;</td><td>Para reações de ribozima quiral cruzada (secção 7)</td></tr><tr><td>Fosforamidites protegidos por L-RNA TOM ChemGenes</td><td></td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>Síntese de oligonucleotídeos L-RNA (seção 1)</td></tr><tr><td>Liofilizador/Liofilizador</td><td>VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>Para concentração de oligonucleotídeos (seção 5)</td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio Hexahidratado, sólido</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>Para reações ribozimáticas (seções 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>N, N-Dimetilformamida, anidro</td><td>MilliporeSigma</td><td>227056</td><td>Solvente de trifosforilação (seção 2)</td></tr> <tr><td>Coluna de dessalinização NAP-25 (resina Sephadex G-25)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>Colunas de cromatografia descartáveis de exclusão de tamanho de fluxo por gravidade contendo resina Sephadex G-25 (seção 5)</td></tr> <tr><td>Agulha de aço inoxidável sem núcleo, 20 G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>Agulhas para piercing de septos de borracha (seções 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Calculadora de coeficiente de extinção de oligonucleotídeos</td> Ferramenta <td>Integrated DNA</td> Technologies <td>OligoAnalyzer</td><td>Modelo de vizinho mais próximo Calculadora de coeficiente de extinção de oligonucleotídeo curto de 260 nm (seção 5)</td></tr> <tr><td>Solução oxidante, 0,1 M Iodo em THF / piridina / água</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>Reagente de trifosforilação (seção 4)</td></tr> <tr><td>Placas PAGE</td><td>Timberrock / CBS</td><td>NGP-250-BO e NO</td><td>Para PAGE (seções 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Fonte de alimentação PAGE</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>For PAGE (seções 5- 7)</td></tr> <tr><td>Espaçadores e pentes PAGE (analíticos)</td> <td>Timberrock / CBS</td><td>VGS-0725 e VGC-0714</td><td>Para PAGE (seções 6- 7)</td></tr> <tr><td>Espaçadores e pentes PAGE (preparativos)</td> <td>Timberrock / CBS</td><td>VGS-3025R e VGC-3001</td><td>Para PAGE (seção 5)</td></tr> <tr><td>Suporte de PÁGINA</td><td>Timberrock / CBS</td><td>ASG-250</td><td>Para PAGE (seções 5- 7)</td></tr> <tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td> <td>Filme de vedação de cera para aparelho de trifosforilação (seções 2- 4)</td></tr><tr><td>Termociclador de PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Thermalcycler</td><td>Para reações de ribozima quiral cruzada (seção 7)</td></tr><tr><td>Coluna de dessalinização PD 10 (resina Sephadex G-10)</td><td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>Colunas de cromatografia de exclusão de tamanho de fluxo de gravidade descartáveis contendo resina Sephadex G-10, para oligonucleotídeos< 15 nt (seção 5)</td></tr><tr><td>Telas de fósforo</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>Para visualizar RNA marcado com 32P (seção 6)</td></tr><tr><td>Reagentes de síntese de fosforamidita</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62</td><td>representante, para síntese padrão de RNA/DNA (seção 1)</td></tr><tr><td>Tubo selável com tampa de rosca de polipropileno</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com tampa de rosca e anel de vedação de silicone, para desproteção segura de AMA ( seção 5)</td></tr><tr><td>Piridina, anidro</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>Solvente de trifosforilação (seção 2)</td></tr><tr><td>Cromatografia líquida de fase reversa/espectrometria de massa de ionização por eletrospray (RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>Serviço comercial para LC/MS especializado em oligonucleotídeos (seção 5)</td></tr><tr><td>Septos de borracha (ID x OD 7,9 mm x 14 mm), branco</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>Septos para preparação de solventes de trifosforilação e TBAP (seção 2)</td></tr><tr><td>Ribozima auto-replicante E</td><td>preparada em casa14</td><td>5&prime;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&prime;</td><td>Para reações de ribozima auto-replicadora (secção 6)</td></tr><tr><td>Substrato auto-replicador A</td><td>preparado em casa14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime;-OH</td><td>Para reações de ribozima auto-replicante (seção 6)</td></tr><tr><td>Substrato auto-replicador B, transcrito</td><td>preparado em casa14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>Para reações de ribozima auto-replicadora (secção 6)</td></tr><tr><td>Pequenas Armadilhas de Secagem, 4 &Aring; peneiras moleculares</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>Armadilhas de secagem para sintetizador de DNA/RNA fosforamiditos e reagentes de trifosforilação (seções 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>Cloreto de Sódio (NaCl), sólido</td><td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>Sal para uso em vários tampões (seções 5- ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Hidróxido de Sódio (NaOH), sólido</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>Sal para uso em vários tampões (seções 5- ndash; 7)</td></tr><tr><td>Software de ajuste de dados estatísticos</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Para ajustar dados de PAGE analítico a modelos cinéticos (seção 6)</td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos revestidos com estreptavidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>Para capturar RNA marcado com biotina em reações de ribozima quiral cruzada (seção 7)</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>Para tampão de carregamento de ureia PAGE (seção 5)</td></tr><tr><td>TBE buffer de corrida, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ62788K3</td><td>Para PÁGINA (seções 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Fluoreto de tetrabutilamônio, solução de 1,0 M em Tetrahidrofurano</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>Para remover grupos protetores de 2&prime;-silil (seção 5)</td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610801</td><td>Para polimerizar acrilamida para PAGE (seções 5-ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Tributilamina</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>Reagente de trifosforilação (seção 2)</td></tr> <tr><td>Pirofosfato de tributilamônio (TBAP)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>Reagente de trifosforilação (seção 2)</td></tr> <tr><td>Base Tris</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>Agente tampão para uso em vários tampões (seções 5- 7)</td></tr> <tr><td>Detergente de polissorbato TWEEN20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>Detergente neutro para uso com esferas magnéticas (Seção 7)</td></tr> <tr><td>Ureia</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>Para PAGE e buffer de carregamento de gel (seções 5- 7)</td></tr> <tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>Para medir concentrações de oligonucleotídeos (seção 5)</td></tr> <tr><td>Centrífuga a vácuo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 Concentrador de vácuo</td><td>para remover AMA e THF (seção 5)</td></tr> <tr><td>Xileno cianol</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610423</td><td>Para tampão de carregamento de uréia PAGE (seção 5)</td></tr></tbody></table>

triphosforilação química de oligonucleotídeos

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

O 5′-triphosfato é uma modificação essencial do ácido nucleico encontrada ao longo de toda a vida e cada vez mais utilizada como modificação funcional de oligonucleotídeos em biotecnologia e biologia sintética. Oligonucleotídeos 5'-triphosfatos foram historicamente preparados in vitro por métodos enzimáticos. No entanto, esses métodos são limitados a oligonucleotídeos naturais de RNA, têm fortes preferências de sequência e tendem a produzir produtos heterogêneos. Novos métodos de triphosforilação química complementam tanto o custo reduzido da síntese automatizada de oligonucleotídeos pela química fosforamidita quanto a variedade diversificada de modificações de nucleotídeos agora disponíveis. Assim, a síntese de triphosfatos oligonucleotídeos de sequência e comprimento arbitrários, e opcionalmente contendo várias modificações não naturais, agora é acessível.
Este artigo apresenta os métodos e técnicas apropriados para triphosforilação química de oligonucleotídeos utilizando fosforcloroide salicílico e pirosfato. Este método utiliza reagentes disponíveis comercialmente, é compatível com a maioria dos oligonucleotídeos preparados por métodos de síntese de fase sólida padrão, e pode ser concluído em 2 h após a síntese de oligonucleotídeos, antes da desproteção e purificação. Dois usos de oligonucleotídeos quimicamente triptosfoilados como substratos para enzimas RNA catalíticas são demonstrados, incluindo a síntese de uma versão de imagem espelhada da ribozyme cabeça-de-martelo de triptosfatos L-RNA não biológicos.

Os oligonucleotídeos devem ser sintetizados utilizando protocolos padrão apropriados aos fosforamiditos e sintetizadores automatizados de DNA/RNA, deixando o produto oligonucleotídeo salvo do suporte sólido na coluna de síntese plástica original, com o grupo dimethoxytrityl terminal de 50 terminais removido para produzir o 50-hidroxil livre (seção 1). Todos os oligonucleotídeos utilizados nesta demonstração foram preparados utilizando resina de vidro poroso controlado Å (CPG) como suporte sólido e conduzida na escala de 0,2 ou 1 μmole. Exemplos representativos de colunas sintetizadoras, resinas, reagentes e fosforamiditos são fornecidos na Tabela de Materiais. Para reações em maior escala, os volumes e tempos utilizados nas etapas subsequentes podem precisar ser ajustados.
