Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Um protocolo eficiente para manter e amplificar o nematode entomopatômico é essencial para entender a base molecular da patogenicidade nematode e da imunidade anti-nematóide. Este protocolo nos permite produzir um alto número de bacteriophora de heterorhabdite simbiótica e axenica e IJs steinernema carpocapsae usando hospedeiros de insetos, Galleria mellonella. Comece cobrindo a placa de Petri com um pedaço de papel filtro e adicione aproximadamente 10 a 15 larvas galleria mellonella.

Usando uma pipeta, dispense dois mililitros de água contendo cerca de 25 a 50 jovens infecciosos por 10 microliters de suspensão nos vermes de cera. E guarde a placa de Petri em um armário em temperatura ambiente. Dependendo da umidade do papel filtro, adicione um a dois mililitros de água a cada dois dias.

Vermes de cera infectados com jovens infecciosos geralmente morrem dentro de 48 horas. Prepare as armadilhas de água de White aproximadamente 10 dias após os vermes de cera serem infectados com os jovens infecciosos. Transfira cuidadosamente os insetos mortos para a parte não coçada do papel do filtro.

Use água da torneira para encher a placa de Petri inferior e coloque uma tampa de um tubo de 15 mililitros como espaçador para ventilação. Use água da torneira em vez de água desmineralizada ou deionizada para evitar a agregação de nematoides, e garantir que o nível de água na armadilha de água atinja aproximadamente metade da altura da placa de Petri. Quando a água na pequena placa de Petri ficar nublada devido a nematoides, use uma pipeta para mover a nova geração de jovens infecciosos em um frasco de cultura celular T25 ou T75.

Posteriormente, adicione água da torneira até 40% de volume ou até que a densidade apropriada seja atingida. E armazene o frasco de cultura celular horizontalmente para evitar o congestionamento de nematoides. Repita a transferência de jovens infecciosos em frascos de cultura celular e a adição de água até que os jovens infecciosos parem de emergir das carcaças de insetos em aproximadamente três a cinco dias.

Usando um laço de inoculação, raspe vários flocos de uma cultura congelada de Photorhabdus temperata Ret16 em uma placa MacConkey e listras para colônias únicas. Incubar a placa por dois a três dias a 28 graus Celsius. Após a incubação, inocular 10 mililitros de caldo LB com uma colônia no ágar MacConkey em um tubo de 50 mililitros e incubar a cultura durante a noite a 28 graus Celsius em uma incubadora de agitação.

Após a incubação, transfira 100 microliters de cultura noturna de um tubo de 50 mililitros para um novo tubo de microcentrífuga, depois lave 100 a cultura durante a noite com 900 microliters de PBS de força única por centrifusão, em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro, a 17,900 vezes g. Decantar o supernatante. Em seguida, diluir a cultura 10 vezes em pbs de força única e deixar o tubo no gelo.

Agora, mergulhe os vermes de cera em uma solução de 70% de etanol. Depois de secar os insetos com uma toalha de papel, coloque-os em um tubo de 50 mililitros. Coloque o tubo no gelo por 20 minutos para imobilizar os vermes de cera.

Use papel filtro para cobrir as metades superior e inferior de uma placa de Petri. Use a tampa da placa de Petri coberta com papel filtro como suporte básico para injeção. Úmido no papel filtro da placa de Petri inferior e transfira-o no gelo para ajudar os vermes de cera injetados a se recuperarem.

Pipeta 50 microliters de bactérias geladas em um pedaço de Parafilm, em seguida, preparar uma seringa de agulha de refinaria calibre 22 e pressionar o êmbolo suavemente para remover o ar na ponta da agulha. Mantendo um verme de cera perto da extremidade posterior sob o estereoscópio. Injete cultura bacteriana no lado dorsal do tórax.

Preferencialmente na junção entre dois segmentos logo abaixo da cutícula paralela ao verme de cera para minimizar os danos internos e prestar atenção em como o corpo larval começa a se abater. Em seguida, transfira os insetos injetados para a placa de recuperação de Petri. E uma vez que todos os insetos são injetados e colocados na placa de recuperação, coloque a placa de Petri no escuro.

Os vermes de cera sucumbem dois dias após a injeção e aparecem vermelhos após aproximadamente três a quatro dias. No entanto, insetos de cor marrom indicam infecção bacteriana mal sucedida. Aos sete dias após a infecção, transfira os insetos com a cor vermelha de tijolo característico para uma placa de Petri, e repita a produção de menores simbióticos infecciosos.

Para iniciar a esterilização superficial, colete simbiótico suficiente, Heterorhabditis bacteriophora e juvenil infeccioso axenic candidato por centrifugação. Para fazer uma pelota em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, adicione 500 microliters de 5% de alvejante à pelota em cada tubo de microcentrifuuagem e inverta o tubo. Depois de incubar por 10 minutos, centrífuga a 17.900 vezes g por um minuto e remover o supernatante.

Em seguida, lave a pelota com um mililitro de água estéril. Centrifuá-lo, remover o supernaspeito e repetir este procedimento mais quatro vezes. O gráfico mostra os resultados da avaliação do estado da Heterorhabditis bacteriophora nematodes que passaram pela axenização.

Heterorhabditis bacteriophora da cultura de estoque carregava células simbióticas fotorhabdus luminescens. No entanto, nematoides desprovidos de suas bactérias fotorhabdus luminescens associadas eram axenic. Para manter a reprodutibilidade de seu experimento, sempre se afaste recentemente da cultura do estoque bacteriano de uma colônia fresca e retire a cultura da noite para o dia antes de chegar à face estacionária.

Use apenas o verme de cera Galleria vermelho para a armadilha de água de White e descarte o resto. Após esse procedimento, os nematoides podem ser usados para investigar a interação com o sistema imunológico dos insetos. Esta técnica abre caminho para o pesquisador explorar a base molecular do parasitismo nematode e hospedar imunidade anti-nematóide.