A reação de triphosforilação é conduzida na coluna em uma câmara de reação personalizada (Figura 2, seção 3) utilizando componentes padrão e comercialmente disponíveis listados na Tabela de Materiais e segue o esquema ilustrado na Figura 1 (seção 4)28. É essencial que as condições sejam mantidas estritamente anidra durante a triphosforilação, e que todos os solventes e reagentes sejam preparados sobre peneiras moleculares com antecedência e permitidos secar totalmente antes do uso (seção 2). A triphosforilação normalmente leva 2h para ocorrer e, posteriormente, a coluna lavada e seca pode ser tratada de acordo com os procedimentos padrão de desproteção e purificação do oligonucleotídeo (seção 5).
Após a desproteção, os triphosfatos de oligonucleotídeos são purificados pela desnaturação da eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE), mostrando uma única banda de produto principal por retro-shadowing UV que pode ser extirpada e eluida do gel. O produto triphosfato de 5′triphosfato é prontamente separado de produtos laterais de reação para oligonucleotídeos curtos, como mostrado para trinucleotídeos de DNA 50-triphosfatos, pppAAAa e pppCCC, e trinucleotídeo L-RNA 50-triphosphate pppGAA na Figura 3A,B. Ambos os produtos de 5'-hidroxil e 5'triphosfato para aparadores de DNA AAA e CCC foram extirpados e identificados por espectrometria de massa e correspondentemente rotulados na Figura 3A. Bandas adicionais, como visíveis para o aparador de DNA AAA, geralmente não contêm material suficiente para recuperar e identificar. A presença dessas bandas, no entanto, correlaciona-se com massas adicionais de produtos nos produtos de reação não purificados (Figura 3C), tipicamente representando 5'-difosfato, monofosfato e produtos laterais h-fosfosfonato, como discutido abaixo.
Após a purificação da PÁGINA, os oligonucleotídeos maiores podem ser elucidos usando o método de esmagamento e imersão42 e a precipitação subsequente do etanol. No entanto, oligonucleotídeos menores que 15 nt não podem ser precipitados de forma eficiente e, portanto, requerem um procedimento modificado para eluição de gel (etapa 5.11.3). A coluna de exclusão de tamanho descartável listada na Tabela de Materiais é classificada apenas para uso com oligonucleotídeos maiores que 10 nt. No entanto, descobrimos que os oligonucleotídeos tão curtos quanto os aparadores podem ser efetivamente desselados usando o protocolo recomendado pelo fabricante. No entanto, recomenda-se ao dessalucionar oligonucleotídeos curtos (como nas etapas 5.6 e 5.11.3) que a coluna elua seja coletada em frações, e frações de produto sejam identificadas por absortância a 260 nm usando um espectógrafo UV-Vis. Uma coluna de exclusão de tamanho otimizada para oligonucleotídeos mais curtos é fornecida na Tabela de Materiais como uma escolha alternativa. O rendimento final da síntese de oligonucleotídeos da escala 1 μmole após a purificação é de 50-300 nmol.
A triphosforilação pode ser confirmada por espectrometria de massa, onde o produto triphosforilado tem uma massa +239,94 Da maior que o oligonucleotídeo 5'-hidroxil, embora a presença de materiais correspondentes ao 5'-di e monofosfato (+159,96 e +79,98 Da, respectivamente) sejam frequentemente observadas. Um produto lateral de 5'-H-fosfosfonato com massa +63,98 Da da massa 5'-OH também pode ser observado, e altos níveis deste produto indicam que as condições durante a triptosforilação não foram suficientemente anidra. Antes da purificação, os oligonucleotídeos desprotegidos normalmente mostrarão todos esses produtos (Figura 3C), enquanto o material purificado mostrará um pico correspondente ao produto triphosfato de 5′, juntamente com 5'-di- e monofosfatos (Figura 3D,E).
A espectrometria de massa por si só normalmente não dará uma medida rigorosa de pureza de 5′triphosfato devido a taxas diferenciais de ionização e fragmentação do triphosfato durante a ionização. Para medir a pureza final do produto, recomenda-se cromatografia líquida em fase reversa e tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS), particularmente para oligonucleotídeos mais longos. A análise do D-RNA 50-triphosphates pppACGAGG e pppGAGACCGCAACUUA por RP-LC/ESI-MS (Figura 4A,B, respectivamente) mostram pureza típica do produto final, contendo 20% de 50-difosfato, pois essas duas espécies são difíceis de separar quando presentes em oligonucleotídeos mais longos.
Oligonucleotídeos sintéticos de 5'triphosphate normalmente funcionam tão bem quanto os materiais preparados enzimáticamente em estudos bioquímicos. Na seção 6, como exemplo, 5'-triphosfato 14 nt substratos de RNA preparados sinteticamente ou por transcrição in vitro foram comparados em uma reação de auto-replicação catalisadaRNA 14,15,43,44,45. Ribozyme E catalisa a junção dos substratos A e B para produzir uma nova cópia de E em uma reação autocatalítica capaz de crescimento exponencial (Figura 5A). E e 32componentes A rotulados em P foram preparados por transcrição in vitro, e o substrato B triphosforilado foi preparado sinteticamente, como descrito acima, ou por transcrição in vitro 14. O progresso da reação de auto-replicação foi monitorado pela coleta de amostras periódicas que foram analisadas por PAGE desnaturando e quantificadas através de um scanner de gel fluorescente/fosforescente. Os dados resultantes, adequados a uma função de crescimento logístico, revelaram que o substrato B transcrito ou sintético suporta crescimento exponencial, mas o B sintético dá uma quantidade ligeiramente maior de produto (Figura 5B). Este resultado pode refletir heterogeneidade composicional no final de 5′end do RNA preparado por transcrição in vitro 23,24.
A triptosforilação química também permite a síntese de triptosfatos de oligonucleotídeos que não podem ser preparados biologicamente, seja in vitro ou em células. Na seção 7, triptosfatos de oligonucleotídeos não biológicos compostos de L-RNA, o enantiomer do D-RNA natural, preparados como nas seções 1-5, foram usados como substratos para o D-RNA "cross-quiral" polymerase ribozyme 27.3t (Figura 6A), que catalisa a polimerização dirigida por modelo de um produto L-RNA mais longo de curto L-RNA oligootróo-5'triphosphates de forma sequencial.. Como exemplo, a ribozyme pode sintetizar uma versão L-RNA do motivo de auto-decote hammerhead (Figura 6B)18. Triptosfatos de trinucleotídeos L-RNA purificados foram combinados com um primer L-RNA e modelo L-RNA (Figura 6C) e reagiram com a ligase transversal. As amostras ao longo da reação foram analisadas pela PAGE e imagens usando um scanner de gel fluorescente/fosforescente para demonstrar a síntese de uma versão L-RNA da ribozyme hammerhead codificada pelo modelo (Figura 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> Figura 3: Purificação de trinucleotídeos 50-triphosfatos. (A) Análise de PÁGINA (visualizada por UV-back-shadowing) de triphosforilação de trinucleotídeos de DNA tri-desoxyadenosine (AAA, azul) e tri-desoxicytidina (CCC, vermelho), intencionalmente sobrecarregado para visualizar pequenos produtos laterais. Tanto o produto de 50 triphosphates (ppp) quanto o material inicial de 50-hidroxyl (OH) foram extirpados e identificados pelo MALDI-MS. (B) Página preparatória de triphosforilação do L-RNA trinucleotídeo GAA, com a maior banda de produto extirpada e identificada como o 50-triphosphate (ppp) pelo ESI-MS. (C) MALDI-MS de produtos de reação bruta após a desproteção e (D) produtos purificados de (A). 50-triphosphate (ppp; pppAAA esperava 1.119 Da, observou 1.118 Da; pppCCC esperava 1.047 Da, observado 1.046); 50-difosfato (pp), 50-monofosfato (p), 50-hidroxila (OH) e 50-H-fosfosfoato (Hp) são rotulados. (E) Espectro de massa desconvolucido da injeção direta ESI-MS de produto isolado de 50 triphosfato de (B), com picos identificados rotulados (esperado 1.181,6 Da, observado 1.181,0 Da). 50-diphosphate (pp) também são observados produtos, assim como picos de íons de sódio para os produtos tri-e di-fosfato (+22 Da). Picos de contaminantes comuns são rotulados com um asterisco. Para facilitar a comparação, os espectros de massa foram normalizados à maior intensidade medida em cada espectro e são relatados como uma porcentagem em relação a esse valor. Abreviaturas: PAGE = eletroforese de gel de poliacrilamida; MALDI-MS = desorção/ionização a laser assistida por matriz; ESI-MS = espectrometria de massa de ionização eletrospray. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> Figura 4: RP-LC analítico de 6 nt e 14 nt D-RNA oligonucleotídeos triphosfatos. (A) 50-pppACGAGG-30 e (B) 50-pppGAGACCGCAACUUA-30. O Tandem ESI-MS identificou o pico principal de ambos (~70%) como o 50-triphosphate (ppp), com menores quantidades de 50-diphosphate (pp). Abreviaturas: RP-LC = cromatografia líquida em fase inversa; nt = nucleotídeos; ESI-MS = espectrometria de massa de ionização eletrospray. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> Figura 5: Comparação de substratos de oligonucleotídeos 50 triphosfatos preparados por síntese química ou transcrição in vitro. (A) A ribozyme auto-replicante E liga o RNA A e o RNA B. (B) auto-replicante usando 10 μM A e 10 μM B, sintético (círculos abertos) ou em transcrição (círculos preenchidos). (B) Os dados foram adequados à equação de crescimento logístico: [E] = a / (1 + b e-ct), onde a é o rendimento final, b é o grau de sigmoidicity, e c é a taxa de crescimento exponencial. As taxas de crescimento para as duas reações foram idênticas, em 1,14 h-1, enquanto a extensão final foi 10% maior para reações com B sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> Figura 6: Polimerização L-RNA cross-quiral com uma ribozyme. (A) O D-RNA 27.3t polymerase ribozyme, que catalisa a ligadura dependente de modelo de L-RNA. (B) O produto L-RNA sintetizado por 27,3t faz parte de um motivo endonuclease de martelo. (C) Polimerização L-RNA catalisada por 27,3t usando um modelo L-RNA biotinilado (marrom), um primer L-RNA (magenta) e quatro trinucleotídeos L-RNA (ciano), preparados sinteticamente. (D) Análise de PÁGINA dos produtos de extensão de (B) a 4h e 24 h, mostrando cada incorporação de trinucleotídeos até o produto de comprimento completo (ponto preto). O primer L-RNA não redigido está incluído como marcador de referência. Abreviaturas: PAGE = eletroforese de gel de poliacrilamida; M = marcador de referência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Oligonucleotídeos 5'-triphosfatos são componentes onipresentes em vias biológicas essenciais e têm visto o uso crescente em aplicações de biotecnologia. Aqui, descrevemos técnicas para a síntese de rotina e purificação de oligonucleotídeos 5'-triphosphates, a partir de oligonucleotídeos preparados por técnicas de síntese automatizada padrão.

Triphosforilação química de Oligonucleotídeos

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Triphosphorylation é uma onipresente modificação de 1,5'00 de RNA em biologia e é cada vez mais usada em aplicações de biotecnologia. O protocolo aqui descrito permite a triphosforilação de qualquer oligonucleotídeo preparado pela síntese automatizada padrão. A triphosforilação química trabalha em oligonucleotídeos contendo RNA, DNA ou ácido nucleico não natural.Aqui, o L-RNA canhoto triphosforilado, o enantiomer do D-RNA biológico, é sintetizado purificado e usado em uma reação ribossa. A triphosforilação é realizada após síntese automatizada de oligonucleotídeos e antes da desproteção. Esses passos não são mostrados aqui, mas os pesquisadores devem estar familiarizados com métodos padrão para ambos.Para começar, certifique-se de que o espaço de trabalho para a fosforilação tenha um coletor de gás com pelo menos duas linhas e o borbulhador conectado a uma fonte de argônio seco com pressão ajustável, pois a reação de triphosforilação deve ser realizada sob argônio. Em seguida, conecte uma seringa de plástico mililitro nas linhas para facilitar a conexão com o aparelho de reação. Em seguida, colete os equipamentos, incluindo uma seringa de plástico mililitro, uma torneira de polipropileno de três vias, agulhas não decorante, tubos de polipropileno de 1,5 mililitro, uma pequena espátula metálica, e armazene-os em um recipiente selado ou desiccador com um dissoceunte à temperatura ambiente por pelo menos um dia antes do uso.Sob pressão de argônio, retire 30 mililitros de anidro 1, 4-dioxano de uma garrafa selada. Transfira para uma garrafa de vidro seca de 30 mililitros e adicione uma armadilha de secagem. Lacre com septa de borracha e armazene em um desiccador com dessicante.Da mesma forma, prepare 30 mililitros de N, N-dimetilformamida, acetonitrilo, e a mistura de três partes de dioxano e uma parte piridina em volume. Prepare a solução TBAP misturando pirofosfato de tributylammonium sólido com dimetilformamida e tributilamina em uma garrafa de vidro de 30 mililitros como descrito no manuscrito. Adicione três armadilhas de desenho.Sele a garrafa com um septo de borracha sob argônio e bolha com argônio por 30 minutos. Depois de preparar um oligonucleotídeo com um hidroxilo gratuito de 5'hydroxyl em uma coluna de síntese usando um sintetizador automatizado de DNA/RNA. Prepare a câmara removendo o êmbolo de uma seringa seca de um mililitro.Corte a parte superior da seringa usando uma tesoura ou uma lâmina de barbear e conecte a seringa à coluna de síntese. Ao topo da seringa, conecte a torneira de três vias e conecte a entrada lateral da torneira à fonte seca de argônio com o borbulhante para que a entrada superior da torneira aja como a porta de injeção de reagente. Fixar este operador em um suporte com grampos e selar todas as juntas a montante com filme de selagem de cera.Em seguida, ajuste a torneira para que a porta de injeção esteja fechada e o aparelho esteja aberto à fonte de argônio. Feche o borbulhante e deixe argônio em baixa pressão para fluir através da câmara de ação por cinco minutos. Após reabrir o borbulhante, conecte uma seringa ao fundo da coluna de síntese, que será a seringa de resíduos.Em seguida, puxe argônio através da coluna repetidamente usando a seringa de resíduos e, em seguida, recoloque a seringa com o êmbolo empurrado totalmente para dentro. Para adicionar um reagente ou solvente, conecte uma agulha à fonte de argônio seco e insira-a no septo de garrafa de reagente ou solvente, tomando cuidado para não imergir a agulha no conteúdo da garrafa. Em seguida, monte uma seringa seca com uma agulha e insira-a no septo de garrafa de reagente ou solvente sem imergi-la no conteúdo da garrafa.Depois, encha a seringa com argônio, retire a agulha do septo e expulse o argônio. Depois de encher a seringa com argônio e expelir mais uma vez, encha a seringa com o volume necessário de solvente ou reagente sob pressão de argônio. Ajuste a torneira para que a fonte de argônio esteja fechada e a porta de injeção esteja aberta.Uma vez que a parada no aparelho seja ajustada rapidamente, remova a seringa e a agulha preenchidas da garrafa de origem, limpe qualquer solvente preso ao lado ou ponta da agulha e, em seguida, insira a agulha na porta de injeção. Após expulsar um reagente na anti-câmara dos operadores, remova a agulha e feche a porta de injeção enquanto reabri o aparelho à fonte de argônio. Retire suavemente o líquido da anti-câmara até a coluna de síntese usando a seringa de resíduos para que todo o líquido seja agora mantido na seringa de resíduos.Agora, empurre lentamente a solução de volta para a coluna de síntese, garantindo que não haja bolhas de gás na coluna. Para misturar ou agitar, puxe suavemente a solução para cima e para baixo sobre a coluna com a seringa de resíduos. Para remover um reagente ou solvente da coluna, puxe lentamente a solução para dentro da seringa de resíduos.Depois que a maior parte da solução passar para a seringa de resíduos, puxe argônio para lavar o solvente restante da coluna. Em seguida, remova o filme de selagem de cera em torno da junta de seringa de resíduos. Em seguida, remova a seringa e descarte a solução de resíduos.Depois, substitua a seringa de resíduos por uma nova seringa seca e resseque a articulação. Depois de montar o aparelho de triphosforilação, comece a reação de triphosforilação adicionando 200 microliters de dioxano piridina à anti-câmara, como demonstrado anteriormente. Mas não puxe a amostra para a coluna de síntese ainda.Depois de dissolver SalPCl em dioxano como descrito no manuscrito, adicione-o à anti-câmara e carregado na coluna de síntese usando uma seringa seca. Em seguida, deixe-o reagir por 15 minutos e, em seguida, remova e descarte a solução SalPCl usando uma seringa de resíduos como demonstrado anteriormente. Imediatamente após a remoção da solução SalPCl, adicione 250 microliters de solução TBAP à anti-câmara e carregado na coluna de síntese.Que reaja 20 minutos com agitação e descarte como descrito anteriormente. Depois, lavei a coluna com 0,5 mililitros de N, N-dimetilformamida, depois 0,5 mililitros de acetonitrilo, removendo o solvente após cada adição. Depois de adicionar solução oxidante, removê-la e lavar a coluna com acetonitrila novamente usando o mesmo procedimento mostrado, desmonte o aparelho e lave a coluna com cinco mililitros de acetonitrila.Depois, seque a coluna. Cortar o oligonucleotídeo triphosforilado do suporte sólido e desprotegir usando protocolos padrão como descrito no manuscrito. Em seguida, dissolveu o oligonucleotídeo desprotegido seco no tampão de carga da ureia, aquecido a 80 graus Celsius, depois carregou em um gel de poliacrilamida e correr por uma a duas horas a 25 a 35 watts.No final da eletroforese do gel, depois de remover a placa de gel, desmonte-a e enrole o gel em filme de polivinylchloreto. Em seguida, identifique as bandas do produto com sombra traseira com 254 nanômetros de luz UV e extirpa a banda principal do produto usando uma lâmina de barbear. Esmague o gel excisado extrudando-o através de uma seringa plástica ou mecanicamente.Para oligonucleotídeos menores que 15 nucleotídeos, elute em três vezes o volume de gel de água livre nuclease por pelo menos 12 horas com agitação ou agitação. Em seguida, remova as peças de gel sólido passando a solução através de uma seringa equipada com um filtro de 0,2 micrômetro e concentre-se por liofilização. Após a concentração, remova sais residuais e saudações usando uma coluna de exclusão de tamanho descartável e concentre-se por liofilização, como demonstrado anteriormente.Depois de preparar 10 microlitrais de uma solução RNA contendo modelo de ribozyme de polimerase e modelo de primer L-RNA e trinucleotídeos triptosfatos como descrito no manuscrito, anneal-lo aquecendo-o a 90 graus Celsius por um minuto e esfriando-o a 23 graus Celsius a 0,2 graus Celsius por segundo em um termorCrcicr PCR. Depois de incubar a solução de RNA a 17 graus Celsius, pare a reação adicionando 10 microlitadores de duas vezes a concentração do buffer inicial à medida que a reação prossegue, pegue 10 alíquotas de microliter e sacie com cinco microlitradores de 0,5 molar EDTA no pH 8 e processe cada amostra para isolar RNA como descrito no manuscrito. Dissolva o RNA precipitado em 10 microliters de amortecedor formalizado de carregamento de gel e prepare o primer end não redigido como descrito no texto.Uma vez que as amostras são preparadas, aqueça a 80 graus Celsius. Carregue cinco microliters da amostra em cada poço e execute o gel a 40 watts por aproximadamente 40 minutos. Depois de remover a placa de gel do suporte, escaneie usando um scanner de gel fluorescente ou fosforescente para visualizar produtos de extensão L-RNA quiral.Após a purificação do gel, a sombra traseira UV revela a presença de 5'triphosphate como um único produto importante, como mostrado para aAA e CCC dna trimers e gaa L-rna trimer. O produto lateral de 5'hidroxyl é frequentemente visível como uma banda migratória mais lenta, que foi isolada e identificada pela espectrometria de massa para aparadores de DNA. Bandas adicionais durante a purificação de gel se correlacionam com produtos laterais de 5'diphosphate, monofosfato e h-fosfosfonato na espectrometria de massa dos produtos de reação não purificados.Os produtos triphosfato de 5'triphosfato apresentam um pico de massa primária correspondente ao triphosfato de 5'triphosfato, juntamente com massas de 5'di e monofosfato. Trinucleotídeos L-RNA relacionados quimicamente triptosfato foram usados com um primer L-RNA e modelo L-RNA em uma reação de polimerização de RNA analisada pela PAGE e imaged usando um scanner de gel fluorescente. O produto estendido marcado por círculos pretos demonstrou a síntese de uma versão L-RNA da enzima de ribozyme hammerhead codificada pelo modelo.A exposição à água durante a triphosforilação reduzirá o rendimento. Siga os passos para preparar reagentes secos e montar cuidadosamente o aparelho de reação. Mova fluidos através do aparelho lentamente para evitar quebrar as vedações.A triptosforilação química é essencial para preparar triphosfatos de oligonucleotídeos não biológicos, incluindo RNA canhoto. Isso permitiu a síntese de ribozyme quiral cruzado das versões de imagem espelhada das moléculas de RNA encontradas na biologia.

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